Method Article

미세 소자에서 조직 모델 perfusable 혈관 네트워크

DOI:

10.3791/57242

⸱

April 4th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Micro Engineering, Kyoto University, 2Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 3International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜에는 회전 타원 체에 perfusable 혈관 네트워크를 설계 하는 방법을 설명 합니다. 회전 타원 체의 주변 microenvironment 신생 유도 microchannels 미세 장치에는 회전 타원 체 연결을 고안 이다. 메서드를 사용 하면 3 차원 문화에 오랫동안 기다려온 기술 회전 타원 체의 관류를 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

회전 타원 체 (다세포 집계)는 인간의 신체에서 살아있는 조직의 좋은 모델으로 간주 됩니다. 회전 타원 체 문화에서 중요 한 발전에도 불구 하 고 perfusable 혈관 네트워크는 spheroids에 유지 하 고 단백질 식 및 morphogenesis 같은 그들의 기능을 개발 하는 데 필요한 장기 문화에 대 한 중요 한 도전 남아 있습니다. 프로토콜 미세 장치에서 회전 타원 체 내 perfusable 혈관 네트워크를 통합 하는 새로운 방법을 선물 한다. Perfusable 혈관 네트워크는 회전 타원 체에 유도, 신생 콩나물 microchannels에 연결 된 인간의 폐 섬유 아 세포는 회전 타원 체에 경작에서 신생 요소를 활용 하 여는 회전 타원 체를 유도 했다. 신생 콩나물 회전 타원 체, 회전 타원 체, 공동 경작 하는 내 피 세포와 합병을 도달 하 고 지속적인 혈관 네트워크를 형성 했다. 혈관 네트워크 어떤 유출 없이 회전 타원 체의 내부를 perfuse 수 있습니다. 생성 된 혈관 네트워크 영양분의 공급과 혈액 순환 비보를 흉내 낸 폐기물의 제거에 대 한 경로로 추가 사용 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 조직 생활의 더 나은 재현 부로 회전 타원 체 문화에서 새로운 플랫폼을 제공합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생활의 세포질 기능을 모방 하는 문화 모델을 사용 하는 필요에 의해 자극 된다 3 차원 문화에 단층 (2 차원) 문화에서 변화 조직1,2,3. 일반적으로 세포 배양에 사용 하는 평평 하 고 단단한 플라스틱 기판 대부분을 인체에 extracellular 환경의 닮는 다 하지. 사실, 많은 연구가 보여주는 그 3 차원 문화 재현 조직 관련 건축, 기계 및 생 화 확 적인 신호 및 셀 통신, 기존의 2 차원 문화4에서에서 관찰 되었습니다 하지, 5,6,,78.

다세포 집계 또는 회전 타원 체,이 3 차원 문화9,10을 실현 하기 위해 가장 유망한 기술 중 하나입니다. 세포는 세포 외 기질 (ECM)을 분 비 하 고는 회전 타원 체에서 다른 사용자와 상호 작용할 수 있습니다. 비록 다른 바이오 접근11,12,,1314, 셀 스택 등 인체의 공간 복잡도 성공적으로 복제, 이러한 접근만 2 또는 3 분석의 용이성 및 대상 기관에 초점 을된 하나의 기능에 대 한 셀의 종류. 대조적으로, spheroids에 세포 영양분, 산소, paracrine autocrine 신호는 회전 타원 체에 분자의 다른 유형의 공급으로 인해 회전 타원 체에 그들의 위치에 따라 다른 문화 환경에 노출 됩니다. Spheroids의이 기능은 부분적으로 모방 문화 상태 vivo에서 그리고 생체 외에서 스태킹 조직9, 에서 교양 보다 훨씬 더 복잡 하 고, 조직 조직 만들 spheroids 셀 구조 사용 15 , 16.는 회전 타원 체는 세포의 단일 종류의 구성 되어, 경우는 회전 타원 체에 세포의 기능 하지 않습니다는 회전 타원 체에서 이기종 환경으로 인해 균일 한. 지난 몇 년 동안, 회전 타원 체 문화 허용 배아 줄기 세포 (ESCs), 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 또는 vivo에서 발달 순서를 모방 하 여 미니-17뇌 등 장기를 다시 조직 상주 줄기 세포 간18및 신장19,20.

