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방법 논문

혀 기질과 혀 편평 세포 암 종에서 생체 외에서 의 재구성의 제조

5.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57235

⸱

2018년 6월 20일

 ,  , 
1Key Laboratory of Gene Engineering of the Ministry of Education, State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

이 논문에서

요약

메서드는 효율적인 decellularization와 혀 세포 외 매트릭스 (가장)의 준비에 대 한 여기 표시 됩니다. 가장 정적 또는 흔들 문화 조건 하에서 혀 편평 세포 암 종 (TSCC) 모델의 재구성 기능 건설 기계로 사용할 수 있습니다.

초록

혀 편평 세포 암 (TSCC) 시험관에대 한 효과적이 고 현실적인 모델을 생성 하기 위해 방법은 생산 decellularized 혀 기질 (가장) TSCC 건설 기능 건설 기계를 제공 하 게 만들어졌습니다. 가장 세포 성장, 감 별 법 및 셀 마이그레이션에 대 한 생체 외에서 틈새를 제공합니다. 원시 세포 외 기질 (ECM) 및 decellularized 매트릭스에 유지 하는 생 화 확 적인 작곡의 마이크로 구조 정박 하는 셀에 대 한 조직의 특정 틈새를 제공 합니다. 가장의 제조 deoxyribonuclease (DNase) 소화 유기 또는 무기 전처리의 심각한 동반에 의해 실현 될 수 있다. 이 프로토콜은 운영 하 게 쉬운 하 고는 decellularization에 대 한 높은 효율을 보장. 가장 TSCC 모델의 건설을 가능 하 게 TSCC 셀 정적 또는 흔들 문화 조건에 대 한 유리한 cytocompatibility를 보여주었다. 스스로 만든된 생물 세포 배양에 대 한 영구 촉발된 조건 또한 사용 되었다. 가장을 사용 하 여 복원된 TSCC 보여주었다 임상 TSCC histopathology, 닮은 속성과 특성 TSCC 연구 잠재력을 제안.

서론

혀는 deglutition, 조음, 시음 등 다양 한 중요 한 기능이 있다. 따라서, 혀 기능 장애 환자 들의 삶의 질1에 큰 영향을가지고. 구강에서 가장 일반적인 악성 종양은 혀 편평 세포 암 종 (TSCC), 일반적으로 알코올 음료 또는 담배2를 연기 하는 사람에서 생기는.

최근 몇 년 동안, 작은 진행 TSCC에 기초 연구에 달성 되었습니다. 효율적인 생체 외에서 연구의 부족 모델 가장 큰 문제 중 하나 남아 있다. 따라서, 기질 (ECM) 잠재적인 솔루션으로 밖으로 변합니다. ECM 고도로 조직된 매트릭스 구성 요소 구성 하는 복잡 한 네트워크 프레임 이기 때문에, 비 계 재료는 ECM 같은 구조와 구성 암 연구에 대 한 능력이 될 것 이다. Decellularized ECM는 같은 기원에 생체 외에서ECM의 가장 중요 한 이점을 밝혀에서 셀에 대 한 완벽 하 게 틈새를 제공할 수 있습니다.

ECM 세제와 효소를 사용 하 여 decellularization 통해 조직에서 제거 되는 세포 구성 성분으로 유지 될 수 있습니다. Decellularized 매트릭스의 콜라겐, fibronectin, 및 laminin를 포함 하 여 다양 한 ECM 구성 요소, 배양된 세포 생존, 확산, 그리고 셀3의 홍보에 대 한 기본-조직-같은 microenvironment을 제공 합니다. 또한,이 식 위한 immunogenicity ECM에 세포 구성 성분의 부재와 함께 최소한의 수준으로 줄일 수 있습니다.

지금까지, decellularized ECM에 대 한 제작 방법은 다른 조직 및 장기 심장4,5,,67년 간8,9,10 등에서 시도 되었습니다. ,11, 폐12,13,14,15,,1617및 신장18,19 , 그러나 20., 관련 연구 우리의 지식 최선 다 해 혀에서 비슷한 작품에서 찾을 수 있다.

