포유류 세포에 측정 Chromatin 접근 규제 요소의 포 름 알 데히드 기반 격리

진 핵 세포의 게놈 DNA는 단단히 nucleosomes 제거 하거나 DNA와 다른 단백질의 상호 작용을 허용 하기 위하여 개조 하는으로 포장 됩니다. 유전자의 transcriptional 활성화 일반적으로 이끌어 낸다¹+ 1 nucleosome 특히, nucleosomal 구조의 더 오픈 구성 RNA 중 합 효소에 의해 전사를 촉진 하기 위하여. 또한, 발기인, 증강 등의 규제 지역 chromatin 한정자 또는 녹음 방송 요인²와 상호 작용 수 있도록 그들의 chromatin 접근성에서 동적인 변화를 겪는 다. 몇 가지 방법은 이러한 nucleosome 무료 영역을 식별 하기 위해 개발 되었습니다. 이들은 DNase 같은 nucleases에 감도 나³ 또는 micrococcal nuclease⁴그것은 하지 단단히 감싸 nucleosomes 때 DNA만 액세스할 수 있습니다. 오픈 chromatin 또는 무료 DNA의 식별을 위한 다른 방법을 포함 retrotransposable 요소 (ATAC 염색 질 Transposase 액세스할 수에 대 한 분석 결과)의 중재 하는 transposase 통합⁵또는 chromatin immunoprecipitation (칩)을 사용 하 여 히스톤에 대 한 항 체 넘어갈 방법은 DNA를 도달 하는 효소의 용량 또는 특정 단백질에 항 체의 바인딩을에 기반 하지 않은 하지만 페 놀: 클로 프롬 추출^6,7nucleosome 무료 지역 정화에 의존 하는 대신. 이 방법에서는, DNA chromatin 단백질 covalently 가교 에이전트 포 름 알 데히드에 의해 바인딩되어 고 쥡니다에 의해 작은 조각 나중 전단. 그러나 DNA 영역 또는 몇 nucleosomes 거의 비슷하게 가교 된 DNA/단백질 복합물 해야한다 단단히 포장된 chromatin 지역 풍부한 DNA/단백질 crosslinks, 있을 것 이다. 페 놀: 클로 프롬 추출 정화를 비-가교 된 단백질을 DNA 가교 된 동안 수성 단계에서 무료 DNA 유기 페 놀 단계 또는 단백질 함께 수성 유기 interphase 캡처 수 있습니다. 총 DNA 샘플의 기준에 비해이 무료 DNA의 정량화 chromatin 무료 지역 식별 수 있습니다. 넘어갈 메서드를 사용 하면 여기에 설명 된 대로 개별 게놈 지역 특성에 대 한 사용할 수 있지만 다른 모델⁸ 에 설명 된 대로 깊은 시퀀싱을 결합 하면 게놈 넓은 chromatin 접근성의 식별에 적합 ^{, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. 시 키-seq와 ATAC seq 같은 다른 방법에 의해 얻은 결과 크게¹⁴를 중복. 넘어갈 방법은 매우 강력, 저렴 한, 그리고 nucleosome 무료 영역을 식별 하는 방법을 수행 하기 쉬운. 다른 메서드와 달리 nucleases (DNase seq, MNase-seq) 또는 transposases (ATAC-seq)에 필요한 소화의 적절 한 수준을 결정 하는 시범 실험을 필요 하지 않습니다 그것과 최근 검토¹⁵에서 자세히 설명. 조정 해야 하는 유일한 매개 변수는 쥡니다 조건 및 어떤 경우에 고정 시간 있습니다. 이 문서에서는 간단한 프로토콜을 개요로 그림 1 에 표시 되 고 그는 sonicator 이외의 어떤 특별 한 장비를 필요 하지 않습니다 설명 합니다. 프로토콜은 합리적으로 짧은 시간에 수행할 수 있습니다 그리고 다양 한 1 차 셀 마우스 간¹⁶에서 얻은 폐 세포¹¹ 에서 배열 하는 다른 세포 유형 chromatin 내게 필요한 옵션을 테스트 하는 쉽고 안정적인 방법 시 키 게.