회전 타원 체 문화 기술에 있는 뜻깊은 진도도 불구 하 고 오랜 동안 큰 spheroids 경작은 여전히 문제가 있다입니다. 3 차원 조직에서 세포를 150-200 µ m의 혈관 내 산소와 영양소21의 한정 된 공급 때문에 필요 합니다. 회전 타원 체 내 혈관 네트워크는 혈액과 조직 비보사이 교환 물질을 정리 하는 데 필요한. 이를 위해, 다른 그룹 공동 대상 셀22,,2324 과 내 피 세포를 배양 하거나 CD31-긍정적인 세포20로 만능 세포의 분화를 유도. 그럼에도 불구 하 고, 보고 된 선박-같은 구조는 회전 타원 체의 중심에 산소와 양분을 공급 하는 루미나의 열린 끝을 있지 않습니다. 3 차원 문화에 있는 세포 영양 혈관 역할을 모방 하는 회전 타원 체에 오픈 및 perfusable 혈관 네트워크를 개발 해야 합니다.

지난 몇 년 동안 microengineering 필드에 일부 연구 그룹 보고 cocultured fibroblast 세포25에서에서 신생 요소를 이용 하 여 미세 장치에 자발적으로 형성 된 perfusable 혈관 네트워크를 구성 하는 방법 ,26. 이러한 혈관 네트워크에 그들의 생체 내에서 유사한 형태학 있고 그들을 회전 타원 체 문화에 혈관 기능을 흉내 낸에 대 한 적당 한 만드는 환경 요인에 의해 개장 될 수 있다. 이 프로토콜의 목적은 미세 플랫폼27을 사용 하 여 회전 타원 체에 perfusable 혈관 네트워크를 구성 하는 것입니다. 미세 장치는 회전 타원 체 통합 될 수 있도록 이전에 보고 된 장치25 에서 수정 됩니다. Microchannels에서 내 피 세포에는 회전 타원 체에서 fibroblast 세포에서 신생 비 여, 신생은 회전 타원 체와 anastomosed microchannels에서 콩나물 하 고 perfusable 혈관 네트워크를 형성 했다. 이 메서드는 다양 한 형광 분자 및 혈관 네트워크와 장기 조직 문화에 대 한 프레임 워크를 제공 하는 회전 타원 체의 내부에 마이크로 미터 규모 구슬 같은 물질의 직접 배달 수 있습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1입니다. 미세 장치 금형의 제작

