고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

Joshua T. Maxwell; Chin-Hsien Tsai; Tahmina A. Mohiuddin; Jennifer Q. Kwong

doi:10.3791/57225

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방법 논문

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

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DOI:

10.3791/57225

⸱

2018년 4월 27일

Joshua T. Maxwell¹ , Chin-Hsien Tsai¹ , Tahmina A. Mohiuddin² , Jennifer Q. Kwong¹

¹Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, ²Emory College of Arts and Sciences, Emory University

이 논문에서

요약

여기, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 유입의 측정에 대 한 두 개의 프로토콜을 제시. 고립 된 미토 콘 드리 아에 대 한 우리는 플레이트 리더 기반 Ca^{2 +} 가져오기 세부 분석 결과 사용 하 여 Ca^{2 +} 민감한 염색 칼슘 그린-5N. 경작된 한 세포에 대 한 우리 confocal 현미경 검사 법 방법 Ca^{2 +} 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 설명 합니다.

초록

캘리포니아^{2 +} 미토 콘 드리 아에 의해 처리 광범위 한 셀에서에서 생리 및 병 태 생리 과정을 조절 하는 중요 한 기능 이다. 정확 하 게 유입 및 캘리포니아^{2 +} 미토 콘 드리 아에서의 경과 측정 하는 능력은 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 이러한 프로세스에 처리의 역할을 결정 하기 위한 중요 합니다. 이 보고서에서 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아와 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 처리의 측정을 위한 두 가지 방법을 제시. 우리는 먼저 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 통풍 관은 Ca^{2 +} 민감한 염료 칼슘 그린-5N을 사용 하 여 측정 하기 위한 플레이트 리더 기반 플랫폼을 선발. 플레이트 리더 기반 형식 circumvents 특수 장비에 대 한 필요 그리고 칼슘 그린-5N 염료 측정 캘리포니아^{2 +} 절연된 조직 미토 콘 드리 아에서 적합. 우리의 응용 프로그램에 대 한 설명 통풍 관 Ca 미토 콘 드 리아^{2 +} 마우스 심 혼 직물;에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서의 측정 그러나,이 절차 간, 골격 근육, 뇌 등 다른 조직에서 격리 하는 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 이해 측정에 적용할 수 있습니다. 둘째, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아의^{2 +} permeabilized 셀 Ca^{2 +} 민감한 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 2 차원 레이저 스캔 현미경을 사용 하 여 이미징 측정 confocal 현미경 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 permeabilization 프로토콜 cytosolic 염료 오염, 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +}에서 변화의 특정 기록에 대 한 허용을 제거 합니다. 또한, 레이저 스캔 현미경 높은 프레임 속도를 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 다양 한 약물 이나 외부 솔루션에서 적용 시 약에 대 한 응답에서의 빠른 변화를 캡처 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 심장 myocytes 및 신경, 불멸 하 게 셀 선 등 1 차 셀을 포함 하 여 많은 세포 유형에 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 글귀를 측정에 적용할 수 있습니다.

서론

미토 콘 드리 아의 세포내 캘리포니아^{2 +} 저장과 신호 중요 한 사이트입니다. 연구의 십 년간은 미토 콘 드리 아를 가져오고 캘리포니아^{2 +} ¹^,²격리 능력을가지고 설명 했다. 그러나 미토 콘 드리 아,, 단지 수동 사이트의 캘리포니아^{2 +} 저장 되지 않습니다. 미토 콘 드 리아 구획에서 캘리포니아^{2 +} 대사 출력의 규칙을 포함 하 여 기본적인 신호 기능을 수행 하 고 있다 중재 미토 콘 드리 아 세포 죽음 통로의 활성화 검토 이전³. 신진 대사 조절에 대 한 캘리포니아^{2 +} 의 활동을 강화 3 매트릭스 지역화 dehydrogenases tricarboxylic 산 주기 뿐만 아니라 호흡 사슬 복합물, 미토 콘 드 리아 에너지 생산⁴^,^{5 증가}. 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 과부하 및 dysregulated 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 처리, 캘리포니아^{2 +} 트리거 미토 콘 드 리아 침투성 전환 기 미토 콘 드리 아 내 막 permeabilization, 선도 (MPTP) 오프닝 공 막 잠재적인 손실, 미토 콘 드 리아 기능 장애, 부 종, 파열 하 고 궁극적으로, 죽음⁶^,⁷^,^,⁸⁹셀. 따라서, 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 신호 직접 영향을 미칩니다 셀룰러 삶과 죽음 통로 통해 대사 제어 및 MPTP 죽음 축.