1. 주 1: 세포 배양

1. 원하는 금액에 분석할 셀 문화. 세포 배양 조건 및 미디어 조사 셀 형식에 따라 달라 집니다.
   참고: 원칙적으로, 모든 진 핵 세포는 의무가 넘어갈 여 chromatin 접근성의 분석. 이 실험에 대 한 4 x 10⁶ HEK 293T 세포는 10% (v/v) FBS와 1% (w/v) 페니실린/스, 보충 하 고 5% CO₂ 와 셀 70-80%의 합류를 도달할 때까지 24 시간 동안 37 ° C에서 incubated DMEM 매체에 단일 10 cm 접시에 시드 (~ 8 x 10 ⁶ 셀 접시 당)입니다.

2. 주 2: 포름알데히드 가교와 셀 수확

주의: 포름알데히드는 매우 독성이 고 증기 두건에서 항상 사용 해야 합니다. 착용 보호 옷 (장갑 및 실험실 외 투). 폐기물을 적절 하 게 삭제 합니다.

1. 1% (v/v) (세포 배양 매체의 10 mL을 37% (v/v) 포름알데히드의 270 µ L)의 최종 농도 도달 하는 증기 두건에서 세포 배양 매체에 직접 포 름 알 데히드를 추가 합니다. 실내 온도 (20-25 ° C)에서 10 분 동안 incubate 고 슬루 판 수동으로 모든 2 분.
   참고: 가교 시간 셀 형식을 조정할 수 있습니다. 셀 라인의 대부분에 대 한 가교의 10 분의 적절 한입니다. 조직에 대 한 더 이상 외피 수 있도록 모든 셀의 고정 해야 수 있습니다.
2. 해소는 포 름 알 데히드 0.125 M의 최종 농도에 글리신을 추가 (문화 매체의 10 mL를 2.5 M 글리신 주식 500 µ L 추가). 실 온에서 5 분 동안 incubate 고 슬루 마다 2 분.
3. 3 세포를 씻어 얼음 차가운 PBS와 x (8 g/L NaCl, KCl, 1.44 g/L Na₂HPO₄ · 2 H₂O, 0.24 g/L KH₂포₄, 0.2 g/L 조정 7.4 HCl 이나 NaOH를 pH). 매체를 발음 하 고 PBS의 10 mL를 추가 하 여 셀 문화 접시 또는 플라스 크에 직접 씻어. 두 번 느슨하게 부착 세포 HEK 293T 같은 경우 매우 조심 하 고이 단계를 반복 합니다. 추가 PBS 신중 하 게 접시의 측면에는 세포의 분리를 피하기 위하여.
4. 3 세척 후 1 ml의 얼음 차가운 PBS와 얼음에 1.5 mL 반응 관에 셀 resuspend. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 필요한 경우 셀을 분리.
   참고: 시작할 때 제한 된 소재, 손실을 방지 하기 위해 샘플 절차 동안 낮은 DNA 바인딩 튜브를 사용 합니다.
5. 300 x g 냉각된 탁상 원심 분리기에 4 ° c에서 5 분 동안 원심 분리기. 신중 하 게 그것을 발음으로 상쾌한을 삭제 합니다.

3. 세포 세포의 용 해 및 Chromatin 조각화

1. 1 mL 랑 세포의 용 해 버퍼 (1% (w/v), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 10 µ g/mL leupeptin, 10 µ g/mL aprotinin, 2 밀리미터 PMSF)에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 신중 하 게 여러 번 위아래로 pipetting으로 셀을 resuspend. 얼음에 20 분 동안 품 어. 필요한 경우이 단계에서-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
2. 가교 된 200-300 bp의 평균 크기를 기울이려면 DNA sonicate sonicator의 특정 설정은 사용된 쥡니다 장치와 샘플의 각 소스에 대 한 결정 되어야 합니다. 어떤 경우에 DNA 전단 효율적으로 보장 합니다. DNA 전단에 대 한 최적화 단계 단계 5.14 설명 되어 있습니다. 샘플의 난방을 피하기 위해 쥡니다 동안 얼음에 샘플을 냉각 한다.
3. 15 분 및 4 ° c.에 13000 x g에 대 한 샘플을 원심
4. 새로운 반응 관에는 상쾌한을 전송. 100 µ L aliquots에서 샘플을 분할. 필요한 경우-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
   참고: 프로토콜이 시점에서 중단 될 수 있습니다.