  1. 상용 소프트웨어를 사용 하 여 미세 소자의 패턴 디자인 (Clewin5 또는 AutoCAD 2016, 등.). Clewin5의 기능에 대 한 사용자 설명서 (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual)를 참조 하십시오.
    참고: 디자인 파일은 보조 파일 1에서 사용할 수 있습니다.
  2. 마이크로 패턴 발생기에 디자인 파일을 전송 하 고 긍정적인 감광 제 코팅 크롬 마스크 도구를 로드 합니다.
  3. 마이크로 패턴 발생기를 사용 하 여 패턴 영역에서 긍정적인 감광 노출.
  4. 개발자 (테이블의 재료)를 사용 하 여 긍정적인 감광 제를 개발 하 고 마스크 이온된 (DI) 수와 린스.
  5. Using 크롬 현상 (자료 테이블), 긍정적인 감광 제 제거 되었습니다 노출된 영역에 크롬 에칭. 마스크 디 물으로 린스.
  6. 남은 아세톤을 사용 하 여 마스크에 포토 레지스트를 제거 합니다.
    참고: 투명도 마스크 Cr 마스크에 대 한 대안을 수 있습니다.
  7. 깨끗 한 실리콘 웨이퍼를 준비 (4 인치, P(100)) 및 스핀 코트 hexamethyldisilazane (HMDS) 30 3000 rpm에서 s.
  8. Softbake HMDS 120 ° C와 멋진 웨이퍼 상 온에서 5 분에서 5 분.
  9. Spincoat 10 s 500 rpm 및 30에 대 한 1200 rpm에서 부정적인 감광 제 (자료 테이블) s.
    참고: 스핀 코팅 조건 해야 얻을 감광 레이어 웨이퍼에 약 100 µ m의 두께 가진 사진 평판 후.
  10. 95 ° C에서 45 분에 대 한 부정적인 감광 prebake 고 실 온에서 60 분에 대 한 웨이퍼를 냉각 하십시오.
  11. 각 실험에서 UV 빛의 강도 확인 하 고 250 mW/cm2에서 총 노출 에너지 복용량에 대 한 노출 시간을 계산 합니다. 웨이퍼에 포토 마스크 (단계 1.1-1.6)을 놓고는 자외선에 노출 합니다.
  12. Postbake 1 분 65 ° C에서와 95 ° c.에 5 분에 대 한 부정적인 감광 제 실 온에서 1 분 동안 진정 웨이퍼를 허용 합니다.
  13. 첫 번째 개발자 (자료 테이블) 목욕에서 하 고 두 번째 목욕에서 2 분 15 분에 대 한 부정적인 감광 레이어를 개발 합니다. 10에 대 한 첫 번째 소 프로 파 놀 (IPA) 목욕에 웨이퍼를 씻어 s 10에 대 한 두 번째 IPA 목욕에서 s.
  14. Hardbake 200 ° C와 멋진 웨이퍼 상 온에서 5 분에서 30 분에 대 한 부정적인 감광 제.
  15. 표면 프로파일러를 사용 하 여 부정적인 포토 레지스트 층의 두께 측정 합니다.
  16. 진공 펌프에 연결 된 desiccator 웨이퍼 놓고 silane (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane)의 200 µ L을 추가. 10 분 동안 펌프 다음 그것을 해제 켜고 4 h desiccator에 웨이퍼를 유지.

2. 제조 단계 및 PDMS 층 어셈블리

  1. 캐스팅 사전입니다 (PDMS) 폴리머 (PDMS 자료: 경화제 = 10:1 (w/w))와 2 시간에 대 한 진공 챔버에 드.
  2. 치료 PDMS 공기 통풍 오븐 하룻밤에 80 ° C에서.
  3. 실리콘 웨이퍼에서 PDMS를 벗기십시오.
  4. 펀치 구멍 1A-3B (그림 1)와 잘 회전 타원 체 문화. -3B, 고 1 m m 직경은 회전 타원 체에 대 한 잘 펀치 구멍 1A에 대 한 2 m m 직경 펀치를 사용 합니다.
  5. 반복적으로 집착 하 고 테이프를 벗 하 여 접착 테이프를 가진 PDMS 슬 래 브와 유리 커버 슬립 (24 m m × 24 m m)를 청소 합니다. 다음 치료 40 공기 플라즈마 PDMS 석판 s (40 mW, 50 sccm).
  6. PDMS 슬 래 브와 커버 슬립 80 ° C 12 h 이상에서 치료 사이의 표면에서 모든 기포를 추방 하기 위해 유리 커버 슬립에 PDMS 슬 래 브 본드.

3. 회전 타원 체 준비

참고:이 연구에서 빨간색 형광 단백질을 표현 하는 인간의 배꼽 정 맥 내 피 세포 (RFP-HUVECs) 고 표현 하는 녹색 형광 단백질 HUVECs (GFP-HUVECs)에 사용 된 회전 타원 체와 microchannels, 각각의 구별 Perfusable 혈관 네트워크의 건설 후 HUVECs. HUVECs의 필요 하지 않은 경우 레이블된 HUVECs 실험을 위해 충분 하다.입니다.

