방법 논문

발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

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DOI:

10.3791/57301

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2018년 3월 6일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 2The Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Department of Pathology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표 후속 거세와 전립선 암 세포의 내부 전립선 주사를 설명 하는 것입니다. 안 드로 겐 의존 및 거세 저항 전립선 암의 Orthotopic 전 임상 모델은 임상 관련 종양 microenvironment 및 immunocompetent 호스트의 컨텍스트에서 질병 연구에 중요 한.

초록

여러 이점이 둘 다 피하는 하 고 유전자 변형 유전자 조작 마우스 모델 Orthotopic 종양 모델링은 전 임상 전립선 암 연구를 위한 유용한 도구입니다. 피하 종양, 달리 orthotopic 종양 임상 더 정확한 맥 관 구조, 종양 microenvironment, 및 여러 치료에 대 한 응답을 포함. 반면 유전자 조작된 마우스 모델, orthotopic 모델 저렴 한 비용으로 수행할 수 있습니다 및 더 적은 시간에서 매우 복잡 하 고 유형이 다른 마우스 또는 인간 암 세포 선의 사용을 포함 오히려 그 단일 유전 변경, 그리고이 셀 라인 수정할 수 있습니다 유전자, 표현 이미징 에이전트와 같은. 여기, 선물이 수술 쥐의 앞쪽 전립선 엽 luciferase mCherry 표현 murine 전립선 암 세포 라인을 주입 하는 프로토콜. 이러한 마우스 개발 orthotopic 종양을 비 접촉 모니터링 vivo에서 더욱더 종양 양, 무게, 마우스 생존, 및 면역 침투에 대 한 분석. 또한, orthotopic 종양 방위 쥐 했다 수술 거세, 즉시 종양 회귀 및 연속적인 재발, 대표 하는 거세 내성 전립선 암. 기술이이 절차를 수행 하는 데 필요한, 하지만이 syngeneic orthotopic 모델 모두 안 드로 겐 의존 및 거세 저항 전립선 암 분야에서 모든 조사를 위대한 사용입니다.

서론

전립선 암은 높은 발생률 (161,360 남자) 하 고 20171(84,590 남자) 제 3 대부분 남성 암 사망 원인으로 추정 된다. 진단 되 면, 전립선 종양 androgen 종속 되며 전립선 수술, 방사선 요법, 그리고 androgen 부족 요법은 (대서양 서머 타임)에 의해 처리 됩니다 아직 각 치료 관련 여러 주요 morbidities 및 합병증2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 종양 회귀 ADT 후,에 불구 하 고 거의 모든 종양 재발 거세 내성 전립선 암 (CRPC). 이 단계에서 승인 된 치료 포함 docetaxel, Sipuleucel-T immunotherapy, 안티 androgen 작은 분자 enzalutamide 및 abiraterone, 아직 아무 개별 치료 5.2 개월11, 보다는 더 많은 것의 생존 혜택 수 여 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. 전립선 암의 모든 단계에서 남자 향상 된 치료 옵션 및 morbidities, 어떤 최적의 전 임상 질병에 대 한 모델링은 중요 한 관리를 필요로 하는 따라서.

올바른 절차와 전립선 암 세포 라인 수술 두 syngeneic 또는 xenogeneic orthotopic 종양의 개발으로 이어지는 murine 전립선으로 얻은 될 수 있다. Orthotopic 종양 모델링은 모든 종양 생물학 및 약물 개발 연구, 임상 대표적인 종양 microenvironment (TME)와 종양 개발에 대 한 허용 합니다. 이전 연구는 피하 (사우스 캐롤라이나) 종양은 변경 된 종양 맥 관 구조, 안티-신생 요법18,19차동 및 더 적은 임상 정확한 응답에 지도 증명 하고있다. 또한, 여러 연구 관찰 치료 여부에 따라 동일한 셀 라인에 여러 chemotherapeutics의 증가 또는 감소 효능 관리 사우스 캐롤라이나 또는 orthotopically, 후자는 최고의 인간에서 본 것 표현 암20,,2122. 또한, 대 장 암의 orthotopic 모델에만 하지만 사우스 캐롤라이나 모델에 종양 생성 않았습니다 전이23을 유도 하는 데 필요한 올바른 degradative 효소. 마지막으로, immunotherapies 계속 암 치료의 최전선에 등장 하 고 특히 그들은 아직 전립선 암24,25, 정확한 TME syngeneic 전 임상 모델에 대 한 상당한 혜택을 제공 하 고 immunocompetent 호스트 드레이닝 림프절은 중요 합니다.