4입니다. 제어 DNA의 드 가교

1. Aliquot 단계 3.4는 crosslink 반대 하 고 총 DNA에 대 한 참조로 사용할 수에서 100 µ L을 가져가 라. RNase A (10 mg/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어
2. 10 µ L의 성분 K (20 mg/mL)를 추가 합니다. 프로그래밍 가능 온도-블록을 사용 하 여 37 ° C에서 4 시간 그리고 6 h 65 ° C 단백질을 쪼개 고 리버스는 crosslinks에서 품 어. 마지막으로, 샘플 4 ° C에서 프로토콜 다시 시작할 때까지 누른 다음 5 단계로 진행 합니다.
   참고: 다른 시 키 프로토콜 참조, 따라서 데 가교¹¹에 대 한 필요성을 폐지로 가교 화 되지 않은 세포에서 chromatin 샘플을 사용 합니다. 이러한 샘플은 하지 쥡니다 효율 또는 DNA 안정성 가교 된 차이 이어질 수 있는 사실은, 따라서 총 DNA 참조 샘플을 받은 테스트 샘플으로 동일한 절차를 사용 하 여 더 정확 하 게 이다.

5. 주 3: 페 놀: 클로 프롬 정화 DNA의

1. 3.4 단계에서 aliquot는 비-드-가교 된 가져가 라. RNase A (10 mg/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어
2. 비 데 가교 된 aliquot 양식 단계 5.1와 드-가교 된 샘플 단계 4.2에서에서 하 고 동시에 진행. H₂O 도달 300 µ L의 최종 볼륨을 추가 합니다.
3. 증기 두건 및 소용돌이에서 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (25:24:1)의 300 µ L를 적극적으로 추가 합니다.
   주의: 페 놀 부식성 이며 독성이 고 연기 후드를 항상 사용 해야 합니다. (장갑 및 실험실 코트) 보호 옷을 입고, 반응 관 긴밀 하 게 폐쇄 하 고 폐기물을 적절 하 게 처분.
4. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기
5. 신중 하 게 새로운 반응 관에 위 수성 단계의 280 µ L를 전송. Interphase는 또한 단백질을 포함에서 어떤 파편 든 지를 취할 수 없어 있는지 확인 합니다. 유기 용 매 폐기물로 나머지 낮은 단계를 삭제 합니다.
6. 5.3-5.5 단계를 반복 하 고 신중 하 게 새로운 반응 관을 위 수성 단계의 270 µ L를 전송.
7. 증기 두건 및 소용돌이에서 클로 프롬의 270 µ L를 적극적으로 추가 합니다.
   참고:이 단계는 샘플에서 모든 나머지 페 놀을 제거 하는 데 사용 됩니다.
8. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기
9. 신중 하 게는 interphase에에서 어떤 파편 든 지를 수행 하지 않도록 주의 복용 새로운 반응 관을 위 수성 단계의 250 µ L를 전송 합니다. 유기 용 매 폐기물로 나머지 샘플을 삭제 합니다.
10. 5 M NaCl의 25 µ L 소 프로 파 놀의 250 µ L를 추가 합니다. DNA 운반대로 글 리 코겐 (20 mg/mL)의 5 µ L를 추가 합니다. 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어. DNA를 침전 하 4 ° C에서 13000 x g에서 10 분 원심 분리기.
11. 70% (v/v) 에탄올의 400 µ L로 DNA 펠 릿을 세척. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기
12. 상쾌한을 신중 하 게 발음 하 고 펠 릿 실 온에서 10 분 동안 건조 하자. 100 µ L TE 버퍼 (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA)에 resuspend.
13. 간 DNA crosslinks 제거를 65 ℃에서 4 h에 대 한 비 데 가교 화 무료 DNA 샘플을 품 어. -20 ° c.에 샘플 저장
14. 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA의 양을 계량 하 고 2% (w/v) agarose 젤에 조각 크기를 확인 하는 약 수를 실행 합니다. 전단 시간과 농도 조정할 agarose는 DNA 크기 분석의 결과 따라 젤 전기 이동 법, 200-300 bp의 평균 크기를 얻을.

