파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면

요약

우리는 고정, 파라핀 포함, 및 미생물 식민지 biofilms 얇은 단면 기술을 설명 합니다. 준비 샘플, biofilm 구조 및 기자 식 패턴 현미경 검사 법에 의해 구상 될 수 있다.

초록

파라핀 포함 통해 단면 진 핵 시스템에는 광범위 하 게 설립된 기술입니다. 여기 제공 하는 고정 하는 방법 포함, 끼얹는다 파라핀 왁 스를 사용 하 여 그대로 미생물 식민지 biofilms의 단면. 식민지 biofilms에 사용 하기 위해이 메서드를 적용 하 우리 각 샘플의 성장 기판에 유지 하 고 agar overlayer와 코팅 기술을 개발 하 고 리 통 솔루션에 추가. 이러한 최적화는 샘플 보존 및 micromorphological 기능의 보존을 향상 시킵니다. 이 방식으로 준비 샘플 얇은 단면 및 빛, 형광, 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 이미징 의무가 있다. 우리는 녹 농 균, 슈 도모 나 스 synxantha, 새 균의 subtilis, 및 비 브리 오 cholerae식민지 biofilms에이 기술을 적용 했습니다. 세부 사항이이 메서드에 의해 생성 된 샘플에서 볼 수의 높은 수준의 결합 기자 스트레인 엔지니어링 또는 특정 염료를 사용 하 여 생리 및 미생물 지역 사회 개발에 대 한 흥미로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

서론

대부분 미생물 형태 biofilms 용량을가지고, 셀의 지역 사회 자체 제작된 행렬에 의해 함께 개최. Biofilms는 영양소와 기판의 다양 한 정권으로 물리적 설정의 많은 종류에 성장 될 수 있다. Biofilm 형성에 대 한 구체적인 분석 재현성 다세포 구조, 항복 하는 경향이 그리고 일반적인 아키텍처 phylogenetically 다양 한 종 지역 사회 또는 거시적인 수준에서 관찰 된다. 미생물 고체 매체는 대기권의 밑에 식민지로 재배 되 고, 거시적인 형태학 매트릭스 생산 용량에 대 한 정보를 전달 하 고 종종 다른 특성 ^1,2,3와 상관 관계가. 미생물 식민지의 내부 아키텍처 biofilm 특정 화학 및 생리학에 대 한 단서를 제공할 수도 있습니다 하지만 특성화 하는 어려운 되었습니다. 세균성 식민지를 cryoembedding 및 cryosectioning 기술의 최근 응용 프로그램 이미징 및 시각화 전례 없는 해상도 ^4,,56에서 특정 기능을 활성화 했습니다. 그러나, 동물 조직으로 연구는 파라핀 포함 형태 cryoembedding ⁷ 에 비해 뛰어난 보존 하며 조직을 ^8,9에서 박테리아를 시각화 하는 데 사용 되었습니다 나타났습니다. 우리는 따라서 기정, 파라핀 포함, 그리고 미생물 식민지 biofilms의 얇은 단면에 대 한 프로토콜을 개발 했습니다. 여기, 녹 농 균 PA14 식민지 biofilm 얇은 섹션 ^10,11, 준비 설명 합니다 하지만 우리 박테리아에 의해 형성 된 biofilms에 또한 성공적으로이 기술을 적용 된 슈 도모 나 스 synxantha, 새 균의 subtilis, 및 비 브리 오 cholerae¹².

파라핀 포함 및 얇은 단면 biofilms의 과정에는 간단한 논리를 다음과 같습니다. 먼저,는 biofilms는 처리 하는 동안 형태를 보존 하는 agar의 레이어 쌌 다. 둘째, 쌌 다 biofilms crosslink 고분자에는 정착 액에 잠긴, micromorphology를 유지. 이 알코올 탈수 한 다음, 더 비 극 지 용 매로 지워지고 액체 파라핀 왁 스와 함께 침투. 침투, 일단 샘플 단면에 대 한 왁 스 블록에 포함 됩니다. 섹션은, 슬라이드에 잘라내어 다음 그들을 원래의 상태로 돌아가도록 rehydrated. 이 시점에서 그들은 수 수 스테인드 또는 현미경 분석에 대 한 설치 매체에서.