이 연구에서는 decellularized 혀 기질 (가장) 물리, 화학, 및 효소 치료의 일련에 의해 효율적으로 그리고 싸게 조작 했다. 다음은 가장 TSCC 동작 및 개발에 대 한 적절 한 시뮬레이션을 보여주는 TSCC에서 생체 외에서정리에 사용 되었다. 가장 좋은 생체 적합성으로 가장 TSCC 연구3큰 잠재력을 가질 수 있음을 나타내는 조직-특정 틈새에 셀 가이드 수 있다. 여기에 표시 된 프로토콜 연구자 중 병 또는 TSCC의 임상 치료에 대 한 선택을 제공 합니다.

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프로토콜

모든 동물 작업 동물 복지 행위, 기관 지침에 따라 수행 되었고 기관 동물 관리 및 사용 위원회, 썬 얏-센 대학교에 의해 승인.

1입니다. 준비 편

  1. 자 궁 경부 전위에 의해 마우스를 실행 하 고 방언 무 균 수술가 위 핀셋을 사용 하 여 제거.
  2. 3 분, 75% 에탄올에 방언 담가 다음 1.5 mL으로 각 혀를 넣어 10 mM 멸 균 인산 염의 1 mL Eppendorf (EP) 튜브 버퍼링 솔루션 (PBS).
    참고: 다음의 모든 단계에서 PBS의 농도이 단계에서 농도와 동일.
  3. 동결 해 동 하 여 세포를 세포: 1 h-80 ° C에서 EP 튜브에 혀를 동결 하 고 다음 3 사이클에 대 일 분 동안 실내 온도에 혀를 녹여.
  4. 수술 봉합 수술 바늘을 사용 하 여의 조각에 각 혀를 로드 하 고 메 마른 은박지의 작은 조각으로 봉합의 끝을 포장. 무 균 조건에서 75% 에탄올을 포함 하는 3.5 cm 또는 6 cm 문화 접시에 작업을 수행 합니다.
    참고: 외과 봉합의 각 작품의 적절 한 길이 약 20cm, 그리고 각 조각의 은박지의 적절 한 크기에 대해 0.3 cm2 (1 c m × 0.3 c m). 혀는 은박지 근처 로드 합니다.
  5. 30 미 수행 무 균 조건에서이 작업에 대 한 살 균 PBS의 3 mL와 함께 각 혀 3.5 cm 또는 6 cm 문화 접시에 린스.
  6. 씻어 초순와 방언: 90 µ g/mL의 최종 농도에 불 임 초순의 250 mL 넓은 입 병에 ampicilin를 추가. 방언을 저 어 bar가 포함 된 병에 넣습니다. 병 밖에 남아 있는 봉합의 일부와 병 뚜껑을 조입니다. 무 균 조건에서이 작업을 수행 합니다.
    참고: 5 방언까지 놓일 수 있다 봉합의 twining 고려 같은 병에. 석 박 혀 떨어져 미 끄 러에서 방지 하기 위해 병에 봉합의 끝 이다. 혀는 병 안에 남아 있는 봉합의 길이 조정 하 여 2cm 높은 병의 하단에서 배치 되어야 합니다. 이 노트 1.8, 1.10, 1.12, 및 1.16 단계 이기도합니다.
  7. 12 h에 대 한 자력에 병을 넣어.
  8. NaCl와 방언 세척: 살 균 1의 250 mL 넓은 입 병에 ampicilin를 추가 M NaCl 90 µ g/mL의 최종 농도에. 병에는 방언과 볶음 바를 이동 합니다. 병 밖에 남아 있는 봉합의 일부와 병 뚜껑을 조입니다. 무 균 조건에서이 작업을 수행 합니다.
  9. 24 h에 대 한 자력에 병을 넣어.
  10. 트라이 톤 X-100 여 세포 세포: 살 균 2%의 250 mL와 함께 넓은 입 병에 90 µ g/mL의 최종 농도에 ampicilin를 추가 PBS에 트라이 톤 X-100. 병에는 방언과 볶음 바를 이동 합니다. 병 밖에 남아 있는 봉합의 일부와 병 뚜껑을 조입니다. 무 균 조건에서이 작업을 수행 합니다.
  11. 48 h에 대 한 자력에 병을 넣어.
  12. 씻어 CaCl2/MgCl2방언: 90 µ g/mL의 최종 농도에 살 균 5 m m CaCl2/MgCl2 의 250 mL 넓은 입 병에 ampicilin를 추가. 병에는 방언과 볶음 바를 이동 합니다. 병 밖에 남아 있는 봉합의 일부와 병 뚜껑을 조입니다. 무 균 조건에서이 작업을 수행 합니다.
  13. 24 h에 대 한 자력에 병을 넣어.
  14. 소화 DNase에 의해: 행 크의의 1 mL 균형 소금물 (HBSS) 각 EP 튜브를 추가. 각각 300의 최종 농도에 DNase HBSS로 추가 µ M.에 각 EP 튜브는 튜브 외부 봉합 부분의 각 혀 이동. 무 균 조건에서이 작업을 수행 합니다.
    참고: 이전 단계에서 병 안에 남아 있는 봉합의 일부도이 단계에서 EP 튜브 안에 남아 있는지 확인 하 고 이전 단계에서 병 밖에 남아 있는 봉합의 일부도이 단계에서 EP 튜브 밖에 남아 있다 다는 것을 확인 한다.
  15. 24 h에 대 한 37 ° C에서 EP 튜브에 혀를 품 어.
  16. 씻어 PBS 가진 방언: 90 µ g/mL의 최종 농도에 살 균 PBS의 250 mL 넓은 입 병에 ampicilin를 추가. 병에는 방언과 볶음 바를 이동 합니다. 병 밖에 남아 있는 봉합의 일부와 병 뚜껑을 조입니다. 무 균 조건에서이 작업을 수행 합니다.
  17. 24 h에 대 한 자력에 병을 넣어.
  18. 사용까지 준비 편 4 ° C에서 살 균 PBS에 저장 합니다.

