특정 및 감귤 류 녹화 병원 체 Candidatus liberibacter 종 감귤 잎 조직 샘플에서 사용 하 여 기존의 PCR의 정확한 검출

요약

감귤 류 녹화는 세계적으로 감귤 류 작물에 영향을 미치는 특히 파괴적인 질병 이다. 여기에 제시 된 간단한 방법을 사용 하는 PCR 및 감귤 잎 조직이의 게놈 DNA 추출 감귤 류 녹화 병원 체, Candidatus liberibacter 종의 정확 하 고 정확한 식별에 대 한

초록

감귤 류 녹화, 일컬어 huanglongbing, 세계적으로 감귤 류 농장을 ravaging 파괴적인 감귤 류의 질병 이다. 이 질병 원인과 비대칭 노란 잎 mottling, 정 맥 yellowing, defoliation, 루트 부패, 궁극적으로, 감귤 류 식물의 죽음. 감염, 감귤 류 식물 성장 저하는 고 시즌에서 꽃을 생산. 이 꽃 거의 항복 과일, 그리고 그 작은, 쓴, 불규칙 모양의 감귤 항복 할 바람직하지 않다. 이 질병은 감염 된 감귤 직물의 접목 하 여 아시아 감귤 류 psyllid, Diaphorina citri에 의해 확산. 병원 체는 감귤 류 식물 내에서 길고 가변 인큐베이션 기간-가끔 년 전에 증상이 나타납니다. 이 병원 균에서 체 외에서 배양 하려고 낮은으로 인해 성공 했습니다 하 고 내 병원 체의 고르지 못한 농도 감귤 류 조직, 감염 또는 환경 복제 하기 어렵기 때문에 조건의 성장에 도움이 병원 체입니다. 전에 그것은, 그것의 긴 잠복기와 병원 체 문화 연구원 못하는 질병을 식별 하기 위해 매우 어렵습니다. 그 결과, 질병만 된다 명백한 후 갑자기 감귤 류의 농부의 전체 수율을 파괴. 여기에 제시 된 감귤 류 녹화 병원 체, 게놈 DNA 추출 키트 및 PCR를 사용 하 여 Candidatus liberibacter 종의 정확 하 고 구체적인 검색 방법이입니다. 이 메서드는 간단 하 고, 효율적, 비용 효과, 고 정량 분석에 대 한 적응. 이 메서드는 모든 감귤 류의 조직;에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 잠재적으로 조직에 병원 체의 양에 의해 제한 됩니다. 그럼에도 불구 하 고,이 메서드 이전, 감염 된 감귤 류 식물을 식별 하는 감귤 류의 농민을 허용 하 고 더욱 확산 될 수 있습니다 전에이 파괴적인 질병의 확산을 억제.

서론

감귤 류 녹화, 일컬어 huanglongbing, 감귤 나무의 상당한 손실이 발생 했습니다. 한 대표적인 케이스는 플로리다, 질병을 70% 감소를 플로리다 오렌지 박스의 생산에 244 백만 상자에서 1997-1998 시즌에 2016-2017 시즌¹월 70 백만 상자 전망 이다. 플로리다에서 감귤 나무의 90% 이상 감염된², 고 플로리다 감귤 산업 손실 약 1 십억 달러 감귤 류 녹화³중요 한 역할 담당 하는 점에서 감귤 류의 질병으로 인해 매년 추정 된다. 감귤 류 녹화 침략 적 아시아 감귤 류 psyllid Diaphorina citri 에 의해 주로 전염 됩니다 그러나 또한 감염 된 조직. 의 접목 하 여 확산 될 수 있습니다. 질병 정 맥, 비대칭 노란 잎 mottling, 조 defoliation, 나뭇가지 dieback, 루트 부패 및 식물의 죽음의 황 변 발생 합니다. 중요 한 것은, 질병 거의 과일을 생산 하는 시즌에서 꽃을 생산 하는 감귤 류 식물을 발생 합니다. 감염 된 감귤 류 식물에 의해 생산 되는 과일은 미 숙, 녹색, 및 쓴 맛⁴.