이 프로토콜 조직학 분석을 위한 적합 한 미생물 biofilms의 얇은 섹션을 생성합니다. 이 메서드를 사용 하 여 준비 하는 얇은 단면도 가벼운 현미경 검사 법에 의해 군데 식민지 biofilm 콘텐츠의 표시 됩니다. Biofilms 또한 개별 기능에 대 한 특정 미디어 포함 형광 얼룩에 성장 하거나 재 단계 장착 (9.5-9.6 단계) 직전에서 스테인드 수 있습니다. 마지막으로, 미생물이 지역이 사회 내에서 셀 배포 또는 유전자 표현의 보고 제자리에 있도록 제정 또는 레 귤 레이트 된 패션에 형광 단백질을 생산 하기 위해 설계 될 수 있다. 식민지 biofilm 깊이, 셀 유통, 매트릭스 유통, 성장 패턴 및 spatiotemporal 유전자 발현을 확인 하기 위해 이러한 방법을 사용 했습니다.

프로토콜

1입니다. 녹 농 균 식민지 Biofilms의 성장

1. 매체-Bilayer 접시의 준비
   1. 10 g/L tryptone, 한 천 10 g/L를 준비 이온 물에서 ( 재료의 표참조) 솔루션.
   2. 20 분 50-60 ° C에 시원한 물 욕조에 대 한 오토 클레이 브.
   3. 100 mm x 100 mm 정사각형 접시에 agar tryptone 솔루션의 45 mL를 붓고 ( 재료의 표참조) 50 mL 원뿔 튜브를 사용 하 여. 공고히 한 천 수 (20 ~ 30 분). 두 번째, 15 mL 레이어의 첫 번째 레이어 위에 붓는 다. 밤새 공고히 하자, 보풀 티슈로 닦아 하 여 필요한 경우 뚜껑에서 결로 제거.
2. 식민지 Biofilms 안보
   1. 관심 종자 파운드 한 천 격판덮개¹³ 에 냉장고 주식에서 행진 하 고 37 ° C와 80-100% 상대 습도에서 12-16 h에 대 한 어둠 속에서 품 어.
   2. 각 스트레인 또는 복제에 대 한 단일 식민지를 사용 하 여 파운드의 2 개 mL를 접종 하 여 37 ° C에서 12-16 h 250 rpm 동요에 대 한 어둠 속에서 품 어.
   3. 서브 1: 100 파운드 신선 하 고 37 ° C에서 2.5-3 h 250 rpm에서 진동에 대 한 어둠 속에서 잠복기에 diluting 하 여 문화.
   4. 분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 하 고 살 균 파운드는 OD와 세포 현 탁 액을 달성 하기 위해 조정_{500 nm} ~ 0.5의.
   5. 원하는 서식 지에 따라 다릅니다 피펫으로 2.5-10 µ L (단계 1.1에서에서 준비) 매체 bilayer 플레이트에 셀 서 스 펜 션의 크기 하 고 자리 ~ 20 분 페 트리 뚜껑 열린 불꽃 근처 열려 떠나 건조 용이 하 게 수에 대 한 건조를 허용.
   6. 최대 4 일 동안 어둠 속에서 25 ° C 및 80-100% 상대 습도에서 자리 식민지를 품 어.

2입니다. 통 솔루션의 준비

1. 샘플 수확의 날에 통 솔루션을 준비 합니다. 1 x 4%의 최종 농도에 PBS에 37% 포름알데히드 (FA)를 희석 FA.
   주의: FA은 휘발성과 독성이 있습니다. 보호 장비를 착용 하 고 통풍이 잘되는 증기 두건에서 작동.
2. 즉시 사용 하기 전에 분해 4% 염 산 L-리 신 FA 50mm L 리 진 HCl의 최종 농도를 실 온에서 (단계 2.1에서에서 준비).

3. [옵션] 식민지 Biofilm에 정착 액의 응용 프로그램을 직접

참고: 우리는 biofilm 형태학 agar 오버레이 고정 하기 전에 추가 될 때 가장 잘 유지 되는 발견 했다. 그러나,이 단계는 또한 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 환경 조건에 변화를 구성 합니다. 따라서 여기에 설명 된 대로 있는 고정 단계는 실시 한 오버레이 추가 하기 전에 별도 프로토콜을 사용 하 여 형광 기자 식 패턴에 확인 한다.

