혀 기질과 혀 편평 세포 암 종에서 생체 외에서 의 재구성의 제조

요약

메서드는 효율적인 decellularization와 혀 세포 외 매트릭스 (가장)의 준비에 대 한 여기 표시 됩니다. 가장 정적 또는 흔들 문화 조건 하에서 혀 편평 세포 암 종 (TSCC) 모델의 재구성 기능 건설 기계로 사용할 수 있습니다.

초록

혀 편평 세포 암 (TSCC) 시험관에대 한 효과적이 고 현실적인 모델을 생성 하기 위해 방법은 생산 decellularized 혀 기질 (가장) TSCC 건설 기능 건설 기계를 제공 하 게 만들어졌습니다. 가장 세포 성장, 감 별 법 및 셀 마이그레이션에 대 한 생체 외에서 틈새를 제공합니다. 원시 세포 외 기질 (ECM) 및 decellularized 매트릭스에 유지 하는 생 화 확 적인 작곡의 마이크로 구조 정박 하는 셀에 대 한 조직의 특정 틈새를 제공 합니다. 가장의 제조 deoxyribonuclease (DNase) 소화 유기 또는 무기 전처리의 심각한 동반에 의해 실현 될 수 있다. 이 프로토콜은 운영 하 게 쉬운 하 고는 decellularization에 대 한 높은 효율을 보장. 가장 TSCC 모델의 건설을 가능 하 게 TSCC 셀 정적 또는 흔들 문화 조건에 대 한 유리한 cytocompatibility를 보여주었다. 스스로 만든된 생물 세포 배양에 대 한 영구 촉발된 조건 또한 사용 되었다. 가장을 사용 하 여 복원된 TSCC 보여주었다 임상 TSCC histopathology, 닮은 속성과 특성 TSCC 연구 잠재력을 제안.

서론

혀는 deglutition, 조음, 시음 등 다양 한 중요 한 기능이 있다. 따라서, 혀 기능 장애 환자 들의 삶의 질¹에 큰 영향을가지고. 구강에서 가장 일반적인 악성 종양은 혀 편평 세포 암 종 (TSCC), 일반적으로 알코올 음료 또는 담배²를 연기 하는 사람에서 생기는.

최근 몇 년 동안, 작은 진행 TSCC에 기초 연구에 달성 되었습니다. 효율적인 생체 외에서 연구의 부족 모델 가장 큰 문제 중 하나 남아 있다. 따라서, 기질 (ECM) 잠재적인 솔루션으로 밖으로 변합니다. ECM 고도로 조직된 매트릭스 구성 요소 구성 하는 복잡 한 네트워크 프레임 이기 때문에, 비 계 재료는 ECM 같은 구조와 구성 암 연구에 대 한 능력이 될 것 이다. Decellularized ECM는 같은 기원에 생체 외에서ECM의 가장 중요 한 이점을 밝혀에서 셀에 대 한 완벽 하 게 틈새를 제공할 수 있습니다.

ECM 세제와 효소를 사용 하 여 decellularization 통해 조직에서 제거 되는 세포 구성 성분으로 유지 될 수 있습니다. Decellularized 매트릭스의 콜라겐, ....

프로토콜

모든 동물 작업 동물 복지 행위, 기관 지침에 따라 수행 되었고 기관 동물 관리 및 사용 위원회, 썬 얏-센 대학교에 의해 승인.

