방법 논문

Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

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DOI:

10.3791/57191

⸱

2018년 2월 6일

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 최소한의 침공과 라이브 쥐 간 2 광자 영상에 대 한 새로운 수술 프로토콜을 설립. 이 기술을 우리 lipopolysaccharide 유도 endotoxemia 동안 간의 상세한 구조를 확인 할 수 있습니다. 우리는이 방법을 간 백혈구 이동에 다양 한 시 약 처리의 효과 결정 하기 위해 활용 될 수 있습니다 예상.

초록

패 혈 증은 조직 기관 실패를 일으킬 수 있는 심각한 감염의 유형을 손상. 패 혈 증과 관련 된 사망률과 병 적 속도 매우 높은, 아니 직접 치료 이나 기관 관련 메커니즘을 실시간으로 자세히 검사 합니다. 간 독 소 및 인체에 감염을 관리 하는 핵심 기관 이다. 여기, 우리 면역 세포, 호 중구 등 간 capsular 세포 (LCMs)의 운동 성을 추적 endotoxemia의 유도 후 마우스 간 intravital 이미징 수행 목적입니다. 따라서, 우리는 최소 침 습 수술으로 간의 노출에 대 한 새로운 수술 방법 설계 되었습니다. 마우스 intraperitoneally lipopolysaccharide (LPS), 일반적인도로 주입 했다. 노출 및 LPS 처리 LysM-녹색 형광 단백질 (GFP)에 마우스 간, 우리는 그 neutrophil 발견 채용의 intravital 이미징에 대 한 우리의 새로운 외과 접근을 사용 하 여 마우스 간 그 인산 염 버퍼에 비해 증가 했다 염 분 처리 간입니다. LPS 치료 후, 호 중구 수 시간 크게 증가. 또한, 우리가 성공적으로 간 상주 대 식 세포 라는 LCMs 시각 CX3Cr1 GFP 마우스를 사용 하 여. 따라서, vivo에서면역 이동성 제어를 새로운 시 약의 효능을 조사, 운동 성 및 간에서 호 중구 및 LCMs의 형태 결정 수 기관 실패 및 조직 손상으로 인 한 치료 효과 확인 하 패 혈 증에 백혈구 활성화입니다.

서론

간은 포유류; 주요 대사 기관 그것은 에너지, 호르몬, 및 해독1에 대 한 컨트롤 타워 역할을 합니다. 그 중요성으로 인해 연구팀은 염증 동안에 변화를 명료 하 많은 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험을 실시 했습니다. Intravital 현미경 검사 법은 간2 에서 라이브 이미지를 캡처하는 데 사용 되었습니다. 실제로, 다양 한 간 이미징 방법 되었습니다 도입2,,34,,56. 그러나, 더 단순화 된 외과 접근을 개발 하 고 대상 기관 및 면역 세포의 안정화를 달성, 우리는 intravital 이미징에 대 한 그들의 노력을 최소화 하기 위해 연구원 안내 하는 간단한 프로토콜을 설계 되었습니다.

이 연구에서 우리는 안정적이 고 새로운 이미징 챔버 및 출혈 및 가능한 감염을 최소화 하기 위해 사용 될 수 있는 수술 기법 도입. 우리는 간 이상 2 시간에 대 한 온전 하 게 남아 확인 했다. 이 방법으로, 우리는 성공적으로 LCMs7 및 부패 시키는 조건 하에서 호 중구의 형태학 식별. 이 방법에 대 한 응답에서에 면역 세포의 급성 반응을 관찰 하 사용 될 수 있기 때문에이 방법은 수술 중 떨림과 예기치 않은 염증 등 물리적 및 생물학적 혼동 요인 최소화, 기대 시 약 같은 LPS.

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프로토콜

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 연 세 대학의과 대학교의 지침에 따라 실시 했다. LysM-녹색 형광 단백질 (GFP; gfp / +) 마우스8 및 CX3Cr1 GFP (gfp / +) 나이의 8 ~ 12 주에9 마우스 intravital 이미징 사용 되었다. 모든 수술 도구 압력가 마로 소독 하 고 70% 알코올로 소독 했다.