2. TSCC의 3 차원 (3D) 재구성

  1. 정적 TSCC 모델 건설
    1. 씨 1.0 x 106 단일 TSCC 셀 (Cal27) 3.5 c m 문화 접시에. Dulbecco의의 3 mL 수정 독수리의 매체/F12 (DF12) 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 90 µ g/mL ampicilin, 및 90 µ g/mL 대 추가 합니다.
    2. 2 ~ 3 일 동안 37 ° C에서 Cal27 셀 문화. 셀 60% 이상 커버 있는지 확인 접시 바닥의 지역.
    3. 문화 접시에 Cal27 단층에 가장을 로드 합니다.
    4. 28 일 동안 37 ° C에서 CO2 인큐베이터에 접시를 넣어.
    5. 셀 문화 과정 매일 문화 매체를 새로 고칩니다. 인큐베이터에서 CO2 농도 5% 이다.
  2. 흔들된 TSCC 모델 건설
    1. 성가 냈다 minibioreactor의 준비
      1. 10 mL 주사기에서 플런저를 꺼내.
      2. 막대의 낮은 터미널 근처 구멍 (직경 1 ㎝)를 파고 및 구멍에 저 어 바 로드.
      3. 플라스틱 넓은 입 병의 병 뚜껑의 중앙에 구멍 (직경 0.5 c m)를 파고 및 뚜껑을 통해 피스톤 막대를 넣어.
      4. 50 mL 원심 분리기 튜브의 절반을 잘라 고 병 뚜껑의 외부 측면에 용접.
      5. fishhooks에 묶여있다는 낚시 라인 막대 여 fishhooks 막대를 연결 합니다.
        참고: 4 fishhooks까지 장착할 수 막대에.
      6. 압력솥 사용 하기 전에 스스로 만든된 복잡 한입니다.
        참고: 플라스틱 넓은 입 병 압력솥 하지를 않습니다. 새로운 살 균 플라스틱 넓은 입 병을 사용 하 여 세포를 배양 하는 동안.
  3. 동적 세포 배양
    1. 씨 1.0 x 106 단일 Cal27 셀 성가 minibioreactor에. 10 %FBS, 90 µ g/mL ampicilin, 및 90 µ g/mL 대 포함 된 DF12 매체의 150 mL를 추가 합니다.
    2. 막대에 연결 된 fishhooks를 사용 하 여 minibioreactor에 가장을 로드 합니다.
    3. 병 뚜껑을 강화 하 고는 자력에 minibioreactor를 넣어. 7 ~ 14 일 동안 37 ° C에서 CO2 배양 기에서 200 rpm에서 minibioreactor를 활성화 합니다.
      참고: CO2 배양 기에서 CO2 의 농도 5%.

