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방법 논문

미세 소자에서 조직 모델 perfusable 혈관 네트워크

14.1K 조회수

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DOI:

10.3791/57242

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2018년 4월 4일

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이 논문에서

요약

프로토콜에는 회전 타원 체에 perfusable 혈관 네트워크를 설계 하는 방법을 설명 합니다. 회전 타원 체의 주변 microenvironment 신생 유도 microchannels 미세 장치에는 회전 타원 체 연결을 고안 이다. 메서드를 사용 하면 3 차원 문화에 오랫동안 기다려온 기술 회전 타원 체의 관류를 수 있습니다.

초록

회전 타원 체 (다세포 집계)는 인간의 신체에서 살아있는 조직의 좋은 모델으로 간주 됩니다. 회전 타원 체 문화에서 중요 한 발전에도 불구 하 고 perfusable 혈관 네트워크는 spheroids에 유지 하 고 단백질 식 및 morphogenesis 같은 그들의 기능을 개발 하는 데 필요한 장기 문화에 대 한 중요 한 도전 남아 있습니다. 프로토콜 미세 장치에서 회전 타원 체 내 perfusable 혈관 네트워크를 통합 하는 새로운 방법을 선물 한다. Perfusable 혈관 네트워크는 회전 타원 체에 유도, 신생 콩나물 microchannels에 연결 된 인간의 폐 섬유 아 세포는 회전 타원 체에 경작에서 신생 요소를 활용 하 여는 회전 타원 체를 유도 했다. 신생 콩나물 회전 타원 체, 회전 타원 체, 공동 경작 하는 내 피 세포와 합병을 도달 하 고 지속적인 혈관 네트워크를 형성 했다. 혈관 네트워크 어떤 유출 없이 회전 타원 체의 내부를 perfuse 수 있습니다. 생성 된 혈관 네트워크 영양분의 공급과 혈액 순환 비보를 흉내 낸 폐기물의 제거에 대 한 경로로 추가 사용 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 조직 생활의 더 나은 재현 부로 회전 타원 체 문화에서 새로운 플랫폼을 제공합니다.

서론

생활의 세포질 기능을 모방 하는 문화 모델을 사용 하는 필요에 의해 자극 된다 3 차원 문화에 단층 (2 차원) 문화에서 변화 조직1,2,3. 일반적으로 세포 배양에 사용 하는 평평 하 고 단단한 플라스틱 기판 대부분을 인체에 extracellular 환경의 닮는 다 하지. 사실, 많은 연구가 보여주는 그 3 차원 문화 재현 조직 관련 건축, 기계 및 생 화 확 적인 신호 및 셀 통신, 기존의 2 차원 문화4에서에서 관찰 되었습니다 하지, 5,6,,78.

다세포 집계 또는 회전 타원 체,이 3 차원 문화9,10을 실현 하기 위해 가장 유망한 기술 중 하나입니다. 세포는 세포 외 기질 ....

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프로토콜

1입니다. 미세 장치 금형의 제작

  1. 상용 소프트웨어를 사용 하 여 미세 소자의 패턴 디자인 (Clewin5 또는 AutoCAD 2016, 등.). Clewin5의 기능에 대 한 사용자 설명서 (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual)를 참조 하십시오.
    참고: 디자인 파일은 보조 파일 1에서 사용할 수 있습니다.
  2. 마이크로 패턴 발생기에 디자인 파일을 전송 하 고 긍정적인 감광 제 코팅 크롬 마스크 도구를 로드 합니다.
  3. 마이크로 패턴 발생기를 사용 하 여 패턴 영역에서 긍정적인 감광 노출.
  4. 개발자 (테이블의 재료)를 사용 하 여 긍정적인 감광 제를 개발 하 고 마스크 이온된 (DI) 수와 린스.
  5. Using 크롬 현상 (자료 테이블), 긍정적인 감광 제 제거 되었습니다 노출된 영역에 크롬 에칭. 마스크 디 물으로 린스.
  6. 남은 아세톤을 사용 하 여 마스크에 포토 레지스트를 제거 합니다.
    참고: 투명도 마스크 Cr 마스크에 대 한 대안을 수 있습니다.
  7. 깨끗 한 실리콘 웨이퍼를 준비 (4 인치, P(100)) ....

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결과

그림 1 에서는 설계 및 미세 소자의 사진. 그것은 3 개의 병렬 채널, 어느 채널에서 2는 회전 타원 체 잘 들어 있습니다. HUVEC 문화에 사용 되는 채널 1과 3 이며 채널 2는 회전 타원 체에 대 한. 각 채널 패턴 PDMS 하도록 설계 된 사다리꼴 microposts로 구분 됩니다. microposts에서 채널 1과 3에 표면 장력에 의해 새 채널 2에서에서 하이드로 겔을 방지 하 고 microchannels28회전 타원 체와 HUVECs 사이의 물질 교환 허용.