1. 고정, 그리고 환기가 증기 두건에서 한 일에 식민지의 가장자리, 그것은 그것을 잠수 없이 식민지의 주변에 도달 수 있도록 주위 agar 표면에 직접 2 단계에서 준비 하는 정착 제 플라스틱. 약 500 µ L. 허용 식민지 및 주변 agar에 확산 정착 액으로 많은 정착 액 만큼은 완전히 식민지를 둘러싸고에 적용 됩니다.
2. 일단은 정착 액 식민지 및 주변 미디어, 약 20-30 분에 완전히 흡수 되었으며 잔여 FA는 더 이상 접시에 표시, 단계 3.1을 반복 합니다. 식민지와 주변 agar에 확산이 정착 액을 허용 합니다.
3. 일단은 정착 액 완전히 식민지로 흡수 되었으며 주변 미디어 반복 단계 3.1, 식민지의 표면에 직접 고정 제를 적용 합니다. 식민지와 주변 agar에 확산이 정착 액, 진행 단계 4에만 모든 후 통 흡수 되었으며 더 이상 접시에 볼 수 없습니다.

4. 오버레이 Agar와 식민지

1. 고정 일에는 10 g/L 이온된 물과 분해에 10-20 분 압력솥에 한 솔루션 준비. 50 ˚C에 물 욕조에 멋진.
2. 부드럽게 붓는 다 15 mL agar 솔루션의 성장 매체 및 식민지. 5 분 (그림 1B)에 대 한 실 온에서 젤을 형성 하기 위하여 한을 수 있습니다.
3. 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 최고 2 개의 층 사이 적 층 하는 식민지와 정사각형, 3 층 척을. 여러 샘플을 준비, 각 척 비슷한 크기로 잘라는 확인 합니다.
4. 부드럽게 식민지 포함 된 척에서 과도 한을 제거 합니다.
5. 척 (그림 1C)의 아래쪽 계층에서 agar (식민지 포함)의 2 개의 상위 계층을 해제, PBS 또는 물 1 주걱의 플랫 머리 젖은 하 고 부드럽게 위쪽 및 아래쪽 레이어 사이 삽입 합니다. 적 층된 식민지 아래 계층에서 분리 해야 합니다. 조심 하지 왜곡 하거나 그것의 기초에서 그것을 해제 하는 때 적 층된 식민지를 벤드 합니다.

5입니다. 고정

1. 적 층된 식민지 (즉, 2 층 척) 포함 카세트로 전송 즉시 환기가 연기 후드, 작업 ( 재료의 표참조), 화학 방지 마킹 펜으로 표시. 유리 슬라이드 우편물 포함 카세트를 넣습니다 (재료의 표 참조) 포함 하는 준비 단계 2.1-2.2에서에서 정착 액. 없음 기포 포함 카세트 안에 갇혀 있다 다는 것을 확인 하십시오.
2. 하룻밤 실 온에서 어둠 속에서에서 정착 액에 샘플을 품 어.

6. 샘플 처리: 버퍼 세척, 탈수, 개간, 및 침투

1. 야간 고정 후 샘플 1 h 1 x PBS에 두 번 세척. 최상의 결과 얻으려면 시 균질 스핀을 사용 하 여 자동화 기능 자동 조직 프로세서의 낮은 설정으로 설정 (자료의 표 참조). 없는 프로세서를 사용할 수 있는 경우 처리는 수동으로 실행할 수 있습니다.
2. 실 온에서 1 h 각 1 x PBS (25%, 50%, 70%, 95%)에서 에탄올 (EtOH) 희석의 등급된 시리즈를 통해 탈수로 버퍼 세척을 따릅니다.
3. 100%의 3 개의 세척 탈수 EtOH 각 실 온에서 1 h.
4. 100% 오렌지 오일 기반 개간 에이전트의 세 가지 세척 탈수 샘플 취소 (재료의 표 참조) 각 실 온에서 1 h.
5. 침투 지운된 샘플 두 번와 녹은 파라핀 왁 스 ( 재료의 표참조), 55˚C, 2 h에 대 한가 열.

7. 샘플 포함

1. 55 ˚C를가 열 하는 녹은 파라핀 왁 스 왁 스 몰드를 채우십시오. 온수, 편평한 주걱을 사용 하 여 신속 하 게 포함 카세트의 침투 척 물림 쇠 병렬 형의 기지에 달려 있도록 왁 스 금형에 전송. 물림 쇠에 과도 한 압력을 적용 하지 마십시오. 왁 스 금형 사용자 지정 3 차원 인쇄 될 수 있습니다 또는 상용 ( 재료의 표참조).
2. 4 ˚C에서 하룻밤을 강화 하기 위해 왁 스를 수 있습니다. 고체 왁 스 몰드 샘플 4 ˚C에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.
3. 왁 스가 고형화 되 면 금형에서 샘플을 삭제할 고 면도날으로 샘플 주위에서 과잉 왁 스 손질. 두고 과잉 왁 스 샘플, 단면, 평면에 평행한의 한쪽 끝에서 연장는 톰으로 클램프 하는 데 사용할 수 있습니다 ( 재료의 표참조). 또한 샘플 주위 왁 스, 약 1 m m 두께의 칼 집 두고 그 얼굴을 부드럽게.