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결과

이 프로토콜의 가장 준비에 대 한 효율적이 고 적절 한 것으로 판명. 가장 완벽 한 decellularization 국어 조직 비교 했다. Decellularization의 효능 hematoxylin-오신 (그) (그림 1A-B) 얼룩에 의해 확인 되었다. 그 결과 얼룩 가장 (그림 1B)에서 핵 얼룩의 완전 한 실종을 밝혔다. 또한, 이전 작품에서 DNA 콘텐츠 정량화가 보여주었다 DNA 가장3에서 거의 완전히 제거 되었다. 이 프로토콜도 셀 구성 (그림 1B)를 제거 하는 동안 조직의 무결성에 드문 손상을 보여주었다.

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토론

Decellularized ECM 제조에 잘 설립 프로토콜 조직에서 세포 구성 요소를 제거 하는 동안 네이티브 ECM 구성 유지 한다 거의 완전 하 게21. 현재 보고 된 decellularization 프로토콜 대류 수송에 의해 세포 물질을 제거 하는 맥 관 구조를 통해 관류를 요구 하는에 불구 하 고 기계적인 동요 채택 되었다 여기, 전통적인 간단 하 고 저렴 한 방법22 로 알려진 , 23 , 24 , 25 , 26. 또한, 이후 혀 lingualis에서 풍부 하 고 몇 가지 큰 혈관 혈관에는,이 프로토콜은 위에서 설명한 다른 프로토콜 보다 혀 조직에 더 적합.

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 자연 과학 재단의 중국 국가 (31371390), 상태-첨단 개발 프로젝트 (2014AA020702)의 프로그램 및 광 과학 및 기술 (2016B030231001)의 프로그램에서 연구 보조금의 지원을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C57-BL/6J 마우스Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
에탄올광저우 화학 시약 공장HB15-GR-2.5L
염화나트륨Sangon BiotechA501218
염화칼Sangon BiotechA100395
이염기성 인산나트륨광저우 화학 시약 공장BE14-GR-500G
인산칼륨 모노베이직 Sangon BiotechA501211
1.5 mL EP 튜브AxygenMCT-150-A
초저온 냉동고 Thermo Fisher Scientific
3.5cm 세포 배양 접시Thermo Fisher Scientific153066
6cm 세포 배양 접시Greiner628160
Triton X-100Sigma-AldrichV900502
염화칼슘Sigma-Aldrich746495
염화마그네슘Sigma-Aldrich449164
DNase시그마-알드리치D5025
마그네슘 황산염산곤 생명공학A601988
포도당시그마-알드리치158968
중탄산나트륨시그마-알드리치S5761
암피실린시그마-알드리치A9393
카나마이신시그마-알드리치PHR1487
외과용 봉합Shanghai Jinhuan
250 mL Wide mouth bottleSHUNIU1407
Magnetic stirrerAS ONE1-4602-32
CO2 인큐베이터SHEL LABSCO5A
10 mL 주사기Hunan Pingan
50 mL 원심분리기 튜브Greiner227270
Cal27 세포중국과학원, 상하이 세포은행혀 편평세포 암종 세포주
U2OS 세포중국과학원, 상하이 세포은행인간 골육종 세포주
DMEM/F12시그마-알드리치D0547
피루브산나트륨시그마-알드리치P5280
헤페스 유리산BBI
FBS하이클론SH30084.03
4 ° C 냉장고하이얼
정수기ELGA
혈구계BLAU717805
륨 사 A600264

참고문헌

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  16. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
  17. Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
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  19. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
  20. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  21. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
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  23. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
  24. Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
  25. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
  26. Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).

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