Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

요약

우리는 최소한의 침공과 라이브 쥐 간 2 광자 영상에 대 한 새로운 수술 프로토콜을 설립. 이 기술을 우리 lipopolysaccharide 유도 endotoxemia 동안 간의 상세한 구조를 확인 할 수 있습니다. 우리는이 방법을 간 백혈구 이동에 다양 한 시 약 처리의 효과 결정 하기 위해 활용 될 수 있습니다 예상.

초록

패 혈 증은 조직 기관 실패를 일으킬 수 있는 심각한 감염의 유형을 손상. 패 혈 증과 관련 된 사망률과 병 적 속도 매우 높은, 아니 직접 치료 이나 기관 관련 메커니즘을 실시간으로 자세히 검사 합니다. 간 독 소 및 인체에 감염을 관리 하는 핵심 기관 이다. 여기, 우리 면역 세포, 호 중구 등 간 capsular 세포 (LCMs)의 운동 성을 추적 endotoxemia의 유도 후 마우스 간 intravital 이미징 수행 목적입니다. 따라서, 우리는 최소 침 습 수술으로 간의 노출에 대 한 새로운 수술 방법 설계 되었습니다. 마우스 intraperitoneally lipopolysaccharide (LPS), 일반적인도로 주입 했다. 노출 및 LPS 처리 LysM-녹색 형광 단백질 (GFP)에 마우스 간, 우리는 그 neutrophil 발견 채용의 intravital 이미징에 대 한 우리의 새로운 외과 접근을 사용 하 여 마우스 간 그 인산 염 버퍼에 비해 증가 했다 염 분 처리 간입니다. LPS 치료 후, 호 중구 수 시간 크게 증가. 또한, 우리가 성공적으로 간 상주 대 식 세포 라는 LCMs 시각 CX3Cr1 GFP 마우스를 사용 하 여. 따라서, vivo에서면역 이동성 제어를 새로운 시 약의 효능을 조사, 운동 성 및 간에서 호 중구 및 LCMs의 형태 결정 수 기관 실패 및 조직 손상으로 인 한 치료 효과 확인 하 패 혈 증에 백혈구 활성화입니다.

서론

간은 포유류; 주요 대사 기관 그것은 에너지, 호르몬, 및 해독¹에 대 한 컨트롤 타워 역할을 합니다. 그 중요성으로 인해 연구팀은 염증 동안에 변화를 명료 하 많은 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험을 실시 했습니다. Intravital 현미경 검사 법은 간² 에서 라이브 이미지를 캡처하는 데 사용 되었습니다. 실제로, 다양 한 간 이미징 방법 되었습니다 도입^2,,34,,56. 그러나, 더 단순화 된 외과 접근을 개발 하 고 대상 기관 및 면역 세포의 안정화를 달성, 우리는 intravital 이미징에 대 한 그들의 노력을 최소화 하기 위해 연구원 안내 하는 간단한 프로토콜을 설계 되었습니다.

이 연구에서 우리는 안정적이 고 새로운 이미징 챔버 및 출혈 및 가능한 감염을 최소화 하기 위해 사용 될 수 있는 수술 기법 도입. 우리는 간 ....

프로토콜

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 연 세 대학의과 대학교의 지침에 따라 실시 했다. LysM-녹색 형광 단백질 (GFP; gfp / +) 마우스⁸ 및 CX3Cr1 GFP (gfp / +) 나이의 8 ~ 12 주에⁹ 마우스 intravital 이미징 사용 되었다. 모든 수술 도구 압력가 마로 소독 하 고 70% 알코올로 소독 했다.

1. 맞춤형 마우스 간 이미징 지원 도구와 챔버

1. 마우스 간 이미징 챔버 디자인
   1. 마우스 간 (그림 1) 이미징에 대 한 다음과 같은 크기의 방 만들기: 내부 챔버 (120 m m 길이 × 폭 160 m m × 30 m m 높이), 외부 챔버 (100 m m 길이 × 폭 100 m m × 24 m m 높이), 볼트 (Ф 높이 3 m m × 30 m m), 너트 (Ф 4 m m) 그리고 날개 모양의 너트 (Ф 4 m m).
   2. 실리콘의 120 g의 총 수 있도록 경화 에이전트 및 1:9 비율에 탄성 중합체를 측정 합니다.
   3. 250 mL 삼각 플라스 크에에서 액체 실리콘 혼합물을 넣고 잘 섞는다. 다음은 de....