  1. RFP-HUVECs (3.0 × 105 셀/유리병)과 인간의 폐 섬유 (hLF) (1.0 × 106 셀/유리병) 해 동을 내 피 세포와 섬유 세포에 대 한 매체의 10 mL에 각각 추가 합니다 (자료 테이블). 문화 그들 37 ° C, 5% CO2 에서 100 mm 접시에 2-3 일에 대 한 하위 confluent RFP HUVECs 및 hLFs. 이 준비는 200 ~ spheroids를 얻을 것입니다.
  2. RFP HUVECs 및 hLFs 0.05% 트립 신-EDTA의 2 mL와 함께 요리에서 분리 하 고 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% (v/v) 페니실린/스 포함 된 DMEM의 4 mL와 트립 신 반응을 중지.
  3. 3 분 220 x g에서 원심 분리 후 상쾌한, 제거 하 고 마지막 셀 농도 2.5 × 104 와 1.0 × 105 셀/mL, 내 피 중간에 RFP HUVECs와 hLFs를 각각 resuspend.
  4. 부드럽게 낮은 바인딩 표면 96 잘 접시에 잘 당 셀 정지 (5000 셀 RFP HUVECs에 대 한) 및 hLFs에 대 한 20000 셀의 200 µ L를 추가 합니다.
  5. 2-4 일 동안 37 ° C, 5% CO2 96 잘 접시를 품 어.
    참고: 회전 타원 체 직경 문화 기간과 96 잘 접시에 초기 휴대폰 번호에 따라, 이후 그것은 제어할 수 있습니다 이러한 두 매개 변수에 의해.

4입니다. 세포 미세 장치에 뿌리기

참고: 채널 구멍과 회전 타원 체에 대 한 명명 규칙 잘 그림 1에서 시연 됩니다. 우리 세포 미세 장치에 수확 끝나면 하루 하루 0을 정의 합니다. 실험 일정의 회로도 그림 2에 표시 됩니다.