종양 사이트에 따라 이러한 일관성 없는 결과 대 한 책임 여러 가지 요인 있다. 다른 TME 암 세포 다른 조직 관련 endothelium에 노출 되 고 신생, 종양 개발26,27에 따라서 영향을 미치는 변경. 올바른 TME Orthotopic 종양 임상 관련 약물 전달, hypoxic 조건, 및 안티-신생 치료28의 평가 대 한 수 있습니다. 종종 번 식, 높은 비용, 고 대 한 번 기 절 또는 임상 관련 수준을 넘어 overexpressed 단일 또는 몇 가지 유전자의 조작에 따라 유전자 조작된 모델 (보석) 그들은 오랫동안 필요로 하는 정확한 TME 포함 할. 반면, 인간 또는 murine 전립선 암 세포 선 인간의 종양 같은 orthotopic 종양에 사용 되는 단일 세포 내와 세포29,30사이 성분 표시에 훨씬 더 많은 유전자 복잡 합니다. 또한 보석, 달리 orthotopic 암 세포 라인 이미징 modalities를 표현 하기 위해 설계 되었습니다 하거나 수 증가 또는 관심, 그리고 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험 결과의 다른 분자의 감소 수준을 직접 비교할 수 있습니다. Orthotopic 종양 또한 기본 환자 파생 된 세포에서 형성 수 있습니다. 여기, 우리 보고 orthotopic androgen 종속 종양을 형성 하 고, 거세, 후 orthotopic CRPC로 재발 하는 전립선 암 세포의 내부 전립선 주사를 수행 하기 위한 방법론.

프로토콜

이 프로토콜에서 설명 하는 동물 절차의 모든 윤리 규정 및 적절 한 대학 기관 동물 관리의 승인 및 사용 위원회 (IACUC)에 따라 수행할 수 있습니다.

1. 수술 재료와 암 세포의 준비

  1. 전에 수술, 고압 마이크로 해 부가 위, Graefe 집게, Graefe 조직 집게, 봉합 절단기, 바늘 홀더의 날 그리고 커튼의 적절 한 수 있습니다. 에틸렌 산화물 가스 (그림 1C)에 의해 50 µ L 주사기와 28 게이지 바늘을 소독.
  2. 전에 수술, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 (P/S) 37 ° C 5% CO2 배양 기에서 보충 RPMI에 10 cm 요리에서 문화 Myc 캡 셀의 하루. 발광 및 형광 종양 모니터링, 적절 한 벡터와 293T 세포 transfect 고 이후에 transduce 0.45 μ m 필터링 lentivirus31Myc 캡 셀. 100% 변환 양성으로 안정적인 셀 라인을 생성 하는 셀을 정렬 합니다.
    참고: 모든 조직 문화 무 균 조건 하에서 수행 하 고 모든 셀 라인 mycoplasma 무료 있는지 확인 합니다. Myc 모자32,이 연구에 활용 murine 전립선 암 세포 선으로 안정적으로 반딧불 luciferase과 mCherry 불리고는. C-myc에서 격리 Myc 캡 셀 라인 iss-overexpressing이 myc 마우스 및 이러한 셀 포함 증폭된 androgen 수용 체 (AR), 안 드로 겐 의존32 고 murine 거세33후 CRPC 종양을 형성. 이 연구에서 모든 마우스는 6-8 주 오래 된 남성 FVB/뉴저지 쥐. 대체 murine 전립선 암 세포 선 immunodeficient 마우스 함께 적절 한 유전 배경으로 인간의 전립선 암 세포 선 또는 기본 환자 파생 전립선 암 세포의 마우스와 함께 사용할 수 있습니다. 최적의 주입 당 셀 수 대체 셀 라인에 대 한 실험적으로 결정 되어야 합니다. 또한, 대안 이미징 형식 종양, 자기 공명 영상 (MRI), 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 또는 계산 된 단층 촬영 (CT)를 포함 하 여 mCherry 대신 GFP 뿐만 아니라 시각화를 활용할 수 있습니다.
  3. 수술 전날 밤 matrigel 지하실 멤브레인 매트릭스와 페 놀 레드 무료에 얼음 해 동 4 ° C에서 배치 합니다.
  4. 수술 당일에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 그들을 세척 하 고 0.25 %trypsin-EDTA와 분리 하 여 세포를 수집 합니다. 10 %FBS 1%와 RPMI trypsin 중화 P/s.
  5. 5 분에 대 한 400 x g에서 셀 원심
  6. FBS 또는 P/미 없이 RPMI의 10 mL로 세포 세척
  7. 셀을 계산 하 고 resuspend 6.67x107 셀/mL (1 × 106 셀/15 µ L)의 농도에 PBS에 셀.
  8. 1 × 106 셀/30 µ L의 최종 농도에 1:1 PBS/matrigel 세포 현 탁 액을 만들려고 matrigel의 동일한 볼륨을 추가 하 고 응고를 방지 하기 위해 주입까지 얼음에 셀을 계속.
    참고: 준비 matrigel 셀 정지 3 h 이내 내 전립선 주사를 수행 합니다. 5 개 이상의 쥐에 내 전립선 주사를 수행 하는 경우 신선한 matrigel 세포 현 탁 액을 준비 하는 위의 단계를 반복 합니다.