1. 맞춤형 마우스 간 이미징 지원 도구와 챔버

  1. 마우스 간 이미징 챔버 디자인
    1. 마우스 간 (그림 1) 이미징에 대 한 다음과 같은 크기의 방 만들기: 내부 챔버 (120 m m 길이 × 폭 160 m m × 30 m m 높이), 외부 챔버 (100 m m 길이 × 폭 100 m m × 24 m m 높이), 볼트 (Ф 높이 3 m m × 30 m m), 너트 (Ф 4 m m) 그리고 날개 모양의 너트 (Ф 4 m m).
    2. 실리콘의 120 g의 총 수 있도록 경화 에이전트 및 1:9 비율에 탄성 중합체를 측정 합니다.
    3. 250 mL 삼각 플라스 크에에서 액체 실리콘 혼합물을 넣고 잘 섞는다. 다음은 desiccator에 플라스 크를 넣어 고 펌프를 통해 진공에서 약 1 시간에 대 한 기포를 제거 합니다.
    4. 높이 10 m m로 높은 맞춤형 마우스 챔버에 액체 실리콘 믹스를 부 어 하 고 며칠 (그림 1A)에 대 한 치료.
  2. 표지 슬라이드와 침대 고정 간의 준비
    1. 금속 프레임에서 실리콘 접착제를 사용 하 여 덮개 유리를 첨부 합니다. 1 일 (그림 1B)에 대 한 건조 하자.
    2. 효과적으로 물 침수 렌즈에 대 한 증류수 보전, 반영구적 물 차단 구조는 필수적 이다. 1 m m 실리콘 접착제를 반올림 하 고 밤새 그것을 강화.
    3. 경화 에이전트 및 기본 고무를 혼합 하 고에 부 어 그것은 높이 약 8-10 m m. 수행 6 잘 플레이트 강화 과정 1.1.2-1.1.4에 설명 된 대로.

2입니다. LPS의 준비

  1. 살 균 1 × 인산 염 버퍼 식 염 수 희석 살 모 넬 라 enterica serotype enteritidis에서 LPS 분말 (PBS)를 준비 합니다. (1 × PBS: 137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4).
  2. 미리 37 ° C에 물 목욕에 PBS가 열 하 고 신중 하 게 LPS 분말 병 (25 mg)를 엽니다.
  3. 피펫으로 원조를 사용 하 여, LPS 분말 병에 무 균 PBS (5 mL)을 부 어 부드럽게 저 어 하거나 재고 솔루션을 준비 하는 솔루션을 일시 중단 합니다.
    참고: LPS 분말 액 화 후 가혹한 vortexing 거품을 일으킬 수 있습니다. 1.5 mL 튜브에 aliquots를 만들 때 손실을 최소화 하기 위해 거품을 만드는 하지 마십시오.
  4. −20 ° C, 재고 LPS 솔루션을 저장 하 고 주입을 위해 1 mg/mL LPS 솔루션으로 그것을 희석.
  5. 1 mL 주사기를 사용 하 여 비 취 마우스의 복 막에 1 mg/mL LPS 솔루션 (20 mg/kg)를 삽입할. 제어 동물에 대 한 PBS의 동일한 볼륨을 주입.
  6. 충분 한 염증 반응에 대 한 2 시간을 기다립니다.

3. 혈관 얼룩 텍사스 레드 Dextran의 준비

  1. 두 개의 15 mL 원뿔 튜브 및 살 균 PBS의 10 mL를 준비 합니다.
  2. 텍사스 레드 Dextran 분말 (25 밀리 그램) 3 ml PBS의 묽 게 하십시오와 잘 섞는다. 빈 15 mL 원뿔 튜브에 혼합물을 전송.
  3. Dextran 혼합물 (3 mL)를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 남아 있는 PBS (7 mL)를 전송 합니다.
  4. 10 mL 주사기의 끝에 0.45 μ m 주사기 필터를 연결 합니다. 필터 주사기는 바늘을 교체 해야 합니다.
  5. Dextran 혼합물 (10 mL) 필터링. 흘리 고 피하기 위해 주사기를 균등 하 게 누르십시오.
  6. 빛 차단 1.5 mL 튜브에 2.5 mg/mL dextran 솔루션의 500 µ L를 분배 하 고 −20 ° c.에 그것을 저장합니다 일단 해 동, 4 ° c.에 그것을 저장합니다