  1. 일 − 1) 회전 타원 체 로드
    참고: 다음 단계 콜라겐과 섬유 소의 겔 화를 방지 하기 위해 얼음에 수행 되어야 합니다.
    1. 2.80 mg/mL의 최종 농도 대 한 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 fibrinogen 디졸브.
    2. 제조 업체의 프로토콜에 따라 중화 콜라겐 (PBS에 3.0 mg/mL)를 준비 합니다.
    3. Fibrinogen 솔루션 (2.80 mg/mL)의 107.2 µ L, 중화 콜라겐 (3.0 mg/mL), 8.0 µ L 및 3.6 µ L 반응 관에서 당 aprotinin (5 U/mL)의 결합. 이 솔루션은 "마스터 믹스 솔루션" 표시 됩니다 (MS).
      참고: 볼륨 충분 한 회전 타원 체를 로드 됩니다. 하나 이상의 회전 타원 체 있는 경우에, spheroids의 수로 각 볼륨을 곱하면 됩니다.
    4. 50 U/mL의 최종 농도 대 한 PBS에 트 롬 빈을 디졸브.
      참고: 50 U/mL 트 롬 빈 (20 µ L/튜브)의 Aliquots −30 ° C에 저장 되 고 각 실험 전에 해 동.
    5. Biosafety 캐비닛 내부 spheroids를 포함 하는 96 잘 접시를 놓습니다.
    6. Biosafety 내각, 얼음 (1 접시) 1 접시와 벤치탑 (2 접시)에 다른 접시 안에 두 35 m m 접시를 준비 합니다. 접시 1 (그림 3a) 물방울 형성의 중심에 피펫으로 99 µ L의 MS입니다.
    7. (10-100 µ L) 2 노란색의 끝을 트림와 3 피 펫 팁 (1-100 µ L) MS, spheroids의 정밀한 수집 장치에 있는 spheroids를 주입 하 고 장치에 미디어를 주입와 트 롬 빈을 혼합 96 잘 접시에서 spheroids의 컬렉션에 대 한 취소 각각. 팁의 기 공 크기 구멍 1A-채널 1과 3의 3B의 직경 보다 약간 더 큰 또는 채널 2 아늑한에서에서 회전 타원 체에 맞게.
      참고:이 하, 달리 언급 하지 않는 한 사용 하 여이 단계에서 잘라내기 피 펫 팁. 그림4에서 컷된 팁의 사진을 이용하실 수 있습니다.
    8. 96 잘 접시에서 매체의 100 µ L로 회전 타원 체를 수집 하 고 접시 2 (그림 3a) 추가.
    9. 접시 2에서에서 미디어의 최소 볼륨으로 회전 타원 체 선택 합니다. pipettor을 똑바로 잡고는 회전 타원 체 중력에 의해 피펫으로 팁의 아래쪽으로 이동 해야 합니다. 접시 1 (그림 3a)에 MS 물방울의 초승달 모양에 피펫으로 팁으로는 회전 타원 체를 꺼냅니다.
      참고: 다음 단계 4.1.10 & 4.1.11 신속 하 게 수행 되어야 한다.
    10. 트 롬 빈 (50 U/mL)의 1 µ L을 추가 하 고 노란색 피펫으로 팁으로 부드럽게 혼합.
    11. 7 µ L로 설정 하는 피 펫으로는 회전 타원 체를 선택 하 고 천천히 회전 타원 체 잘 (그림 3b) 그것을 넣습니다.
    12. 섬유 소의 겔 화에 대 한 37 ° C에서 15 분 동안 품 어.
    13. 미디어와 구멍 1A와 3A 및 채우기 채널 1과 3에서에서 내 피 매체를 천천히 주입 (20 ~ 30 µ L/채널).
    14. 미디어 장치 (그림 3c)에서 증발을 방지 하기 위해 젖은 Kimwipe와 100 mm 접시에는 장치를 놓습니다.
    15. 미디어와 섬유 소 사이의 인터페이스에서 거품 제거를 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 장치를 놓습니다.
  2. 로드 하는 데 0) HUVECs
    1. Thaw GFP-HUVECs (105 셀/유리병 x 3.0)을 내 피 매체의 10 mL를 추가 합니다. 하위 confluency 도달 하 2-3 일 동안 37 ° C, 5% CO2 에서 100 mm 접시에 그들을 문화. 하위 confluent GFP-HUVECs의 1 접시 준비 8-10 장치에 대 한 충분 하다.
    2. GFP-HUVECs 0.05% 트립 신-EDTA의 2 mL와 함께 요리에서 분리 하 고 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% (v/v) 페니실린/스 포함 된 DMEM의 4 mL와 트립 신 반응을 중지.
    3. 3 분 220 x g에서 원심 분리 후 106 셀/mL x 5.0에 GFP-HUVECs 내 피 중간에 resuspend.
    4. 채널 1 구멍 1b HUVECs 세포 현 탁 액 주입 (20 µ L/채널).
    5. 미세 장치 90 °를 기울기, 측면에 배치와 준수는 HUVECs 채널 2에에서 섬유 소를 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
      1. 섬유 소에 HUVECs의 첨부 파일을 확인 합니다. 젤와 매체 간의 인터페이스에 연결 된 HUVECs 수가 부족 한 경우는 맥 관 구조 장치 문화 (그림 5)의 몇 일 후 혈관 루트에서 끊을 수 있습니다. 프로토콜에는 관류의 성공률은 > 50%.
    6. 채널 3 4.2.4-4.2.5 단계를 반복 합니다.
    7. 7-14 일 동안 37 ° C, 5% CO2 젖은 Kimwipe와 100 mm 접시에 문화 세포.
  3. 1 일 ~) 미디어 교환
    1. 채널 1과 3에에서 미디어의 절반 매일 교환 합니다.

5입니다. 핵 얼룩

  1. PBS에서 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다.
  2. 채널 1과 3에서에서 미디어를 제거 하 고 4%의 20 µ L 추가 채널당 PFA. 4%에서 솔루션을 대체 하기 위하여 PFA, 반복 장치에서 솔루션 제거 및 추가 4% PFA 3 번.
  3. 4 ° C에서 장치를 밤새 품 어.
  4. 4% 제거 장치 및 세척 PFA PBS와 채널 3 번.
  5. 세포 핵 얼룩 채널 당 10 µ g/mL 형광 염료 (자료 테이블)의 20 µ L를 추가 합니다. 장치에 솔루션을 교환 하는 장치에서 솔루션을 제거 하 고 10 µ g/mL를 추가 형광 염료 3 번 반복 합니다.
  6. 24 h에 대 한 4 ° C에서 장치를 저장 합니다.