이 방법의 목적은 정확 하 게 하는 것입니다 하 고 정확 하 게 운동 박테리아 Candidatus liberibacter 종, 감귤 류 녹화, 감염 된 감귤 나무⁵의 체 관 부 내 생활의 원인이 되는 에이전트를 식별 합니다. 게놈 DNA는 살아있는 박테리아를 포함 하는 전체 잎 조직에서 추출 됩니다. 이 추출 된 게놈 DNA oligonucleotides 세균의 16S rDNA 시퀀스에 보완를이 순서를 증폭 하는 데 사용 됩니다 기존의 PCR에 대 한 템플릿으로 사용 됩니다. 감귤 류의 FBOX 유전자 보완 oligonucleotides 내부 증폭 컨트롤로 사용 됩니다. 우리는 이전 연구⁶에서 성공 하려면 입증 되었습니다 때문에이 방법을 사용 하 여 선택 했습니다.

이 메서드는 간단 하 고, 상대적으로 저렴 한, 어떤 일반적으로 갖춘된 생화학 실험실에서 수행할 수 있는 명확한 이점이 있다. 또한, PCR이 병원 체⁷, 그리고 생존과 이내 asymptomatic 호스트⁸년 재현 병원 체의 능력 배양의 어려움으로 인해이 병원 체를 탐지 하기 위한 가장 정확 하 고 정확한 방법에 남아 있다. 많은 다른 전문 PCR 분석 실험 성공적으로;이 병원 체를 검출 하는 데 사용 되었습니다. 그러나, 기존의 PCR 무 증상 호스트⁸내 특히 정확 하 고 특정 검색에 대 한 간단한 분석 결과 남아 있습니다.