1입니다. 준비 편

1. 자 궁 경부 전위에 의해 마우스를 실행 하 고 방언 무 균 수술가 위 핀셋을 사용 하 여 제거.
2. 3 분, 75% 에탄올에 방언 담가 다음 1.5 mL으로 각 혀를 넣어 10 mM 멸 균 인산 염의 1 mL Eppendorf (EP) 튜브 버퍼링 솔루션 (PBS).
   참고: 다음의 모든 단계에서 PBS의 농도이 단계에서 농도와 동일.
3. 동결 해 동 하 여 세포를 세포: 1 h-80 ° C에서 EP 튜브에 혀를 동결 하 고 다음 3 사이클에 대 일 분 동안 실내 온도에 혀를 녹여.
4. 수술 봉합 수술 바늘을 사용 하 여의 조각에 각 혀를 로드 하 고 메 마른 은박지의 작은 조각으로 봉합의 끝을 포장. 무 균 조건에서 75% 에탄올을 포함 하는 3.5 cm 또는 6 cm 문화 접시에 작업을 수행 합니다.
   참고: 외과 봉합의 각 작품의 적절 한 길이 약 20cm, 그리고 각 조각의 은박지의 적절 한 크기에 대해 0.3 cm² (1 c m × 0.3 c m). 혀는 은박지 근처 로드 합니다.
5. ....

결과

이 프로토콜의 가장 준비에 대 한 효율적이 고 적절 한 것으로 판명. 가장 완벽 한 decellularization 국어 조직 비교 했다. Decellularization의 효능 hematoxylin-오신 (그) (그림 1A-B) 얼룩에 의해 확인 되었다. 그 결과 얼룩 가장 (그림 1B)에서 핵 얼룩의 완전 한 실종을 밝혔다. 또한, 이전 작품에서 DNA 콘텐츠 정량화가 보여주었다 DNA 가장³에서 거의 완전히 제거 되었다. 이 프로토콜도 셀 구성 (그림 1B)를 제거 하는 동안 조직의 무결성에 드문 손상을 보여주었다.

토론

Decellularized ECM 제조에 잘 설립 프로토콜 조직에서 세포 구성 요소를 제거 하는 동안 네이티브 ECM 구성 유지 한다 거의 완전 하 게²¹. 현재 보고 된 decellularization 프로토콜 대류 수송에 의해 세포 물질을 제거 하는 맥 관 구조를 통해 관류를 요구 하는에 불구 하 고 기계적인 동요 채택 되었다 여기, 전통적인 간단 하 고 저렴 한 방법²² 로 알려진 ^{, 23 , 24 , 25 , 26}. 또한, 이후 혀 lingualis에서 풍부 하 고 몇 가지 큰 혈관 혈관에는,이 프로토콜은 위에서 설명한 다른 프로토콜 보다 혀 조직에 더 적합.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57-BL/6J 마우스	Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
에탄올	광저우 화학 시약 공장	HB15-GR-2.5L
염화나트륨	Sangon Biotech	A501218
염화칼	Sangon Biotech	A100395
이염기성 인산나트륨	광저우 화학 시약 공장	BE14-GR-500G
인산칼륨 모노베이직	Sangon Biotech	A501211
1.5 mL EP 튜브	Axygen	MCT-150-A
초저온 냉동고	Thermo Fisher Scientific
3.5cm 세포 배양 접시	Thermo Fisher Scientific	153066
6cm 세포 배양 접시	Greiner	628160
Triton X-100	Sigma-Aldrich	V900502
염화칼슘	Sigma-Aldrich	746495
염화마그네슘	Sigma-Aldrich	449164
DNase	시그마-알드리치	D5025
마그네슘 황산염	산곤 생명공학	A601988
포도당	시그마-알드리치	158968
중탄산나트륨	시그마-알드리치	S5761
암피실린	시그마-알드리치	A9393
카나마이신	시그마-알드리치	PHR1487
외과용 봉합	Shanghai Jinhuan
250 mL Wide mouth bottle	SHUNIU	1407
Magnetic stirrer	AS ONE	1-4602-32
CO2 인큐베이터	SHEL LAB	SCO5A
10 mL 주사기	Hunan Pingan
50 mL 원심분리기 튜브	Greiner	227270
Cal27 세포	중국과학원, 상하이 세포은행		혀 편평세포 암종 세포주
U2OS 세포	중국과학원, 상하이 세포은행		인간 골육종 세포주
DMEM/F12	시그마-알드리치	D0547
피루브산나트륨	시그마-알드리치	P5280
헤페스 유리산	BBI
FBS	하이클론	SH30084.03
4 ° C 냉장고	하이얼
정수기	ELGA
혈구계	BLAU	717805

륨 사 A600264