최근 몇 년 동안, 거기는 급속 하 게 확장에 따른 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 역학의 연구에 관심 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} uniporter 복잡 한의 분자 성분의 식별에 큰 부분, 미토 콘 드리 아 내 캘리포니아^{2 +} 의 기본 모드는 막 운송업 자 미토 콘 드 리아 매트릭스 ¹⁰^,^,¹¹¹²로 가져옵니다. 이러한 구조 및 규제 소 단위는 uniporter의의 앞뒤로 유전자 타겟팅 미토 콘 드리 아 기능 및 역 기능 변조를 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 유입의 가능성을 가져 신분증과의 연구를 촉진 합니다 uniporter 복잡 하 고 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 유입 질병¹³^,^,¹⁴¹⁵의 기여 금. 실제로, 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 신호는에 연루 되어 neurodegeneration, 그리고 암¹⁶^,^,¹⁷¹⁸^{, 심장 질환에서 배열 하는 질병의 다양 한 배열의 병 리} ¹⁹^,²⁰.

미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 신호 물질 대사와 세포 죽음의 근본적인 중요성을 감안할 때 및 생물 학적 시스템의 광범위 한 도달 범위와 함께 해당 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 신호 영향, 미토 콘 드 리아 Ca^{2 + 평가 하는 방법}큰 관심의 유입은. 아니나 다를까, 다양 한 기술 및 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 측정 도구 개발 되었습니다. 이러한 형광 캘리포니아^{2 +}같은 도구를 사용 하는 메서드가 포함-민감한 염료²¹^,²² 및 유전자 인코딩 캘리포니아^{2 +} 센서 미토 콘 드리 아, cameleon 및 aequorin²³^{, 등을 대상으로} ²⁴. 이 기사의 목적은 다른 방법 및 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 통풍 관 측정 될 수 있는 모델 시스템을 강조 하는. 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 유입 용량을 평가 하기 위해 두 가지 실험 방법을 제시. 예를 들어 심장 미토 콘 드리 아를 사용 하 여, 우리 플레이트 리더 기반 플랫폼 세부 측정 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 통풍 관을 사용 하 여 Ca^{2 +} 민감한 염색 칼슘 그린-5N 절연된 조직 미토 콘 드리 아^{14에 적합}. 경작된 한 NIH 3T3 세포를 사용 하 여, 우리 또한 confocal 현미경 이미징 기반 분석 결과 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 캘리포니아^{2 +} 민감한 염료 로드-2/오전²⁵를 사용 하 여 permeabilized 셀에서의 측정에 대 한 설명.

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프로토콜

이 프로토콜에서 설명 하는 모든 방법 기관 동물 관리 및 사용 위원회의에 모리 대학에 의해 승인 되었습니다가지고.

참고: 첫 번째 부분은 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 유입 플레이트 리더를 사용 하 여 격리 된 심장 미토 콘 드리 아에서 측정 하기 위한 실험 절차 이다.