6. 유체 관류는 회전 타원 체의

  1. 7 일 동안 37 ° C, 5% CO2 장치에는 지속적인 혈관 통로의 완료에 대 한 배양 후는 회전 타원 체를 준비 합니다.
  2. 구멍 1A, 1B, 3A, 3B에서 매체를 제거 합니다.
  3. 10 µ L fluorescein isothiocyanate (FITC) 10 µ M 솔루션의 소개-dextran PBS에 구멍 1A 및 1B에.
  4. Microbeads 또는 거꾸로 현미경 FITC 염료의 흐름을 모니터링 합니다.

7입니다. 새싹 길이의 정량화

참고:이 연구에서 이미지의 분석의 모든 ImageJ 버전 1.49 소프트웨어 사용 됩니다.

  1. GFP HUVECs 일 0, 1, 3, 5 및 7의 이미지를 오버랩.
  2. 하루 1, 3, 5 및 7 일에 촬영 한 이미지에서 같은 위치에서 0의 맥 관 구조 팁의 위치를 뺍니다.
  3. 루트 위치 (그림 6)에서 혈관 끝의 성장을 결정 합니다. 혈관 팁 및 루트 사이의 거리는이 연구 (그림 7b) 새싹 길이로 정의 했다.

8입니다. 혈관 각도의 정량화

참고: 혈관 각도 각도 혈관 각도, 루트 및 회전 타원 체 (그림 7c)의 중심 구성으로 정의 되었다.

  1. RFP HUVECs를 포함 하는 coculture 회전 타원 체의 형광 이미지를 binarize 하 고 분석 함수 ImageJ에 의해 "중심" 위치를 측정 한다. 이 연구에서는 측정된 "중심" 위치는 회전 타원 체 (그림 6)의 중심으로 정의 됩니다.
  2. 7 단계에서 같은 방법으로 혈관 팁 및 뿌리의 위치를 결정 합니다.
  3. ImageJ 소프트웨어에서 분석 기능을 사용 하 여 혈관 각도 측정 합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그림 1 에서는 설계 및 미세 소자의 사진. 그것은 3 개의 병렬 채널, 어느 채널에서 2는 회전 타원 체 잘 들어 있습니다. HUVEC 문화에 사용 되는 채널 1과 3 이며 채널 2는 회전 타원 체에 대 한. 각 채널 패턴 PDMS 하도록 설계 된 사다리꼴 microposts로 구분 됩니다. microposts에서 채널 1과 3에 표면 장력에 의해 새 채널 2에서에서 하이드로 겔을 방지 하 고 microchannels28회전 타원 체와 HUVECs 사이의 물질 교환 허용.