2. 수술 마우스 준비

참고: 대학 동물 시설에서 수술을 하기 전에 적어도 1 주일에 대 한 적절 한 적응을 위해 허용 하 고 동물의 스트레스를 최소화 하기 위해 집 쥐. 2.1 2.6 단계는 외과 의사 조 수에 의해 수행 됩니다. 모든 후속 수술 단계 살 균 기술로 무 균 장갑과 수술 도구를 사용 하 여 외과 의사에 의해 수행 됩니다.

  1. Isoflurane (챔버를 통해 유도 2-5%, 코 콘을 통해 유지 보수에 대 한 1-3%)와 마우스 anesthetize 발가락 핀치 반사의 손실에 의해 전체 유도 확인 합니다.
  2. 쥐 무게 진통 buprenorphine의 적어도 0.05 mg/kg를 관리 하 고 사우스 캐롤라이나
    참고: 마우스 무게 ≥20 g 성공적인 내 전립선 주사에 이상적입니다.
  3. 안과 연 고 윤 활 양쪽 눈 각 막 건조 방지 하기 위해 적용 됩니다.
  4. 복 부에서 모든 털을 면도.
  5. 무 균 알코올 잎사귀 뒤 살 균 비 준수 패드를 사용 하 여 수술 스크럽의 원형 응용의 3 라운드로 복 부를 소독. 복 부 건조를 허용 합니다.
    주: 수술 절차의 나머지 부분에 대 한 멸 균 장갑과 수술 도구 수 문의 소독된 마우스 복 부.
  6. 깨끗 한 수술 현미경의 목적은 바로 아래 난방 패드에 깨끗 한 표면에 부정사 마우스를 전송 합니다.
  7. 작은 구멍 커트가 복 부 살 균 드 레이프와 마우스를 커버.

3. 내부 전립선 주입

참고: 무 균 조건 하에서 모든 수술 단계를 수행 합니다. 현미경, 마우스 배치, 또는 조정 기타 비 멸 균 개체 외과 의사 조 수에 의해 수행 되어야 합니다.