그림 7a 셀 시드 후 미세 소자의 센터를 보여 줍니다. 밝은 분야 및 형광 이미지 0에 찍은 섬유 소 젤 채널 1, 3에 채널 2 어떤 누설 .......

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토론

이전 보고서 보기 hLFs angiopoietin 1, angiogenin, hepatocyte 성장 인자, 성장 인자 α, 종양 괴 사 인자와 일부 세포 외 기질 단백질29, 변형 등의 여러 신생 요인의 칵테일을 분 비 30. 이 분석 결과에서 coculture 회전 타원 체, 기술의 한계는 hLFs에서 신생 비에 의존 합니다. 따라서, 그것은 coculture 회전 타원 체와 채널 1과 3에서에서 HUVECs 사이의 거리를 단축 될 수 있다 우물의 바닥에 coculture 회전 타원 체를 설정 하는 안정적인 혈관 형성 중요 합니다. 짧은 거리는 안정적인 혈관 형성에 대 한 유리 섬유 아 세포에서 혈관 길이 내 피 세포 및 섬유 아 세포31, 사이의 거리에 반비례 했다. 그러나, 손상 채널 1 및 3 없이 회전 타원 체 구멍 (직경에서 1 m m)를 열고, 채널 2의 최소 폭 1.......

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공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

이 작품은 크레스트 JST (보조금 번호 JPMJCR14W4), 사회 대는 승진의 과학 (JSP) KAKENHI (25600060, 16 K 16386 번호 부여), 문 부 과학성 및 JST, 프로젝트에서 키 평가 기술 개발에 초점을 맞춘 혁신 프로그램의 센터에 의해 지원 되었다 의료 연구 및 개발, 아메드, 미즈호 기초 과학의 승진을 위한 일본 기관. 소는 교토 대학교 나노 기술 허브에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AutoCAD 2017AutodeskAutoCAD 2017
AZP 1350으로 코팅된 크롬 마스크.CLEAN SURFACE TECHNOLOGYCBL2506Bu-AZP
마이크로 패턴 생성기하이델베르크uPG101
MF CD-26 현상액Rohm and haas electronic materials-프로토콜 1.4
S-CleanSasaki ChemicalS-24크롬 에칭액 프로토콜 1.5
AcetonWako012-00343
실리콘 웨이퍼CanosisSiJ-4
Spin CoaterMIKASA1H-D7
Hexamethyldisilazane (HMDS)Tokyo Ohka KogyoH0089
SU-8 3050MicroChem-NegativePhotoresist in protocol 1.9
UV ExposureNanometric Technology IncLA310s
SU-8 개발자MicroChemY020100프로토콜 1.13의 네거티브 포토레지스트에 대한 개발자
2-프로판올Wako163-04841
표면 프로파일러VeecoDektak XT-S
(Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란Sigma448931
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow Corning Toray184W/C
생검 펀치 (1.0mm) 카이 인더스트리BP-10F
바이옵시 펀치 (2.0mm) 카이 공업BP-20F
플라즈마 시스템펨토 사이언COVANCE
커버 유리MATSUNAMI GLASSC024241
Culture Dishes이와키1000-035
RFP 표현 인간 배꼽 정맥 내피 세포혈관 단백cAP-0001RFP
정상 인간 폐 섬유 아세포LonzaCC-2512
내피 세포 성장 매체LonzaCC-3162
섬유 아세포 성장 미디어 키트LonzaCC-3132
DMEMThermo Fisher Scientific11965092
소 태아 혈청Thermo Fisher Scientific26140079
페니실린-스트렙토 마이신 용액Wako168-23191
0.05w/v% 트립신-0.53mmol/l EDTA• 4Na 용액과 페놀 레드Wako204-16935
PBS (인산염 완충염)타카라 바이오T900
96-웰 플레이트스미토모 베이클라이트631-21031
1000ul 칩NIPPON GeneticsFG-402
200ul  ChipNIPPON GeneticsFG-301
10ul ChipNIPPON Genetics37650
CO2 인큐베이터Thermo Fisher ScientificModel 370
GFP 발현 인간 배꼽 정맥 내피 세포Angio ProteomiecAP-0001GFP
소 플라즈마에서 추출한 피브리노겐SigmaF8630
소 폐에서 추출한 아프로티닌SigmaA6279
콜라겐 ICorning354236
소 플라즈마에서 추출한 트롬빈SigmaT4648
Hoechst 33342InvitrogenH21492프로토콜 5.5에서 핵을 염색하기 위한 형광 염료 파라
포름알데히드 용액Wako163-25983
도립 형광 현미경OLYMPUSIX71
디지털 CCD 카메라OLYMPUSORCA-R2
컨포칼 레이저 스캐닝 생물 현미경OLYMPUSFV1000
도립 형광 현미경OLYMPUSIX-83
플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란시그마FD70S
스

참고문헌

  1. Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10),....

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