1. 시 약 및 솔루션

미토 콘 드 리아 격리에 대 한 MS EGTA 버퍼의 500 mL 확인: 225 m m 마 니 톨, 75mm 자당, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 1 mM 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic 산 (EGTA), pH 7.4에 조정 와 코. 0.22 μ m 필터를 통해 그것을 소독 및 4 ° c.에 그것을 저장합니다 MS EGTA 버퍼 사용 하기 전에 4 ° C에 미리 냉장 인지 확인 합니다.
100 mL KCl 버퍼의 준비: 125 m m KCl, 20 mM HEPES, 1mm KH₂포₄, 2 mM MgCl₂, 40 μ EGTA 및 pH 7.2 코와 함께 조정. 실 온에서 보관 합니다.
디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 그린-5N 주식 1 m m 칼슘을 준비 합니다. 칼슘 그린-5N 주식 aliquotted 수 고-20 ° c.에 저장
캘리포니아^{2 +} 글귀 기판 준비.
1. 1 M 나트륨 pyruvate, pH 7.4 준비 합니다. -20 ° c.에 aliquots에 저장
2. 500 mM malate, pH 7.4 준비 합니다. -20 ° c.에 aliquots에 저장

2입니다. 심장 미토 콘 드리 아의 격리

기관 기준에 따라 마우스를 안락사
참고: 안락사의 우리의 제도 승인 방법, 마우스 isofluorane 흡입에 의해 취 되었고 자 궁 경부 전위에 의해 희생.
흉, 늑 골의 양쪽을 따라 절단, 측면에 서는 마음, 횡 경 막, 멀리 절단 열고 심장 조직을 절 개 하 여 마음을 수집 합니다.
참고:이 프로토콜에 미토 콘 드리 아 격리는 성인 마우스 (약 120 m g), 3-4 실험에 대 한 충분 한 되어야에서 수집 된 전체 마음에서 수행 됩니다. 간 등 다른 미토 콘 드리 아 풍부한 조직에서 미토 콘 드리 아 격리에 대 한 조직의 200mg까지 설명 하는 프로토콜에 따라 사용할 수 있습니다.
린스 차가운 1 x 인산 25 mL에 철저 하 게 조직 염 (PBS) 보장 모든 혈액은 심에서 압착 버퍼링.
참고: 마음 것입니다 될 충분히 씻어 서 심장에서 압착 하는 액체 실행 취소 될 때.
날카로운가 위를 사용 하 여 차가운 1 x PBS의 5 mL에 작은 조각으로 마음을 말하다.
PBS를 삭제 하 고 다진된 심장 조직의 0.10 0.15 m m의 허가 함께 미리 냉장된 7 mL 유리 테 플 론 dounce 균질 화기에 전송.
얼음 처럼 차가운 MS EGTA 버퍼의 5 mL을 추가 하 고 조직 조각 표시 (약 11 획) 더 이상 때까지 샘플을 균질.
참고: 않습니다 하지-균질 조직 손상과 기능 미토 콘 드리 아를 목표는.
15 mL 튜브에는 homogenate를 전송.
Homogenate 작은 핵 및 손상 되지 않은 세포를 5 분 동안 4 ° C에서 600 x g에서 원심
신선한 15 mL 튜브에는 상쾌한 전송 및 펠 렛의 미토 콘 드리 아를 10 분 동안 4 ° C에서 10000 x g에서 원심.
삭제는 상쾌한 고 얼음에 미토 콘 드리 아 펠 릿을 유지.
미토 콘 드리 아 펠 릿 차가운 MS EGTA 버퍼를 사용 하 여 두 번 씻는 다. 각 세척에 대 한 MS EGTA 버퍼의 5 mL에 미토 콘 드리 아 펠 릿을 resuspend 하 고 10 분, 4 ° C에서 10000 x g에서 원심은 상쾌한 삭제.
최종 세척 후 삭제는 상쾌한 고 얼음 차가운 MS EGTA 버퍼의 100 μ에는 미토 콘 드리 아를 resuspend. 얼음에 미토 콘 드리 아를 유지 합니다.
참고: 미토 콘 드리 아 실험 1 시간 이내에 사용 해야 합니다.
Bradford 단백질 분석 실험²⁶를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 단백질 농도 측정 합니다.

3. 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관의 플레이트 리더 기반 측정

참고: 여기, 그것은 설명 하는 프로토콜 분석 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 통풍 관 다중 플레이트 리더를 사용 하 여 인젝터를 장착. 어떤 칼슘 그린-5N 형광을 읽는 기능 리더 접시 (여기/방출 506/532 nm) 자동된 시 약으로 운동 모드에서 반응 빛 으로부터 보호를 유지 하는 인젝터를 사용할 수 있습니다.