6. 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)에 의해 무료 대 총 DNA의 결정

1. (다음 무료 DNA 라고 합니다)에 nucleosome 무료 DNA의 비율 대 총 DNA qRT-PCR^17,18에 의해 결정 됩니다. 샘플은 microarray 교 잡 또는 게놈 넓은 결정을 위한 깊은 시퀀싱에 의해 양이 많게 분석 수 있습니다 또한.
2. 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 및 테스트 영역에 대 한 정량 Pcr 뇌관 디자인.
   참고: 적합 한 긍정적인 컨트롤은 ACTB, GAPDH, TPI1, TUBA1A 등 적극적으로 베낀된 하우스키핑 유전자의 발기인에 뇌관 (β-말라, GAPDH, TPI 또는 α-Tubulin 인코딩). 적절 한 부정적인 컨트롤 섬으로 지역 또는 유전자 사막에서 발견 된다. 게놈 지역 조사 로컬 복사본 번호 차이 (표 1)에 대 한 제어를 동적으로 레 귤 레이트 된 소재 시에 인접 한 다른 적합 한 부정적인 컨트롤을 디자인할 수 있습니다.
3. TE 버퍼 10 ng / µ L의 최종 농도에 DNA 샘플을 희석 하 고 최종 계산에 대 한 계정에 희석 요인 (단계 6.5 참조).
4. 다음 반응 믹스 잘 당 96 잘 접시에 triplicates에서 정량 반응 설정: 템플릿 DNA: 20 (2 µ L), 앞으로 뇌관 200 nM (5 µ M 주식의 0.4 µ L), 역방향 뇌관 200 nM (5 µ M 주식의 0.4 µ L) 녹색 염료 (2 배 재고에서 5 µ L), 및 H₂O 10 µ L를 포함 하는 반응 혼합을 사용 하 여 상업적인 준비.
5. 절대 부 량 모드를 사용 하 여 실시간 정량 Pcr 장치에서 실행 하 고 다른 뇌관 쌍으로 샘플의 Ct를 결정. 단계 6.3에서에서 희석 요인 고려 하는 다음 수식을 사용 하 여 각 뇌관에 대 한 총 DNA에 무료 한 DNA의 회복의 비율을 계산:
   
   대표 결과 예제 계산 표 2에 제공 됩니다.
6. 샘플 간의 차이 대 한 보상, 긍정적인 통제 복구 비율에 정상화:
   

게시 된19로 HEK293T 세포에 MHC 종류 II 유전자의 chromatin 접근성에 차이 측정을 넘어갈 방법을 사용 했습니다. MHC 클래스 II 인코딩 유전자는 항 원 제시 세포 (Apc), constitutively 또는 cytokine20신호에 대 한 응답에 표시 됩니다. MHCII 유전자의 표현 XY 상자, 발기인 및이 유전자21,22의 강화 되 나 특정 DNA 요소에 바인딩하는 활성기 복잡 한에 의해 구동 됩니다. 이 MHC 종류 II 유전자 HLA DPB1 및 HLA-DMA에서 선택 된 영역의 우리의 시 키 분석에 의해 계시 된 대로, chromatin의 수준에서 반영 됩니다. 이 실험 동안 유전자 시체 (그림 2)에서 더 조밀한 XY 상자를 포괄 하는 지역에는 염색 질은 보여주었다.

예를 들어, 특정 실험에서 계산에 대 한 우리는 총을 희석 DNA 샘플 10 배 (희석 요인 10), 그리고 무료 DNA 샘플 희석 하지은 (희석 비율 1) qRT-PCR를 위한. Cts 테스트 하는 다른 지역에 대 한 고 최종 복구 비율 및 상대 복구 비율 계산에 나열 된 표 2. 이러한 상대 복구 비율 긍정적인 컨트롤로 ACTB 발기인을 사용 하 여 얻은 했다. 참고 그림 2에 표시 된 결과 생성 하는 데 사용 하는 복제의 한이 계산 됩니다.

