Method Article

Cryptococcus neoformans 에서 캡슐 직경의 크기 문제: 측정

DOI:

10.3791/57171

⸱

February 27th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 에 기본 독성 요소 이며 크기 상관 스트레인 독성. 캡슐 직경 측정 phenotypic 테스트 및 치료 효능을 측정 하기 위해 사용 됩니다. 여기 캡슐 유도의 표준 방법을 제시 하 고 얼룩이 지 고 직경 측정의 두 가지 방법 비교.

Abstract

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다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 의 기본 독성 요소 이며 가장 일반적으로이 병원 성 효 모의 측면을 공부. 캡슐 크기 긴장 사이 넓게 변화할 수 있다, 스트레스 또는 낮은 영양 조건에 도입 하는 때 급속 하 게 성장 수 있으며 변형 독성과 긍정적으로 상관 되었다. 이러한 이유로, 캡슐의 크기는 C. neoformans 연구자에 게 큰 관심입니다. C. neoformans 캡슐의 성장 phenotypic 테스트 하는 동안 긴장의 효 모 또는 크기 차이에 다른 처리의 효과 이해할 수 있도록 유도 된다. 여기 우리 캡슐 유도 및 비교 두 허용 방법 얼룩이 지 고 캡슐 직경 측정의 표준 방법 중 하나를 설명: (i) 인도 잉크, 부정적인 얼룩, 함께 기존의 가벼운 현미경 검사 법 및 (ii) 공동으로 얼룩에 사용 세포 벽 및 캡슐 뒤에 confocal 현미경 검사 법의 형광 페인트 마지막으로, 우리는 어떻게 인도 잉크 얼룩이 진 샘플에서 캡슐 직경의 측정 수 보여 전산 이미지 분석을 사용 하 여 자동화.

Introduction

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매년 마다 분기 백만 사람들에 영향을 미치는 매년 180000 이상의 죽음의 결과로, Cryptococcus neoformans 이며, 세포내 병원 성 효 모 cryptococcosis1,2, 의 원인이 되는 대리인 3. 어려운 히트 하지 않은 항 레트로 바이러스 치료에 대 한 준비가 액세스 그들을 심하게 병4,,56에 감염 되기 쉬운 만드는 가난한 나라에서 HIV 양성 환자는. CDC에서 데이터는 사하라 사막 이남의 아프리카에서C. neoformans 죽이고 결핵 보다 더 많은 사람들이 매년 매달 기록1어떤 Ebola 발발 보다 더 나타냅니다. 노출의 가장 일반적인 경로 환경7평범 desiccated 포자를 흡입에서 발생 합니다. 입력 되 면 폐, 감염 된 개인에서 C. neoformans 의 성공에 기여 하는 여러 가지 독성 ....

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Protocol

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참고: C. neoformans Biosafety 수준 2 (BSL-2) 병원 체 이며 연구자 작업 적절 한 예방 조치를 취해야 합니다. 상세한 절차 어떻게에 안전 하 게 BSL-2 병원 체와 함께 작업에서 찾을 수 있습니다 중앙 질병 관리국 (CDC)에 웹사이트, 하지만 그것은 C. neoformans 의 접촉으로 오는 모든 사람 제대로 처리에서 훈련 되어야 한다 병원 성 대리인 및 적절 한 개인 보호 장비 (PPE), 일반적으로 라텍스 또는 니트 릴 장갑을 항상 착용 해야 합니다. 또한, 샘플 및 어떤 유출2810% 표 백제 솔루션 사용 하 여 즉시 정리의 aerosolization를 방지 하기 위해 원심 분리기에로 터를 봉인 한다.

1. 캡슐 유도

참고: 모든 단계 다른 설명이 없는 한 상 온에서 수행 되어야 합니다.

  1. C. neoformans 효 모 펩 포도 당 (YPD) 국물 (pH 6.5 ± 0.2)에서 문화 그리고 로그 단계 (약 18-36 h) 때까지 떨고와 37 ° C에서 품 어.
  2. 870 x g 21 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 ....

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Results

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캡슐 유도, 세포 얼룩, 이미징, 및 측정 기법을 설명 하기 위해 사용 하는의 3 개의 긴장 C. neoformans: 일반적인, 잘 특징이 실험실 스트레인, H99S30및 2 개의 임상으로 고립 된 긴장의 이전 알 수 없는 캡슐 직경, B18, b 5231.

캡슐 유도, 얼룩, 및 인도 잉크를 사용 하 여 이미지 수집 워크플로 그림 1A에 표시 됩니다. 모든 3 개의 긴장에서 촬영 한 이미지는 사전 및 사후 유도 그림 1B 에서 표시 됩니다. 연구원은 캡슐 유도 하지 않은 동일한 문화에서 그 캡슐 유도 받은 셀을 비교 하 여 성공 했는지 알 수 있습니다. .......

