고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

요약

여기, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 유입의 측정에 대 한 두 개의 프로토콜을 제시. 고립 된 미토 콘 드리 아에 대 한 우리는 플레이트 리더 기반 Ca^{2 +} 가져오기 세부 분석 결과 사용 하 여 Ca^{2 +} 민감한 염색 칼슘 그린-5N. 경작된 한 세포에 대 한 우리 confocal 현미경 검사 법 방법 Ca^{2 +} 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 설명 합니다.

초록

캘리포니아^{2 +} 미토 콘 드리 아에 의해 처리 광범위 한 셀에서에서 생리 및 병 태 생리 과정을 조절 하는 중요 한 기능 이다. 정확 하 게 유입 및 캘리포니아^{2 +} 미토 콘 드리 아에서의 경과 측정 하는 능력은 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 이러한 프로세스에 처리의 역할을 결정 하기 위한 중요 합니다. 이 보고서에서 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아와 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 처리의 측정을 위한 두 가지 방법을 제시. 우리는 먼저 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 통풍 관은 Ca^{2 +} 민감한 염료 칼슘 그린-5N을 사용 하 여 측정 하기 위한 플레이트 리더 기반 플랫폼을 선발. 플레이트 리더 기반 형식 circumvents 특수 장비에 대 한 필요 그리고 칼슘 그린-5N 염료 측정 캘리포니아^{2 +} 절연된 조직 미토 콘 드리 아에서 적합. 우리의 응용 프로그램에 대 한 설명 통풍 관 Ca 미토 콘 드 리아^{2 +} 마우스 심 혼 직물;에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서의 측정 그러나,이 절차 간, 골격 근육, 뇌 등 다른 조직에서 격리 하는 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 이해 측정에 적용할 수 있습니다. 둘째, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아의^{2 +} permeabilized 셀 Ca^{2 +} 민감한 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 2 차원 레이저 스캔 현미경을 사용 하 여 이미징 측정 confocal 현미경 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 permeabilization 프로토콜 cytosolic 염료 오염, 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +}에서 변화의 특정 기록에 대 한 허용을 제거 합니다. 또한, 레이저 스캔 현미경 높은 프레임 속도를 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 다양 한 약물 이나 외부 솔루션에서 적용 시 약에 대 한 응답에서의 빠른 변화를 캡처 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 심장 myocytes 및 신경, 불멸 하 게 셀 선 등 1 차 셀을 포함 하 여 많은 세포 유형에 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 글귀를 측정에 적용할 수 있습니다.

서론

미토 콘 드리 아의 세포내 캘리포니아^{2 +} 저장과 신호 중요 한 사이트입니다. 연구의 십 년간은 미토 콘 드리 아를 가져오고 캘리포니아^{2 + 1,2}격리 능력을가지고 설명 했다. 그러나 미토 콘 드리 아,, 단지 수동 사이트의 캘리포니아^{2 +} 저장 되지 않습니다. 미토 콘 드 리아 구획에서 캘리포니아^{2 +} 대사 출력의 규칙을 포함 하 여 기본적인 신호 기능을 수행 하 고 있다 중재 미토 콘 드리 아 세포 죽음 통로의 활성화 검토 이전³. 신진 대사 조절에 대 한 캘리포니아^{2 +} 의 활동을 강화 3 매트릭스 지역화 dehydrogenases tricarboxylic 산 주기 뿐만 아니라 호흡 사슬 복합물, 미토 콘 드 리아 에너지 생산^{4,5 증가} . 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 과부하 및 dysregulated 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 처리, 캘리포니아^{2 +} 트리거 미토 콘 ....

프로토콜

이 프로토콜에서 설명 하는 모든 방법 기관 동물 관리 및 사용 위원회의에 모리 대학에 의해 승인 되었습니다가지고.

참고: 첫 번째 부분은 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 유입 플레이트 리더를 사용 하 여 격리 된 심장 미토 콘 드리 아에서 측정 하기 위한 실험 절차 이다.