  1. 수행 된 우수한 음을 preputial 동맥 (그림 1D) 복 부의 중간 선 따라 외부 피부의 약 1 cm 절 개.
  2. 레이어 사이가 위를 열어 결합 조직 외부 복 부 피부와 내부 복 부 근육 사이 구분 합니다.
  3. 창 자 또는 방광 (그림 1D)를 puncturing 피하려고 근육 인상 집게를 사용 하는 동안 내부 복 부 근육의 비슷한 절 개를 수행 합니다.
  4. 양자 정액 소포 (그림 1A, 흰색) 중 하나를 찾습니다/앞쪽 전립선 엽 (그림 1A, 블랙), 후부, 측면, 그리고 방광 (그림 1A, 노랑), 하지만이 약간 우수한 자주는 쥐 사이 다를 수 있습니다. . 앞쪽 전립선 돌출부는 반투명 흰색 정액 소포의 낮은 곡률에 연결 된.
  5. 부드럽게 puncturing 정액 소포 (그림 1E) 하지 않고 조직에 긴장을 만들 Graefe 조직 집게를 사용 하 여 정액 소포의 팁을 올립니다.
  6. 혼합 Myc 모자 matrigel 솔루션 이방인 pipetting (외과 의사 조 수에 의해 수행)로 셀 pelleted 할 수 있습니다, 천천히 공기 방울을 피하기 위해 바늘으로 30 µ L (1 x 106 셀)를 발음 하는 고.
  7. 조심 스럽게 앞쪽 전립선 엽의 긴 축에 바늘 병렬의 경사를 삽입 합니다. 엽으로 30 µ L를 천천히 주입 하 고 천천히 누설 (그림 1 층)을 방지 하기 위해 바늘을 철회. 앞쪽 전립선 엽 (그림 1G)의 engorgement에 의해 적절 한 주입을 확인 합니다.
  8. 조심 스럽게 잡고 정액 소포와 대략 30에 대 한 마우스 외부 주입된 전립선 엽 부분적으로 엽 내 응고 matrigel 있도록 s. 이 시간 동안 멸 균 폴 리 에스테 르 밀고 주걱을 사용 하 여 주입된 전립선 엽에 누르지 않고 비 orthotopic 종양 개발을 방지 하기 위해 복 부에 어떤 셀 솔루션 누설을 수집 합니다.
  9. 조심 스럽게 반환 정액 소포 및 주사 전립선 엽 복 부에는 엽에 압력을 주지 않고. 대체 어떤 외부화 조직.
  10. 5-0 vicryl 흡수 역 절단 바늘 봉합 내부 복 부 근육을 연속 봉합을 수행 합니다.
  11. 4-0 나일론 monofilament 비 흡수 역 절단 바늘 봉합 외부 복 부 피부를 닫습니다 중단된 봉합을 수행 합니다.
    참고: 멸 균된 9 mm 스테이플 또한 외부 복 부 피부를 사용할 수 있습니다. 그러나, 봉합, 달리 그들은 모든 후속 발광 및 형광 종양 영상 신호 방해 합니다.
  12. ()를 열어 외과 의사 보조 살 균 에탄올 잎사귀와 함께 모든 도구를 청소 하 고 마우스를 사용 하기 전에 건조 도구 30 s. 허용에 대 한 유리 구슬 살 균 기에 넣어.
  13. 나머지 matrigel에 의해 막힘을 방지 하기 위해 주사기와 멸 균 식 염 수 ()를 열어 외과 의사 조 수에서에서 바늘을 플러시.
    참고: 외과 의사 보조 해야 합니다 모든 작업에 대 한 존재 혼합 주사 전에 Myc 모자 matrigel 솔루션으로 모든 비-불 임 수술 마우스 준비와 수술 마우스 케어. 시간을 최소화, 각 내부 전립선 마우스 절차는 20-30 분을 요구할 것 이다로, 외과 의사 보조 외과 의사는 현재 마우스를 봉합으로 다음 마우스를 준비 시작할 수 있습니다.

4. 수술 마우스 케어

  1. 1 mg/kg 진통 meloxicam의 관리 즉시 사우스 캐롤라이나, 24 h, 그리고 수술 후 48 h.
  2. 쥐 없는 침구 난방 패드에 중간 위치에 복구할 수 있습니다. 때까지 그들은 다시 정상 성과 활동, 후 감 금 소의 바닥에 음식 가진 깨끗 한 감 금 소에는 수술 후 적어도 30 분 동안 쥐를 모니터링 합니다.
  3. 또한 수술 후 매일 적절 한 상처 치유, 몸 무게, 손질, 및 ambulation에 대 한 마우스를 모니터링 합니다. 싸움의 증거에 따라 개별 연습장으로 별도 마우스.
  4. 수술 후 14 일 이내 모든 나머지 봉합을 제거 합니다.