4. 수술 과정

  1. 치료 수술 테이블 및 수술 하기 전에 70% 알코올을 사용 하 여 모든 악기. 다음, 간 수술 도구를 설정 하 고 (그림 2A, B) 37 ° C에 난방 격판덮개를 조정 합니다.
  2. 마 취에 대 한 intraperitoneally에 30 mg/kg tiletamine/zolazepam와 xylazine의 10 mg/kg는 쥐 주사. 이러한 솔루션은 혼합 고 동시 주입에 대 한 PBS에 희석 수 있습니다. 마우스의 발가락을 부드럽게 눌러 anesthetization를 확인 합니다.  아니 반사 때 다음 단계를 진행 합니다.
  3. 마우스의 망막의 건조를 방지 하기 위해 눈 연 고의 작은 금액을 적용 합니다.
  4. 제 모 크림 (그림 2C)를 사용 하 여 복 부 주변 몸 머리를 제거 합니다.
  5. 꼬리 정 맥 또는 인슐린 주사기 (그림 2D)를 사용 하 여 역 궤도 주입을 통해 텍사스 레드 Dextran 솔루션 (2.5 mg/mL의 농도)의 200 µ L을 주입.
  6. 표시와 함께 바로 subcostal 영역을 표시 합니다. 라인은 갈비뼈의 끝에 칼 과정에서 그려야 한다. 집게와가 위 (그림 2E, F) 표 피를 잘라.
  7. 마이크로-가 위, 집게를 사용 하 여 복 부 구멍 열고 간 신중 하 게 노출 합니다. 왼쪽된 측면 엽 면봉 (그림 2G, H)를 사용 하 여 밖으로 굴러 될 해야 합니다.
  8. 간 건조를 방지 하기 위해 복 부 구멍에 살 균 PBS의 500 µ L를 붓는 다.
  9. 사용자 정의 설계 실에서 오른쪽 decubitus 위치에 마우스를 놓고 실리콘 침대에 조직 접착제의 작은 금액을 적용 합니다. 그럼, 신중 하 게 간 면봉 (그림 2I)를 사용 하 여 연결 합니다.
    참고: 간 조직 매우 어렵다면 있기 때문에, 기계적으로 당기지 마십시오 간 밖으로. 부드럽게 롤 그것 밖으로 면봉으로.
  10. 몇 초 후, 젖은 간 밖으로 건조 하지 않도록 하는 살 균 PBS의 500 µ L로 다시 간. 간장에 금속 프레임을 놓고 너트 (그림 2J)와 그것을 단단히 고정 합니다.

5. intravital 영상 2 광자 현미경으로 간

  1. 880 nm, 그리고 녹색, 세트에 선 소프트웨어 (Carl Zeiss) 레이저에 설정, 파장을 설정 실행 및 빨간색 채널. 레이저 파워 형광 강도 (그림 3A)에 따라 조정 합니다. 배기 필터 정보는 다음과 같습니다: 그린/Alexa488, 500-550 nm와 적색/알 렉 사 555, 575-610 nm.
  2. 이미징 단계에 챔버를 놓고 물 침수 렌즈 커버 유리에 가까운 X 20를 배치 합니다.
  3. 실리콘 고무 히터의 온도 (그림 3B)를 유지 하기 위해 마우스 몸 아래의 수정.
  4. 금속 프레임에 증류수 500 µ L를 삭제 하 고 (그림 3C) 간 가까운 대물 렌즈를 당겨.
  5. 초점을 조정 하 고 깊이 이미지 영역의 시간 확인.
  6. 행위 이미지입니다.
  7. 장기적인 이미징, 이미징 동안 각 시간 tiletamine/zolazepam 및 xylazine 혼합물의 절반 복용량 주입. 이 단계 동안 37 ° C에서 쥐의 체온을 유지 필수적 이다. 항상 계속 눈에 마우스, 모든 마우스에서 anesthetization 시간 차이가 있기 때문.
    참고:이 방법은 아니다 복구에 대 한 적절 한 수술 및 이미징 후. 우리는 윤리적으로 수술 후 즉시 마우스를 희생.
  8. 안정적인 anesthetization에 대 일 분 마다 페달 반사를 확인 하십시오.

6. 데이터 분석

  1. 데이터 분석 소프트웨어 Volocity를 연 다음 소프트웨어 라이브러리에서 원시 데이터를 가져올 합니다.
  2. 상황에 맞게 하 고 스냅숏을 이미지에서 노이즈를 제거 합니다.
    참고: 부드러운 이미지를 얻기 위해 '벌금' 또는 '중간' 필터를 사용 합니다. 또한, '콘트라스트 향상' 기능을 사용 하 여 어둡거나 흐린 이미지를 선명 하 게.
  3. 스냅숏 이미지를 JPEG 또는 TIFF 파일 및 AVI 파일 영화에 대 한 수출을 100% 편집된 항목에 맞게.