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Discussion

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수십 년 동안, 캡슐 mycologists와 임상 C. neoformans cryptococcosis 병원 체에 대 한 주요 독성 요인으로 그것의 역할 때문에 관심된에 대 한 연구의 주요 초점 되었습니다. 에 현미경 검사 법을 사용 하 여 긴장 캡슐 크기 차이 측정 하 고 다른 성장 아래 조건 병원 체 및 다양 한 자극 (즉, 서로 다른 환경 조건에 그것의 응답에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 잠재적인 약물 치료, 등) 여기, 우리 C. neoformans에서 캡슐의 성장을 유도 하는 방법을 설명 했습니다과 비해 2 다른 얼룩 프로토콜을 캡슐. 마지막으로, 우리는 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 인도 잉크 묻은 셀, 수동 측정 방법에 비해 결과 생산의 이미지에서 캡슐 직경의 측정을 자동화 하는 방법을 보였다.

우리의 실험에서 우리는 두 임상 변종, B18, b 52, H99S, 알려진된 캡슐 크기.......

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Disclosures

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저자, Hoyin 라는 DRVision Aivia 자동된 이미지 분석 소프트웨어를 게시 하는 제품 관리자입니다.

Acknowledgements

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우리 감사 생물학과 분자 생물 과학 (MOBI) 박사 중간 테네시 주립 대학 (MTSU)에이 연구에 대 한 자금 제공. 프로젝트 또한 MTSU 재단에 의해 D.E.N.에 게 수 여 특별 한 프로젝트 교부 금에 의해 부분적으로 투자 되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Capsule Induction
C. neoformans cells임상 실험실 균주 H99S는 Dr. John Perfect (Duke University)의 친절한 선물이었습니다. 임상 균주 B18 및 B52는 Greg Bisson 박사(펜실라니아 대학)의 친절한 선물이었습니다.
효모 펩톤 포도당 육수(YPD)Fisher ScientificDF0428-17-5
인산염 완충 식염수(PBS)이것은 표준 레시피(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2mM Kh2PO4O)
DMEM/고포도당, L-글루타민, 피루브산 나트륨 없음GE Life SciencesSH30022.01
6웰 플레이트FalconCL5335-5EA
쉐이킹 인큐베이터Thermo Scientific MaxQ6000
CO2 인큐베이터Fisher ScientificIsotemp
원심분리기Thermo ScientificLegend XTR
Staining
microcentrifugeThermo ScientificLegend Micro 21R
Indiaink Fisher Scientific14-910-56
Calcofluor whiteSigma-Aldrich18909-100ML-F
18B7 마우스 anti-GXM 항체가 Alexafluor 488Dr. Arturo Casadevall (존스 홉킨스 대학)로부터의 친절한 선물 
1% 소 혈청 알부민(BSA)이 함유된 PBSPBS는 1% BSA가 첨가되고 필터 멸균된 위에 나열된 것과 동일한 레시피(4행)입니다.
소 세럼 알부민시그마-알드리치A9418
슈퍼프로스트 현미경 슬라이드피셔 사이언티픽12-550-143
유리 커버슬립코닝2855-18#1.5 두께
투명 네일 폴리시 또는 기타 비독성 밀봉제
<강력>이미지 획득 
침수 오일Cargille 16484
잠수 오일 목표가 있는 광학현미경 ZeissZeiss Axio A1 플랜 - NEOFLUAR 100x 오일 이멀젼 NA 1.30 오브젝
광학 현미경 카메라ZeissZeiss Axiocam ErCD 카메라
오일 이멀젼 오브젝티브가 있는 컨포칼 현미경ZeissLSM 700 레이저 스캐닝 컨포칼은 Plan-Apochromat 63X NA 1.4 오일 이멀젼 DIC M27 목표가 장착되어 있습니다. 주의;
컨포칼 현미경 소프트웨어Zen 2009
컨포칼 현미경 카메라NikonNikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) 및 1.5x 배율 변환기. 
광시야 이미징 소프트웨어Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing softwarePhotoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurementAxiovision (Carl Zeiss)Automated
)를 위한 이미지 분석 소프트웨어 기술)
스프레드시트 소프트웨어Excel (Microsoft)
에 접합됨 티브 meesurement Aivia (DRVision

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev....

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Cryptococcus neoformansCapsule DiameterIndia Ink StainingFluorescent Dye StainingConfocal MicroscopyLight MicroscopyAutomated Image AnalysisCapsule InductionYeast Cell MeasurementZ Stack Imaging

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