돌이킬 수 없는 Electroporation의 효과 공부 하는 Syngeneic 췌 장 암 마우스 모델

요약

돌이킬 수 없는 electroporation (분노) 로컬 고급 췌장암의 치료에 사용 하는 비 열 제거 기술입니다. 비교적 새로운 기술 이기 때문에, 종양 성장에 분노의 효과 제대로 이해 된다. 췌장암에 대 한 분노의 효과 공부 하 고 용이 하 게 syngeneic 마우스 모델을 개발 했습니다.

초록

췌장암 (PC), 미국에서 약 40000 환자 년 죽이 질병은 성공적으로 유망한 immunotherapeutic 전략을 포함 한 여러 치료 접근을 피할 수 있습니다. 돌이킬 수 없는 electroporation (분노) 따라서 종양 혈관 가까이 매우에 수행 하는 절차를 사용 하면 인접 한 collagenous 구조의 파괴 없이 종양 세포 죽음을 유도 하는 비 열 제거 기술 이다. 열 제거 기술, 달리 분노 유발 즉시 제거 괴 사, 함께 점진적 apoptotic 세포 죽음에 결과 이며 현재 로컬 고급 PC 선택 된 환자에 대 한 임상 사용. 융 제, 분노 같은 비 대상 특정 절차 종양 microenvironment에 반응의 무수 한을 유도할 수 있다. 몇 가지 연구는 다른 종양 유형, 종양 성장에 분노의 영향을 해결 하지만 아무도 PC에 집중 했다. 우리는 다양 한 경도 연구 포스트 절차를 용이 하 게 높은 통제 속에서 분노와 피하 (SQ)와 orthotopic 종양 대우 될 수 있다 성공적으로 PC의 syngeneic 마우스 모델을 개발 했습니다. 이 동물 모델 분노와 분노의 임상 효능을 개선 하는 방법의 효과 연구 하는 강력한 시스템 역할을 합니다.

서론

췌 장 ductal 선 암 (PC) 2020¹주위 미국에서 암 사망의 두 번째 주요 원인이 될 전망 이다. PC 진단 환자의 대부분은 먼 전이성 질환²에서 결국 죽을 것 이다. PC microenvironment는 악명 높게 면역 및 chemoresistant. 그것의 desmoplastic 기질 포함 이펙터 (안티 종양) T 세포의 부족 및 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam)을 포함 한 면역 백혈구의 굴지, 골수성 파생된 억제기 세포 (MDSCs), 및 규제 T 세포 (Tregs)³ . 이 microenvironment의 이러한 효과 중화 하는 복합 전략을 개발할 필요가 기반이 됩니다.

분노는 종양 절제의 비 열 방법으로 개발 되었습니다. 열 제거 기술, 달리 분노 빠른 coagulative 괴 사를 발생 하지 않습니다 있지만 대신 점진적 apoptotic 세포 죽음⁴에 결과. 중요 한 것은 췌 장 종양에 대 한 분노는 "열 싱크" 효과에 취약 하 고 혈관⁵옆 바로 수행할 수 있습니다. 이 기술은^....

프로토콜

모든 동물 실험 수행 다음이이 프로토콜 각 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인을 받아야 한다. 여기에서 설명한 모든 절차는 IACUC UCSD에 의해 승인 되었습니다.

1. 조달 받는 동물

참고: KPC 뤽 4580 셀 라인 LSL Kra에서 발생 하는 종양에서 설립 되었다^{G12D / +}; LSL-Trp53^{R172H / +}; PDX1^{Cre / +}; LSL ROSA26 ^{루크 / +} 마우스 (KPC), C57BL/6 배경에 PC의 유전자 조작된 모델입니다. 이 셀 라인의 장점은 그것 constitutively orthotopic 모델에서 종양 모니터링 luciferase 활성화 표현 한다입니다. 그러나, 다른 셀 라인으로 그들은 받는 사람 쥐의 유전 배경와 호환 사용할 수도 있습니다.

1. 사전에 실험 그룹 및 그룹 당 동물의 수를 결정 합니다.
2. 나이 (6-10 주 오래 된 마우스 권장)을 선택 하 고 섹스 가설 및 셀 선 사용 되는 동물의 사용.