플레이트 리더는 운동 수행을 칼슘 그린-5N 형광의 측정 1, 000의 총 시험 시간에 대 한 초당 읽기 프로그램 또한 s., 30에서 CaCl₂ 솔루션의 5 μ 분배 하 시 약 인젝터 프로그램 s 150 s, 300 s 480, 및 690 시간 포인트.
참고: CaCl₂ 주사의 타이밍 사용자 정의 그리고 실험 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
프라임 사용할 CaCl₂ 솔루션 시 인젝터.
참고: CaCl₂ 용액의 농도 사용자 정의 그리고 캘리포니아^{2 +} MPTP 열기를 실행 하는 데 필요한 금액을 적정 하 후속 실행에서 조정 될 수 있다.
미토 콘 드리 아의 200 μ g 96 잘 접시의 개별 음을 추가 합니다.
미토 콘 드리 아와 KCl 버퍼의 총 볼륨 197 μ에 오는 그런 잘 KCl 버퍼의 적절 한 볼륨을 추가 합니다.
1 M pyruvate의 1 μ 및 1 μ 500mm malate의 미토 콘 드리 아 혼합물에 추가 합니다. 피펫으로 부드럽게 혼합 하, 미토 콘 드리 아에 활성화 될 수 있도록 실내 온도에 2 분 동안 기판으로 미토 콘 드리 아를 품 어.
1mm 칼슘 그린-5N 주식의 1 μ를 추가 합니다. 부드럽게 pipetting으로 혼합.
참고: 칼슘 그린-5N 염료의 추가 따라 빛에서 반응을 보호 합니다.
미리 프로그램 된 운동 프로토콜 및 모니터 칼슘 그린-5N 형광을 시작 합니다.

4. 시 약 및 솔루션

참고: 두 번째 부분은 confocal 영상의 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 경작된 한 세포에 대 한 실험 절차

Tyrode의 솔루션 (130 mM NaCl, KCl 4mm, 2mm CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 m m 포도 당, 및 10 mM HEPES, 코와 pH 7.2)을 확인 합니다. 4 ° c.에 그것을 저장합니다 사용 하기 전에 실내 온도에 그것을 따뜻하게.
세척 솔루션 (100 mM 칼륨 아세테이트, 15 m KCl, 5mm KH₂포₄, 5 mM Mg-ATP, 0.35 m m EGTA, 0.12 m m CaCl₂, 0.75 m m MgCl₂, 10 m m phosphocreatine, 10 mM HEPES, 코와 pH 7.2 m)를 준비 합니다. 4 ° c.에 그것을 저장합니다 사용 하기 전에 실내 온도에 그것을 따뜻하게.
세척 솔루션에 0.005% 사포닌을 포함 하는 Permeabilization 솔루션을 준비 합니다. 그것은 신선한 매일을 준비 합니다.
0 준비 캘리포니아^{2 +} 내부 솔루션 (100 mM 칼륨 아세테이트, 15 m m KCl, 0.35 mM EGTA, 0.75 m m MgCl₂, 10 mM HEPES, pH 7.2 코와 조정). 4 ° c.에 그것을 저장합니다 사용 하기 전에 실내 온도에 그것을 따뜻하게.
포함 된 캘리포니아^{2 +}내부 솔루션을 준비 합니다. 무료 캘리포니아^{2 +}의 원하는 농도 도달 CaCl₂ 위의 내부 솔루션에 추가 합니다. CaCl₂ 추가 금액 MaxChelator 프로그램 (maxchelator.stanford.edu)를 사용 하 여 계산 됩니다.
1mm DMSO에 오전 로드-2 재고를 준비 하 고 사용까지-20 ° C에서 그것을 저장.
1mm MitoTracker DMSO에 녹색 재고를 준비 하 고 사용까지-20 ° C에서 그것을 저장.