다른 문맥에서는, chromatin 접근성 유도할 수 있는 유전자 발현에 대 한 모델에서 테스트 되었습니다. 이 경우에, chromatin 압축 프로-염증 성 자극 종양 괴 사 인자 (TNF)에 대 한 응답의 급격 한 변화를 측정 했다. 헬러 세포 치료 또는 TNF와 자극 시 키 인코딩 TNF 반응 사이토카인 인터 루 킨 8 (IL8) 유전자의 발기인 지구 제어 식에서 chromatin 압축을 측정 하 여 다음 1 시간 남았다. 이러한 결과 TNF 자극 세포 (그림 3)의 IL8 발기인에 강하게 증가 chromatin 접근성을 보였다. TNF 자극 후 IL-8 발기인에 접근성이 규제 지역에서 개장 하는 chromatin 극적인 보여주는 ACTB 발기인에 있는 보다도 높습니다. 으로 얻은 복구 비율이 경우 긍정적인 제어 (ACTB 발기인)로 사용 하는 지역에서 얻은 것 보다 더 높은 상대 복구 비율 보다 높은 수준 이다.

그림 1:이 시 키 워크플로. 셀 포 름 알 데히드 (A)를 추가 하 여 세포 배양 플라스 크 또는 접시에 직접 가교 된 있습니다. 포 름 알 데히드의 냉각 후 셀 얼음 차가운 PBS (B)로 세 번 세척 하 고 넘어갈 세포의 용 해 버퍼에서 resuspended 하 고 (C) DNA를 기울이려면 sonicated 반응 관에 전송. 추출된 chromatin의 한 약 수 총 DNA 참조 (D)에 65 ° C에서가 열 하 여 드-가교 화 이며 나중 무료 DNA 페 놀: 클로 프롬은 가교 화와 드-가교 된 aliquots (E)에서 모두를 사용 하 여 추출 됩니다. 마지막으로, DNA 정량 하 고 DNA는 총 대 무료의 비율 계산 (F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: HEK293T 세포에 MHC 종류 II 유전자에서 chromatin 접근성의 클러스터. HEK293T 세포는 시 키에 의해 분석 되었다. 사이의 비율 총 DNA 대 무료 (즉,., 상대 복구 비율) ACTB 유전자의 발기인에 대 한 긍정적인 통제, 부정적인 컨트롤로 chr. 12에 섬으로 지역 규제 지역 및는 MHC의 유전자 시체로 결정 했다 클래스 II 유전자 HLA-DMA와 HLA DPB1 상부는 로커 스의 도식 표현 및 뇌관의 위치를 보여줍니다. 오차 막대는 두 생물 복제 triplicates 측정에서 표준 편차를 나타냅니다. 그림19게시 된 보고서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: TNF 치료에 대 한 응답에서 IL8 발기인에 DNA 접근성의 변화. HeLa 세포는 TNF와 자극 했다 (20 ng/mL) 1 h와 시 키에 의해 분석. 사이의 비율 DNA ACTB (긍정적인 제어)의 발기인, chr. 12 (부정적인 제어), 섬으로 지역 및 IL8 발기인에 대 한 결정은 총 대 무료. 오차 막대는 3 생물 복제 중복 측정에서 평균 (SEM)의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 쥡니다 조건의 최적화. Chromatin 293T 세포에서 추출한 집중된 sonicator 적절 한 튜브 (자료 테이블)와 함께 사용 하 여 sonified 했다. chromatin 30의 반복으로 지정 된 시간 동안 sonicated은 다음 설정 사용 하 여 s: 피크 파워 150, 듀티 계수 15, 버스트 500, 초당 사이클 버스트 500 초당 사이클 듀티 계수 15, 30 s: 피크 전력 2.5 다음. 결과 chromatin 드-가교 화, 2 %agarose 젤에 로드 및 페 놀: 클로 프롬 추출에 의해 순화 했다. ethidium 평범한 사람 젤을 얼룩이 표시 되 고 분자량 마커의 위치 혈압에 표시 됩니다. 이 실험에서 최적의 chromatin 크기 (200-300 bp) 쥡니다의 20 분 후 얻은 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: 정량 Pcr 위한 뇌관입니다.

표 2: 예 랑 상대 복구 비율의 계산. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

저자는 공개 없다.