2. 문화 셀

1. 사용 Dulbecco의 독수....

결과

우리는 절차를 따라 위에서 설명한 고 5-6 주 오래 된 야생 타입 C57BL/6 쥐 50 %1 x 10⁶ 세포 주사에 평방 종양 생성 BMM. 종양 크기 직경에서 5-6 m m에 도달 하면 쥐의 몇 가지 했다 안락사, 그들의 종양 excised 했다 orthotopically 받는 사람 C57BL/6 쥐에 이식. 그림 1에 타임 라인에 같이 분노 수행된 10 일 게시물을 이식 했다. 분노는 베어링 평방 종양 나머지 쥐에서 수행 되었다.

SQ에 종양, 분노 전압 및 펄스 기간 했다 일정 하 게 유지 1500 V/cm 및 100 µs, 각각, 하지만 펄스 수 변화. 그림 2 는 몇 가지 생쥐에서 평방 종양 150 펄스 분노 하지만 뿐만 아니.......

토론

이 연구에서 우리가 종양 성장에 분노의 효과 연구 하는 데 사용할 수 있는 PC에 대 한 immunocompetent 마우스 모델을 증명 하고있다. 현재, 분노 먼 질병의 수술 치료의 달 후에 진행 하지 않은 매우 선택한 로컬 고급 PC 환자에만 비 열 제거 기법으로 사용 됩니다. 그것의 사용 그러므로 제한 되었습니다 로컬 고급 PC 가진 대부분의 환자는 먼 전이성 질환²⁰를 개발 하기 때문에. 이 모델은 다양 한 확장된 치료 매개 변수 및 조합을 사용 하 여 PC에 분노의 효과 평가 하는 연구를 기반으로 될 것입니다.

프로토콜 중 고려해 야 할 가장 중요 한 것은 분노를 수행 하는 종양의 크기. 쥐 모델에 대 한 상업적으로 이용 가능한 프로브는 그들의 전극 거리 (5-10 m m)에 의해 제한 됩니다. 따라서,에서 전극 거리 보다 훨씬 더 큰 종양, 불완전 절제가 일어난다. 평방 종양에 대 한 트위터-trodes 이상의 2 바늘 배열 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ECM 830 사각 파 전기포레이터	하버드 장치	BTX # 45-0002 ( 58018-004 )
2 바늘 배열 전극	하버드 장치	45-0167
안전 풋 스위치	하버드 장치	45-0211
플래티넘 핀셋 트로드	하버드 장치	45-0486
DMEM-F12 매체	ThermoFisher Scientific	11320-033
소 태아 혈청	ThermoFisher Scientific	10437028
Trypsin	ThermoFisher Scientific	25200056
Matrigel	Corning	354230
이소플루란	시그마-알드리치, Inc.
Lacrilube	Fisher Scientific
부프레노르핀	피셔 사이언티픽
D-luciferrin	Perkin Elmer	122799
IVIS  스펙트럼 In Vivo 이미징 시스템	Perkin Elmer	124262
Mouse strain C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664/블랙 6
세포주(KPC-Luc 4580)	노스캐롤라이나
BD Precisionglide 주사기 바늘	Sigma-Aldrich, Inc.
알코올 면봉 (70 % 이소 프로필 알코올	BD	326895
디지털 캘리퍼스	ThermoFisher Scientific	14-648-17
일회용 메스, 멸균	VWR	21909
코튼 팁 애플리케이터	VWR	89198
봉합 바늘, 45cm, 크기 6-0	Harvard Apparatus	72-3308
봉합 바늘, 45 cm, 사이즈 4-0	하버드 장치	72-3314
포비돈-요오드 10%	BD	29900-404
일회용 보온 패드	켄트 사이언티픽 코퍼레이션	TP-3E
마우스 이발기	KENT SCIENTIFIC CORP.	CL8787
외과용 드레이프	하버드 장치	59-7421
인산염 완충 식염수	ThermoFisher Scientific	10010023

79263219090646NC1292810대학교 J.J. Yeh LabZ192406)