프로토콜

1. 격리 Genomic DNA 게놈 추출 키트를 사용 하 여 식물 조직에서

1. 감귤 류의 잎 조직이 절단 전체 신선한 깨끗 한가 위를 사용 하 여 감귤 나무에서 잎 그리고 깨끗 한 플라스틱 샌드위치 봉지에 잎을 배치 하 여 얻을.
   참고: 잎 조직이 포함 된 가방 두어야 한다 또는 절연된 용기에 얼음에 4 ° C 냉장고에 변질을 피하기 위해 컬렉션 후 가능한 한 빨리.
2. 박격포와 유 봉 진정 액체 질소의 작은 금액을 추가 합니다. 그들은 재미는 하는 동안 잎 조직, 약 1 평방 인치 크기에서의 작은 조각을 잘라가 위를 사용 합니다. 장소는 박격포에서 컷된 조직 즉시 동결. 필요한 경우 더 많은 액체 질소를 추가 합니다.
   참고: 절연된 장갑 항상 액체 질소를 처리 하는 동안 착용 한다.
3. 신속 하 게 박격포를 사용 하 여 정밀한 분말으로 식물 조직을 갈아. 액체 질소가 완전히 증발 하 고 좋은 녹색 분말 남아 때까지 연 삭 계속.
4. 짧게 진정에 대 한 10-15, 액체 질소에 금속 주걱 다음 주걱을 사용 하 여 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 박격포 내부 지상 조직 특 종.
5. 핵 세포 솔루션의 600 µ L 추가 (참조 테이블의 재료)를 사용 하 여 1000 µ L 플라스틱 및 소용돌이 1-3 s에 대 한 샘플 다음 15 분 동안 65 ° C 물 욕조에 품 어.
6. 그것을 혼합 하 여 15 분 동안 캐비닛 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어 튜브 2-5 번 반전, lysate 10µL 피 펫 사용을 RNase 솔루션의 3 µ L를 추가 합니다.
   참고: 계속 하기 전에 실내 온도에 냉각 하는 혼합물을 허용 한다.
7. 회사 펠 릿 형태로 13000 x g에 단백질 강 수 솔루션, 고속 20 s, 다음 3 분 동안 원심 분리기에서 소용돌이의 200 µ L를 추가 합니다. 샘플은 centrifuged 되 고, 하는 동안 신선한 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 실 온 소 프로 파 놀의 600 µ L를 추가 합니다.
8. 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 소 프로 파 놀을 포함 하는 신선한 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 전송 하는 centrifuged 샘플에서는 상쾌한 제거. 펠 릿 지금 삭제 수 있습니다.
   참고: 펠 릿 위에 상쾌한의 조금만 금액을 남겨 두어서 단백질으로 상쾌한을 오염 하지 마십시오.
9. DNA 가닥 스레드-처럼의 질량으로 표시 될 때까지 튜브를 반전 한 다음 실 온에서 1 분 13000 x g에서 원심.
10. 상쾌한 가만히 따르다, 펠 릿을 70% 에탄올의 600 µ L를 추가, 여러 번 세척 하는 DNA 고 1 분 13000 x g에서 원심 튜브를 반전.
11. 조심 스럽게 발음 에탄올, 느슨한 DNA 펠 릿을 떠나 다음 열고 관, 흡수 성 종이 반전. 15 분 동안 실 온에서 건조 공기.
12. 튜브를 활용 하 여 주기적으로 혼합 하는 동안 1 시간에 대 한 65 ° C 물 욕조에 DNA를 품 어 다음 말린된 DNA 펠 릿을 DNA Rehydration 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다.
13. Microcuvette에 순화 된 물의 1 µ L을 놓고 빈으로 사용할 분 광 광도 계에 그것을 삽입 합니다. Microcuvette에 1 µ L의 샘플을 배치 하는 분 광 광도 계에 삽입 하 여 현재의 DNA의 농도 계산 합니다. DNA 농도 (ng / µ L) × (₂₆₀-₃₂₀)로 계산 된 희석 요소 × 50 ng / µ L를 될 수 있습니다.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 샘플 4 ° c.에 저장 될 수 있다

2. Genomic DNA 견본에 PCR을 수행 합니다.

1. 결합 10 µ L 2 x PCR 마스터 믹스 ( 재료의 표참조), 1 µ L 앞으로 뇌관 (10 오후 / µ L), 1 µ L 반전 뇌관 (10 오후 / µ L) (뇌관 순서 표 2 참조), 100 게놈 DNA의 ng는 샘플에서 추출 하 고 물 (최대 20 µ L 최종 볼륨)에서 정화 한 50 µ L PCR 튜브, 혼합, 영화와 짧게 원심 분리기.
2. thermocycler에 PCR 튜브를 삽입 하 고 적절 하 게 실행 ( 표 1참조).
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 필요한 경우, 반응이 완료 된 후 4 ° C에서 예제를 저장 합니다.

3. electrophorese는 Agarose 젤에 증폭 된 DNA

1. 그리고 무게 0.4 g agarose 분말 1 x TAE 버퍼 함께 깨끗 한 200 mL 삼각 플라스 크, 최대 50 mL 작성에 추가할.
2. 모든 30 떨고 1.5 분 높은 전자 렌지 s, agarose는 완전히 녹아 때까지.
   참고: 절연된 장갑 화상을 방지 하기 위해 액체 agarose를 처리 하는 동안 착용 한다.
3. 레벨 젤 금형에 액체 agarose 젤을 부 어 다음 액체 agarose를 흔들어 혼합, 10 mg/mL ethidium 평범한 사람의 2.5 µ L를 추가 합니다. 신속 하 게 붓는 후 표준 12-치아 젤 빗을 삽입 합니다.
4. 실 온에서 20 분을 기다린 다음 제거 젤 빗, 젤 허용 고 젤 수준 젤 상자 1 x TAE 버퍼 가득 합니다.
5. 웰 스에 총 증폭된 DNA 샘플을 로드 하는 micropipette를 사용 하 여. DNA의 5 µ L 사다리 ( 재료의 표참조)을 샘플에서 별도 잘에서 추가 합니다.
6. 35 분 90, 상수에 대 한 샘플을 electrophorese 다음 젤을 제거 하 고 UV transilluminator에.
7. 사진 하 고 302에서 UV transillumination를 사용 하는 동안 패턴 밴딩 젤 분석 nm.