8. 단면

1. 42 ˚C에 물 목욕을 열. 잎의 가장자리에 수직으로 동쪽으로 향하게 하는 식민지의 표면으로 톰으로 샘플을 클램프 ( 재료의 표참조).
2. 식민지의 원하는 평면 섹션을 수집 된 것입니다 도달 했습니다 때까지 샘플 50 µ m 간격으로 잘라.
3. 10 µ m 두께 섹션 75-80 rpm의 단면 속도 6-10˚의 허가 각도를 설정 하는 톰을 사용 하 여 원하는 수의 리본을 잘라. 뾰족한 붓을 사용 하 여 잎에서 리본을 분리.
4. 부드럽게 전송 파스퇴르 피 펫 (선호) 또는 집게의 끝에 물 한 방울을 사용 하 여, 물 목욕 리본. 섹션에서 트랩 공기 방울을 피하기 위해 주의 해야 합니다.
5. 즉시 물 욕조에 슬라이드를 삽입 하 고 45˚에서 리본 메뉴 아래에 위치.
6. 슬라이드 반투명된 레이블 바로 아래에 리본의 좁은 가장자리를 터치 합니다. 리본을 준수 해야 합니다.
7. 물 목욕, 물, 표면에 수직이 되도록 각도 조정 하 고 그것의 길이 따라 슬라이드에 대 한 평면을 리본 허용에서 슬라이드를 당겨. 리본 메뉴 아래 초과 물을 트래핑 하지 마십시오.
8. 부드럽게 서는 흡수 성 보풀 조직, 섹션에서 초과 물을 wicking에 슬라이드.
9. 종이 타월에 슬라이드를 어둠 속에서 하룻밤 실 온에서 건조 그것을 허용. 슬라이드는 어둠 속에서 4 ˚C에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.

9. 열 고정, 재, 및 장착

1. 45 ˚C를 수준별된 핫 플레이트를 열. 30-60 분에 대 한 슬라이드를 열. 왁 스 것 이다 될 세미-녹은 평평 하 게 슬라이드에 대 한.
2. 부드럽게 핫 플레이트에서 슬라이드를 올리고 누워 부드러운, 수준별, 실내 온도 표면에 평면 녹은 왁 스 왁 스 굳은 (~ 1 분) 때까지 슬라이드의 어느 사이드를 당겨 하지 않습니다 보장 하기 위해 관리 사용 하 여.
3. 세척 사이 솔루션을 제거 하는 Büchner 흡 인기를 사용 하 여 각, 5 분에 대 한 에이전트를 비운의 4 개의 세척 슬라이드 왁 스 드 유리 슬라이드 메일러를 사용 하 여.
4. 100%에 슬라이드 세 번 씻어 EtOH 1 분.
5. 각 1 x PBS에이 분 세척 뒤 1 분 (95%, 70%, 50% 및 25%)를 처리 하는 역 순서에서 에탄올의 등급 시리즈에서 슬라이드 리하이드레이션
6. 즉시 Tris 버퍼 장착 매체에 섹션을 탑재 ( 재료의 표참조) 기포의 도입을 방지 하는 coverslip 적용. 하룻밤 실 온에서 유해를 장착 중간을 수 있습니다.
7. 일단 생산, 투명 매니큐어를 사용 하 여 슬라이드에 coverslip 인감. 봉인 된 슬라이드 4 ˚C에서 어둠 속에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.