5. 도금 셀 이미징에 대 한

22 x 22 cm² 유리 coverslips 100% 에탄올으로 세척 하 고 건조 공기를 coverslips 있습니다.
6 잘 조직 배양 접시의 개별 우물으로 유리 coverslips를 놓습니다.
참고: Coverslips laminin, 폴 리-L-리 신, 또는 유사한 매트릭스 셀 첨부 파일 홍보를 코팅 될 수 있습니다.
Trypsinize 및 이미징의 하루에 약 70% 합류를 목표로 하는 coverslips에 셀 접시.

6. 로드 로드-2/오전와 MitoTracker 그린 셀

로드-2/오전-MitoTracker 준비 작업 솔루션을 그린. 추가 로드-2/오전 1 m m 재고 20 μ의 MitoTracker 녹색 1 m m, 0.2 μ와 Tyrode의 솔루션의 1 mL에 20% pluronic F-127의 2.5 μ. 작업 솔루션에 로드 2의 최종 농도 20 µ M 이며 MitoTracker 녹색의 최종 농도 200 nM.
부드럽게는 coverslip에서 성장 매체를 제거 합니다.
참고: 세척 단계 염료 솔루션 추가 하기 전에 필요 하지 않습니다.
추가 로드-2/오전-MitoTracker는 coverslip 될 때까지 그냥 coverslip에 dropwise 패션에서 녹색 솔루션 적용 (coverslip 당 약 3-4 방울).
염료와 로드 셀 수 있도록 빛에서 보호 하는 실 온에서 30 분 동안 그것을 품 어.
드 로드-2/오전 esterify. 로드-2/오전-MitoTracker 제거 솔루션 그린 신선한 실내 온도 Tyrode 솔루션으로 대체 하 고 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 30 분 동안 품 어.

7. 미토 콘 드 리아 로드-2/오전 및 MitoTracker 녹색 형광의 confocal 영상

현미경 이미징 챔버는 coverslip 전송 하 고 세척 솔루션 챔버를 입력 합니다.
40 X에서 위상 대조에 세포 관찰에 대 한 설정 아래에서 셀 표시 될 때까지 및 초점에서 초점을 조정 합니다.
로드-2/오전-MitoTracker의 플라즈마 멤브레인 permeabilize 그린 로드 로드 cytosol 지역화-2, 미토 콘 드리 아 지역화 염료를 유지 하면서 제거 하는 세포.
1. coverslip에서 세척 솔루션을 제거 합니다.
2. 약 1 분 동안 Permeabilization 솔루션으로 교체 합니다.
3. Permeabilization 과정을 통해 플라즈마 멤브레인 형태는 시각적으로 모니터링 합니다. Permeabilized 셀 roughened 표면을 개발할 것입니다.
4. Permeabilization 완료 되 면 즉시 Permeabilization 솔루션을 제거 하 고 0 캘리포니아^{2 +} 내부 솔루션 그것을 바꿉니다.
동시에 이미지 로드 2 형광 (여기 559 nm 레이저 라인 및 방출 575-675 nm 사이의 파장에서 수집 된를 사용 하 여) 및 MitoTracker 녹색 형광 (여기 488nm 레이저 라인 방출 파장 사이 수집 된를 사용 하 여 505-525 nm). 로드-2와 MitoTracker 녹색의 명확한 colocalization를 표시 하는 permeabilized 세포에 초점.
현미경 레이저를 감소 하 고 미토 콘 드리 아 로드 2 형광 희미 하 고 그냥 표시 되도록 설정을 얻을.
특정 응용 프로그램의 적절 한 프레임 속도 및 시간 과정에 2 차원 검사를 얻으려고 현미경 설정을 선택 합니다. 적어도 30 프레임/s의 프레임 속도 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +}에서 변화의 속도 정확 하 게 캡처 하는 것이 좋습니다.
제거 0 캘리포니아^{2 +} 내부 솔루션 셀 또는 현미경의 초점을 방해 하지 않고.
이미지 수집을 시작 합니다.
캘리포니아^{2 +}추가-10 s 시간에 충만 내부 솔루션 포인트 수동으로 또는 관류 시스템.
관심 (ROIs) 미토 콘 드 리아 로드-2와 MitoTracker 녹색 신호는 이미지 수집 소프트웨어에서 사이 colocalization의 영역을 포괄 하는 영역을 선택 합니다.
참고: 기록의 각 시간 지점에 대 한 임의의 형광 (F) 값 각 투자 수익에 대 한 얻을 수 있습니다. 이 값은 배경 빼고 하 고 (Ca^{2 +} 추가; 이전 초기 형광으로 정규화 F₀) 데이터 프레 젠 테이 션 및 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +}의 변화의 진폭의 정량화에 대 한 시간이 지남에 F/F₀ 으로 표시 되 고.