1. 시 약 및 솔루션

1. 미토 콘 드 리아 격리에 대 한 MS EGTA 버퍼의 500 mL 확인: 225 m m 마 니 톨, 75mm 자당, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 1 mM 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic 산 (EGTA), pH 7.4에 조정 와 코. 0.22 μ m 필터를 통해 그것을 소독 및 4 ° c.에 그것을 저장합니다 MS EGTA 버퍼 사용 하기 전에 4 ° C에 미리 냉장 인지 확인 합니다.
2. 100 mL KCl 버퍼의 준비: 125 m m KCl, 20 mM HEPES, 1mm KH₂포₄, 2 mM MgCl₂, 40 μ EGTA 및 pH 7.2 ....

결과

그림 1 에서는 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 통풍 관 측정 플레이트 리더 기반 플랫폼을 사용 하 여 격리 된 심장 미토 콘 드리 아 그리고 캘리포니아^{2 +} 염색 칼슘 그린-5N. 조건 제어 (그림 1A), 심장 미토 콘 드리 아 칼슘 그린-5N 포함 된 KCl 버퍼에 중단 되었고 30에 추가 하는 CaCl₂ (0.6 m m CaCl₂ 솔루션의 5 μ)의 순차적 펄스 다음 도전 s 150 s, 300 s, 480 s, 그리고 690 시간 포인트입니다. 타이밍 및 CaCl₂ 추가의 수의 추가 Ca^{2 +} 후속 추가 하기 전에 완전 한 미토 콘 드리 아 이해에 대 한 수 있도록 사용자가 조정할 수 있습니다. 이 분석 결과에서 칼슘 그린-5N 신호 증가.......

토론

여기, 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 유입 측정 하 두 가지 다른 방법을 설명 합니다. 플레이트 리더 기반 칼슘 그린-5N 방법 모니터 extramitochondrial Ca^{2 +} 레벨 이며는 Ca^{2 +} 이해 분석 결과 고립 된 미토 콘 드리 아에서의 측정에 적합 하다. 우리가 고립 된 murine 심장 미토 콘 드리 아에서 대표적인 결과 표시는,이 분석 결과 높은 미토 콘 드 리아 풍부한 간, 골격 근육 및 두뇌를 포함 하 여 조직에서 격리 하는 미토 콘 드리 아에 대 한 쉽게 적용할 수 있습니다. 또한, 플레이트 리더 시스템 실험실 어디 캘리포니아^{2 +} 측정, fluorometers, 같은 전통적으로 사용 하는 특수 장비 즉시 사용할 수 있습니다 되지 않을 수 있습니다에 대 한 이상적인 옵션이 있을 수 있습니다. 그러나 플레이트 리더를 검색할 수 있습니다 및 필요 시 추가 사전 프로그램이 기술의 약점을 있을 수 있습니다 제한 된 최대 시간 범위.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
올림푸스 FV1000 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	올림푸스	FV1000
Synergy Neo2 인젝터가 있는 다중 모드 마이크로플레이트 리더	Biotek
조직 균질화기	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm 커버슬립	Corning	2850-22
96 웰 플레이트	Corning	3628
6 웰 플레이트	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker, green, FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM,	Invitrogen	R1244
DMSO, Invitrogen		D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	시그마	M9546
자당	EMD 밀리포어	8510
HEPES	시그마	H3375
EGTA	시그마	E8145
염화칼	Fisher	BP366-500
인산칼륨 일염기	성 시그마	P0662
염화마그네슘	시그마	M2670
피루브산 나트륨	시그마	P2256
L-말산	시그마	M1125
염화칼슘	시그마	C4901
아세트산 칼	피셔	BP364-500
아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 마그네슘 염	시그마	A9187
포스포크레아틴 디소듐 염	시그마	P7936
사포닌	시그마	S7900
Ru360	Calbiochem	557440

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