결과

이 메서드는 biofilm 얇은-섹션 점에서 뚜렷한 형태 기능 및 유전자 발현의 영역 DIC, 형광 현미경 검사 법, 그리고 가장 군데 될 수를 생성 합니다. DIC 이미징 기름 침수 목표 X 40을 사용 하 여 몇몇 형태학 상 특징 (그림 2E)를 표시 하기에 충분 한 수 있습니다, 우리는 발견 그 형광 현미경 constitutively 익스프레스 형광 단백질을 설계 하는 긴장의 향상을 제공 합니다 (그림 2D) 샘플 내 세포 분포의 시각화. 개별 섹션의 이미지 (그림 2B) 전체 식민지의 횡단면을 생성 하 고 거시적인 수준 (비교 전체적인 형태 구조 기능 지역화에 대 한 컨텍스트를 제공 함께 바느질 될 수 있다 그림 2A, B 및 C

토론

파라핀 포함 및 얇은 단면 조직 샘플은 고전적인 조직학 기술 마이크로 형태 구조의 이미징 수 있도록 진 핵 조직에 일반적으로 사용 되 고 약간의 성공을 함께 미생물 샘플^{8에 적용 된 ,9}. Cryoembedding 생 및 immunofluorescent 신호의 강한 보존에 대 한 수, 파라핀 포함 바람직합니다 일반적으로 형태학¹⁶의 더 나은 보존을 제공 합니다. 이 방법을 응용 미생물 biofilms에 적응, 우리 우리의 시스템에 고유한 특성에 집중 했다. 세포 및 조직의 매트릭스 종종 함께 비교적 견고 하 게, 동안 유지 biofilms 경향이 더 섬세 한; 우리는 그러므로 일상적인 고정 및 샘플 보존을 극대화 하기 위해 프로토콜을 포함 하는 왁 스를 최적화. 그것의 성장 기판에 샘플을 유지 하 고 고정 직전 agar와 식민지를 오버레이 샘플 상단 이나 기지에서 손실 되지 않습니...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5 3/4" 파스퇴르 피펫	Fisher Scientific	13-678-6A	대학 바이오스토어에서 구입
한천	테크노바	A7777
Buchner 흡인기 (진공) 플라스크	Pyrex	5340	대학 바이오스토어에서 구입
화학적으로 저항성이 있는 마킹 펜	VWR	103051-182	제조사: Leica
Clear Fingernail Polish			상점에서 구입한
콩고 레드 인디케이터 등급	VWR	AAAB24310-14	제조사: Alfa Aesar
Coomassie Blue	VWR	EM-3340	제조사: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)	Fisher Scientific	50 247 04	제조사: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold			3D 프린팅 사내
임베딩 금형(상업용)	전자 현미경 과학	70182
에탄올 200P	Decon Labs, Inc.	2701	univeristy biostores에서 구입
세밀한 팁 브러시			상점에서 구입, 페인트 브러시
Glass Coverslips 60x22mm	Fisher Scientific	12-519-21C
Glass Rehydration Mailer	Ted Pella	21043	20 슬라이드 메일러
Histoclear-II, 오렌지 오일 기반 청정제	Fisher Scientific	50 899 90150	제조사: National Diagnostics
Histosette, Embedding Casette	Fisher Scientific	15 182 701A
L-라이신 염산염	Fisher Scientific	BP386 100
로우 프로파일 마이크로톰 블레이드	Fisher Scientific	22 210 048	제조사: Sturkey
마이크로피펫	VWR	89080-004	프로모 팩
마이크로피펫 팁	댓글 섹션	보기 댓글 섹션	p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
마이크로톰	Fisher Scientific	905200U/00016050	모델: HM355S, 제조사: Microm, NON-CATALOG, 공급업체 카탈로그 # 905200U/00016050
포름알데히드, 37% 수성 (포르말린)	Ricca Chemical	RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (파라핀 왁스)	VWR	15159-486	제조사: McCormick Scientific
페트리 접시 광장 100x100x15mm	실험실 일회용 제품	D210-16
염화칼륨	EMD 화학	PX1405-1	인산염 완충 식염수의 성분, 사내에서 제조
인산칼륨	Fisher Scientific	P380-500	인산염 완충 식염수의 성분, 자체 준비
면도날	VWR	55411-050	유니버시티 바이오스토어에서 구매
슬라이드 워머	Fisher Scientific		NC0865259 NON-CATALOG, 공급업체 카탈로그 # 12857D
염화나트륨	VWR	0241-1KG	인산염 완충 식염수 성분, 자체 준비
인산나트륨	VWR	BDH9296.500	, 인산염 완충 식염수 성분, 자체 준비
Suprafrost 조직학 슬라이드	Fisher Scientific	12-544-2
조직 부양 수조	Fisher Scientific	NC0815797	제조사: Ted Pella, 공급업체 카탈로그 # 28156-B
자동 조직 처리기	Fisher Scientific	813160U/Q#00009061	모델: STP120 조직 처리기
트립톤	테크노바	T9012
효모 추출물	Teknova	Y9010