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결과

그림 1 에서는 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 통풍 관 측정 플레이트 리더 기반 플랫폼을 사용 하 여 격리 된 심장 미토 콘 드리 아 그리고 캘리포니아^{2 +} 염색 칼슘 그린-5N. 조건 제어 (그림 1A), 심장 미토 콘 드리 아 칼슘 그린-5N 포함 된 KCl 버퍼에 중단 되었고 30에 추가 하는 CaCl₂ (0.6 m m CaCl₂ 솔루션의 5 μ)의 순차적 펄스 다음 도전 s 150 s, 300 s, 480 s, 그리고 690 시간 포인트입니다. 타이밍 및 CaCl₂ 추가의 수의 추가 Ca^{2 +} 후속 추가 하기 전에 완전 한 미토 콘 드리 아 이해에 대 한 수 있도록 사용자가 조정할 수 있습니다. 이 분석 결과에서 칼슘 그린-5N 신호 증가...

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토론

여기, 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 유입 측정 하 두 가지 다른 방법을 설명 합니다. 플레이트 리더 기반 칼슘 그린-5N 방법 모니터 extramitochondrial Ca^{2 +} 레벨 이며는 Ca^{2 +} 이해 분석 결과 고립 된 미토 콘 드리 아에서의 측정에 적합 하다. 우리가 고립 된 murine 심장 미토 콘 드리 아에서 대표적인 결과 표시는,이 분석 결과 높은 미토 콘 드 리아 풍부한 간, 골격 근육 및 두뇌를 포함 하 여 조직에서 격리 하는 미토 콘 드리 아에 대 한 쉽게 적용할 수 있습니다. 또한, 플레이트 리더 시스템 실험실 어디 캘리포니아^{2 +} 측정, fluorometers, 같은 전통적으로 사용 하는 특수 장비 즉시 사용할 수 있습니다 되지 않을 수 있습니다에 대 한 이상적인 옵션이 있을 수 있습니다. 그러나 플레이트 리더를 검색할 수 있습니다 및 필요 시 추가 사전 프로그램이 기술의 약점을 있을 수 있습니다 제한 된 최대 시간 범위...

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공개 사항

저자 아무 공개 보고 있다.

감사의 글

이 작품 교부 미국 심장 협회 (J.Q.K.)에서 지원 했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호
올림푸스 FV1000 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	올림푸스	FV1000
Synergy Neo2 인젝터가 있는 다중 모드 마이크로플레이트 리더	Biotek
조직 균질화기	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm 커버슬립	Corning	2850-22
96 웰 플레이트	Corning	3628
6 웰 플레이트	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker, green, FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM,	Invitrogen	R1244
DMSO, Invitrogen		D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	시그마	M9546
자당	EMD 밀리포어	8510
HEPES	시그마	H3375
EGTA	시그마	E8145
염화칼	Fisher	BP366-500
인산칼륨 일염기	성 시그마	P0662
염화마그네슘	시그마	M2670
피루브산 나트륨	시그마	P2256
L-말산	시그마	M1125
염화칼슘	시그마	C4901
아세트산 칼	피셔	BP364-500
아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 마그네슘 염	시그마	A9187
포스포크레아틴 디소듐 염	시그마	P7936
사포닌	시그마	S7900
Ru360	Calbiochem	557440

, , , , , , , , , , , 륨 륨

참고문헌

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고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

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