결과

긍정적인 결과 수익률 500 해당 고유 밴드 Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss⁶, 및/또는 독특한 밴드 700 해당 bp bp Laa2/Laj5, 16S ribosomal β에 삽입에 대 한 오 페론⁹. 내부 증폭 제어 밴드 또한 400에 표시 되어야 합니다 혈압. 이 밴드는 감귤 류의 FBOX 유전자¹⁰, 증폭에 해당 하며 유효 하기 결과 대 한 표시 되어야 합니다 (그림 1 및 그림 2). 두 500의 부족 혈압과 700 bp 밴드는 400 bp 밴드는 존재 하는 동안 부정적인 ...

토론

그것은 중요 한 최적의 실험 조건 달성 하기 위해 정확 하 게 모든 단계는 따 랐 다입니다. 전체 잎 조직;이 데모 중에 사용 된 그러나, 이론적으로 식물 조직의 모든 종류를 포함 하는 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 이전, 연구 전체 잎 조직, 보다는 오히려 잎 정 맥 조직이, genomic DNA를 추출 있고 비슷한 결과¹¹를 달성. 감귤 류의 FBOX 유전자에 해당 하는 밴드를 하지 못하면 표시 결과 유효 하지 않습니다, 그리고 하나 이상의 절차에 몇 가지 기술적 오류가 있을 수 있습니다. 일반적인 오류 포함: 오염 또는 부적절 하 게 멸 균 물, micropipette 팁, 또는 microcentrifuge 튜브;를 사용 하 여 게놈 DNA 추출; 하는 동안 또는 PCR 혼합에 필요한 하나 이상의 구성 요소를 추가 하는 실패 적절 한 thermocycler 조건; 유지 하기 실패 시 약 또는 그들의 만료 날짜; 다른 재료를 사용 하 여 브로민 추가 실패 브롬 또는...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions
액상 질소	Air Products	N/A
Mastercycler pro with control panel	Eppendorf	6321000019
1250 W Microwave	Panasonic	N/A
5424 탁상용 원심분리기	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 디지털 수조	Fisher Scientific	15-462-15Q
금속 주걱	Sigma-Aldrich	Z283274
모르타르 및 유봉	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Vortex Mixer	Corning	6775
2-프로판올	Sigma-Aldrich	I9516
멸균 10 μ L 팁	TipOne	1161-3730
멸균 200 μ L 팁	TipOne	1163-1730
멸균 1250 μ L 팁	TipOne	1161-1750
가변 볼륨 피펫터 키트	VWR	75788-460
에티듐 브로마이드	시그마-알드리치	E1510
아가로스	IBI 사이언티픽	IB70041
EDTA	써모 피셔 사이언티픽	17892
아세트산	피셔 케미컬	A38-212
트리스 베이스	시그마-알드리치	10708976001
μ cuvette	Eppendorf	6138000018
쌓을 수 있는 주조 트레이 및 빗,	Carolina	213655
PowerPac, Basic, 전원 공급 장치	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell, GT 시스템	Bio-Rad	1704487EDU
Biospectrometer, basic	Eppendorf	6135000009
	Fisher scientific	AB-0620
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
포워드 프라이머	Thermo Fisher Scientific	리
	Thermo Fisher Scientific
물, PCR 등급	Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ DNA ladder	Thermo Fisher Scientific	10787018

, , , , , , , , , 0.2 mL PCR tubes, 버스 프라이머 해당 없음