결과

간단 하 고 매우 안정적인 이미징 챔버 고안 되었다. 챔버의 하단 마우스 몸과 장기의 미 끄 러 방지 실리콘으로 덮여 있었다. 또한, 실리콘 탄성의 적절 한 금액을가지고, 때문에 그것은 커버 슬라이드 (그림 1A, C)의 압력에 의해 유도 된 예상된 피해를 막을 수 있습니다. 두 번째, 조직 안전한 접착제 (본드 수 의사)는 원 모양의 실리콘 침대에서 추출 된 간 해결 하기 위해 적용 되었습니다. 이 메서드는 하트 비트 또는 respirational 운동으로 인 한 떨림 방지를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 금속 커버 슬라이드 배치 되었고 볼트와 너트 쥐의 몸 크기와 튀어나온 간 (그림 1B-D)의 위치에 기반 하 여 고정. 마 취는 제대로 수행 되었다 때 이미징 설정과 .......

토론

간은 많은 그룹^3,10, 그것의 기능의 중요성 때문에 의해 적극적으로 연구 되었습니다. 예를 들어, Heymann 외. agarose를 사용 하 여 섬세 한 방법을 제안 했다. 이 메서드는 매우 정확 하 게 발견 되었다, agarose 설정 시간이 걸립니다. 그러나, 우리의 방법론으로 모든 절차 수 실행 될 다른 혼동 요인을 최소화 하는 30 분 이내. 하트 비트 비디오를 방해 할 수 있기 때문에 둘째, 간 안정화 매우 중요 하다. 이 현상 제거, 우리는 오른쪽 decubitus 위치에 쥐를 재배치.

이 프로토콜에서 다른 중요 한 단계 생산의 금속 커버 프레임 및 금속 막대에 위치 했다. 우리가 직면 하는 가장 중요 한 장애물 간 고정 압력의 적절 한 금액을 사용 하 여 따라 간의 friability를 극복 하는 방법을 결정 했다. 처음에 때만 나비 너트 커버 슬라이드를 적용.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
맞춤형으로 설계된 챔버	라이브 셀 기기		맞춤형으로 설계된 크기
금속 커버 슬라이드	라이브셀 기기		맞춤형으로 설계된 크기
커버 유리	전자 현미경 과학	#72204-03
실가드 184 실리콘 엘라스토머 키트	다우코닝
삼각식 플라스크	DURAN	21 216 36
세포배양판 (Flat type)	HYUNDAI Micro Co.	H31006
데시케이터	ADARSH	55204
High Q BOND SE 5 mL	BJM LAB		반영구적 댐
유연한 실리콘 고무 히터	Omega	SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
DC 전원 공급 장치	Toyotech	DP30-03A
인산염 완충 식염수			수제
Salmonella enteria serotype enteritidis의 Lipopolysaccharides (LPS)	Sigma-Aldrich	L6011
Texas Red Dextran	Thermo Fisher Scientific	D1830
15 mL 고선명 폴리프로필렌 원뿔형 튜브	FALCON	14-959-49B
0.45 μ m 필터 (Minisart 주사기 필터)	Sartorius	16555k
1.5ml Micro Tube, Amber	Axygen	MCT-150-X	차광용
mL 주사기	한국 백신	KV-S01
3 mL 주사기	한국 백신	KV-S03
10 mL 주사기	한국 백신	KV-S10
0.3 mL 인슐린 주사기	Becton Dickinson	324900
제모 크림 100 mL	바디 나투르
면봉	ABDI
Zoletil 50 5 mL	Virbac
Rompun 10 mL	바이엘
가열판	라이브 셀 기기	PH-S-10	맞춤형 크기
DC 컨트롤러	라이브 셀 기기	CU-301
Microdessection 가위	Harvard Apparatus	72-5418
가위	Roboz	RS-5882
집게	Roboz	RS-5137
Vet bond	3M	1469SB
ZEN 소프트웨어 (블랙 에디션)	Carl Zeiss		프로그램 for LSM 7 MP
LSM 7 MP	Carl Zeiss
Volocity	PerkinElmer		분석 프로그램

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