그림 7a 셀 시드 후 미세 소자의 센터를 보여 줍니다. 밝은 분야 및 형광 이미지 0에 찍은 섬유 소 젤 채널 1, 3에 채널 2 어떤 누설 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이전 보고서 보기 hLFs angiopoietin 1, angiogenin, hepatocyte 성장 인자, 성장 인자 α, 종양 괴 사 인자와 일부 세포 외 기질 단백질29, 변형 등의 여러 신생 요인의 칵테일을 분 비 30. 이 분석 결과에서 coculture 회전 타원 체, 기술의 한계는 hLFs에서 신생 비에 의존 합니다. 따라서, 그것은 coculture 회전 타원 체와 채널 1과 3에서에서 HUVECs 사이의 거리를 단축 될 수 있다 우물의 바닥에 coculture 회전 타원 체를 설정 하는 안정적인 혈관 형성 중요 합니다. 짧은 거리는 안정적인 혈관 형성에 대 한 유리 섬유 아 세포에서 혈관 길이 내 피 세포 및 섬유 아 세포31, 사이의 거리에 반비례 했다. 그러나, 손상 채널 1 및 3 없이 회전 타원 체 구멍 (직경에서 1 m m)를 열고, 채널 2의 최소 폭 1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 크레스트 JST (보조금 번호 JPMJCR14W4), 사회 대는 승진의 과학 (JSP) KAKENHI (25600060, 16 K 16386 번호 부여), 문 부 과학성 및 JST, 프로젝트에서 키 평가 기술 개발에 초점을 맞춘 혁신 프로그램의 센터에 의해 지원 되었다 의료 연구 및 개발, 아메드, 미즈호 기초 과학의 승진을 위한 일본 기관. 소는 교토 대학교 나노 기술 허브에 의해 지원 되었다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AutoCAD 2017AutodeskAutoCAD 2017
AZP 1350으로 코팅된 크롬 마스크.CLEAN SURFACE TECHNOLOGYCBL2506Bu-AZP
마이크로 패턴 생성기하이델베르크uPG101
MF CD-26 현상액Rohm and haas electronic materials-프로토콜 1.4
S-CleanSasaki ChemicalS-24크롬 에칭액 프로토콜 1.5
AcetonWako012-00343
실리콘 웨이퍼CanosisSiJ-4
Spin CoaterMIKASA1H-D7
Hexamethyldisilazane (HMDS)Tokyo Ohka KogyoH0089
SU-8 3050MicroChem-NegativePhotoresist in protocol 1.9
UV ExposureNanometric Technology IncLA310s
SU-8 개발자MicroChemY020100프로토콜 1.13의 네거티브 포토레지스트에 대한 개발자
2-프로판올Wako163-04841
표면 프로파일러VeecoDektak XT-S
(Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란Sigma448931
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow Corning Toray184W/C
생검 펀치 (1.0mm) 카이 인더스트리BP-10F
바이옵시 펀치 (2.0mm) 카이 공업BP-20F
플라즈마 시스템펨토 사이언COVANCE
커버 유리MATSUNAMI GLASSC024241
Culture Dishes이와키1000-035
RFP 표현 인간 배꼽 정맥 내피 세포혈관 단백cAP-0001RFP
정상 인간 폐 섬유 아세포LonzaCC-2512
내피 세포 성장 매체LonzaCC-3162
섬유 아세포 성장 미디어 키트LonzaCC-3132
DMEMThermo Fisher Scientific11965092
소 태아 혈청Thermo Fisher Scientific26140079
페니실린-스트렙토 마이신 용액Wako168-23191
0.05w/v% 트립신-0.53mmol/l EDTA• 4Na 용액과 페놀 레드Wako204-16935
PBS (인산염 완충염)타카라 바이오T900
96-웰 플레이트스미토모 베이클라이트631-21031
1000ul 칩NIPPON GeneticsFG-402
200ul  ChipNIPPON GeneticsFG-301
10ul ChipNIPPON Genetics37650
CO2 인큐베이터Thermo Fisher ScientificModel 370
GFP 발현 인간 배꼽 정맥 내피 세포Angio ProteomiecAP-0001GFP
소 플라즈마에서 추출한 피브리노겐SigmaF8630
소 폐에서 추출한 아프로티닌SigmaA6279
콜라겐 ICorning354236
소 플라즈마에서 추출한 트롬빈SigmaT4648
Hoechst 33342InvitrogenH21492프로토콜 5.5에서 핵을 염색하기 위한 형광 염료 파라
포름알데히드 용액Wako163-25983
도립 형광 현미경OLYMPUSIX71
디지털 CCD 카메라OLYMPUSORCA-R2
컨포칼 레이저 스캐닝 생물 현미경OLYMPUSFV1000
도립 형광 현미경OLYMPUSIX-83
플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란시그마FD70S
스

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  4. Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
  5. Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
  6. Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
  8. Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
  9. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  10. Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  11. Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
  12. Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
  13. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
  14. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  15. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
  16. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  17. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373(2013).
  18. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481(2013).
  19. Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  20. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  21. Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. Annual Review of Biomedical Engineering. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).
  22. Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
  23. Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
  24. Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
  25. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  26. Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
  27. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  28. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  29. Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513(2013).
  30. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
  31. Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
  32. Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
  33. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Perfusable Vascular NetworkMicrofluidic DeviceSpheroid CultureAngiogenic SproutsEndothelial CellsPDMS SlabFibrin GelHUVEC LoadingVascular AnastomosisFITC Dextran Perfusion

Related Articles