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결과

간단 하 고 매우 안정적인 이미징 챔버 고안 되었다. 챔버의 하단 마우스 몸과 장기의 미 끄 러 방지 실리콘으로 덮여 있었다. 또한, 실리콘 탄성의 적절 한 금액을가지고, 때문에 그것은 커버 슬라이드 (그림 1A, C)의 압력에 의해 유도 된 예상된 피해를 막을 수 있습니다. 두 번째, 조직 안전한 접착제 (본드 수 의사)는 원 모양의 실리콘 침대에서 추출 된 간 해결 하기 위해 적용 되었습니다. 이 메서드는 하트 비트 또는 respirational 운동으로 인 한 떨림 방지를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 금속 커버 슬라이드 배치 되었고 볼트와 너트 쥐의 몸 크기와 튀어나온 간 (그림 1B-D)의 위치에 기반 하 여 고정. 마 취는 제대로 수행 되었다 때 이미징 설정과 ...

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토론

간은 많은 그룹3,10, 그것의 기능의 중요성 때문에 의해 적극적으로 연구 되었습니다. 예를 들어, Heymann 외. agarose를 사용 하 여 섬세 한 방법을 제안 했다. 이 메서드는 매우 정확 하 게 발견 되었다, agarose 설정 시간이 걸립니다. 그러나, 우리의 방법론으로 모든 절차 수 실행 될 다른 혼동 요인을 최소화 하는 30 분 이내. 하트 비트 비디오를 방해 할 수 있기 때문에 둘째, 간 안정화 매우 중요 하다. 이 현상 제거, 우리는 오른쪽 decubitus 위치에 쥐를 재배치.

이 프로토콜에서 다른 중요 한 단계 생산의 금속 커버 프레임 및 금속 막대에 위치 했다. 우리가 직면 하는 가장 중요 한 장애물 간 고정 압력의 적절 한 금액을 사용 하 여 따라 간의 friability를 극복 하는 방법을 결정 했다. 처음에 때만 나비 너트 커버 슬라이드를 적용...

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공개 사항

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 교부 금에서 국가 연구 재단의 한국 (NRF) (MSIP; 보조금 번호 2016R1A2B4008199 Y-m 한국 정부에 의해 자금에 의해 지원 되었다. H.)와 사역의 건강 및 복지, 한국 (번호 부여: HI14C1324).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
맞춤형으로 설계된 챔버라이브 셀 기기맞춤형으로 설계된 크기
금속 커버 슬라이드라이브셀 기기맞춤형으로 설계된 크기
커버 유리전자 현미경 과학#72204-03
실가드 184 실리콘 엘라스토머 키트다우코닝
삼각식 플라스크DURAN21 216 36
세포배양판 (Flat type)HYUNDAI Micro Co.H31006
데시케이터ADARSH55204
High Q BOND SE 5 mLBJM LAB반영구적 댐
유연한 실리콘 고무 히터OmegaSRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
DC 전원 공급 장치ToyotechDP30-03A
인산염 완충 식염수수제
Salmonella enteria serotype enteritidis의 Lipopolysaccharides (LPS)Sigma-AldrichL6011
Texas Red DextranThermo Fisher ScientificD1830
15 mL 고선명 폴리프로필렌
원뿔형 튜브		FALCON14-959-49B
0.45 μ m 필터 (Minisart 주사기 필터)Sartorius16555k
1.5ml Micro Tube, AmberAxygenMCT-150-X차광용
mL 주사기한국 백신KV-S01
3 mL 주사기한국 백신KV-S03
10 mL 주사기한국 백신KV-S10
0.3 mL 인슐린 주사기Becton Dickinson324900
제모 크림 100 mL바디 나투르
면봉ABDI
Zoletil 50 5 mLVirbac
Rompun 10 mL바이엘
가열판라이브 셀 기기PH-S-10맞춤형 크기
DC 컨트롤러라이브 셀 기기CU-301
Microdessection 가위Harvard Apparatus72-5418
가위RobozRS-5882
집게RobozRS-5137
Vet bond3M1469SB
ZEN 소프트웨어 (블랙 에디션)Carl Zeiss프로그램 for LSM 7 MP
LSM 7 MPCarl Zeiss
VolocityPerkinElmer분석 프로그램
1

참고문헌

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
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재인쇄 및 허가

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