5. 발광 종양 영상

  1. 살 균 필터링 Na+ 또는 K+ 제조 업체에 의해 설명 하 고 빛에서 보호로, D-소를 준비 합니다.
  2. 소의 몸 무게의 10 µ L/g와 intra-peritoneally 마우스를 주입할 수 있습니다.
  3. 적어도 10 분 후, IVIS 스펙트럼 이미징 시스템, 이미지 마우스 이전34,35설명.
  4. 앞에서 설명한34,35생활 이미지 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다.
    참고: 이미징 분석 IVIS 성공적인 전립선 내 주사 및 실험적인 그룹 간의 종양 부담 정상화를 초기 종양 개발을 결정 하는 데 유용 합니다. 그러나, 발광 또는 형광 신호 강도 따라 포화 될 수 있습니다 고원 실제 종양 크기에서 증가도 불구 하 고 이미지 정량화. 따라서, 종양 성장의 나중 단계에서 IVIS 이미징 이미지 채도 후 성공적인 치료 시 종양 크기의 감소 보다는 크기에서 증가 확인 하기 위해 더 유용할 수 있습니다.

6. 종양 컬렉션, 종양 분석, 생존 끝점

  1. 분석에 대 한 종양을 수집, CO2 노출 및 보조 자 궁 경관 탈 구, 또는 대체 IACUC 승인 방법으로 마우스를 안락사 하 고 해 부 복 부에서 종양 고통 없이. 종양에는 전립선에 위치 orthotopically 이어야 한다.
    참고: 종양 전방 복 벽에 연결 된 또는 복 부에 걸쳐 시드 가난한 또는 새 내 전립선 주입, 나타내고 orthotopic 종양으로 간주 되지 해야 합니다.
  2. 종양의 무게.
  3. 계산 종양 볼륨으로 π/6 × L × W × H (L = 종양, W의 가장 긴 축의 길이 = 수직 너비, H = 수직 높이).
  4. 종양 조직학 (10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 수정)에 의해 분석 될 수 있다, cytometry 흐름 (단일 셀 정지를 만들기), 단백질 (RIPA 버퍼에서 lysate 조직 준비), 또는 RNA (RNAlater에 즉시 장소 조직).
  5. 면역 분석, 전립선 종양 배출 파라 대동맥 림프절 (그림 1B, 오렌지)와 비장 수집 또한.
    참고: 만약 마우스 생존에 대 한 다음,이 모델의 끝점 출혈 복 부 ascites36 의 모양으로 정의 및/또는 ambulation, 손질, 및 piloerection37을 감소. 마우스 생존 분석에 대 한 사전 및 수술 후 진통 (프로토콜 단계 2.2, 4.1)를 수신 하 고 정기적으로 모니터링 해야 합니다. 어떤 싸움 발생 경우, 위의 끝점 표시기의 모양을 따라 고통 없이 안락사 해야 쥐 개별 연습장으로 분리 되어야 한다.

7. 외과 거세 CRPC를

  1. CRPC를, 수행 위의 내 전립선 주입 프로토콜 (프로토콜 단계 1-5).
  2. 적어도 1 주일 후, 종양 개발 후 앞에서 설명한38서 열화를 통해 외과 거세를 수행 합니다.
  3. 발광 영상으로 종양 회귀 및 재발을 모니터링 합니다. 거세, 후 종양 회귀 3 일 이내 발생 하 고 종양 재발 CRPC 대표 약 30 일 이내에 발생 합니다.

결과

이 원고에서 우리 수술 주입 murine 전립선 암 세포 선, Myc-모자, (그림 1A), 이전 전립선 엽으로 임상 관련 TME와 올바른 orthotopic 전립선 종양의 개발으로 이어지는 전립선 배출 림프 노드 (그림 1B). 이 28 게이지 바늘 (그림 1C) 마이크로 해 부가 위, Graefe 집게, Graefe 조직 집게, 봉합 절단기, 바늘 홀더 및 50 µ L 주사기를 사용 하 여 수행 되었다. 약 1 cm 중간 복 부 절 개 preputial 동맥 (그림 1D) 위에, 1 개의 정액 소포 및 연결 된 앞쪽 전립선 엽 위치 및 (그림 1E) externalized 후 수행과의 30 µ L (1 x 106 세포)는 1:1 PBS/matrigel 세포 현 탁 액은 전립선 (그림 1 층), 엽의 engorgement와 누설 (그림 1G)의 부족에 의해 처음으로 확인에 주입 했다.

모니터링 orthotopic 종양의 성장, 우리 안정적으로 페 Myc 모자 셀으로 반딧불 luciferase과 mCherry, 비-침략 적 vivo에서 생물 발광 (그림 2A) 및 형광 (그림 뒤에 종양에 대 한 허용 2B), 각각. 이 영상의 한 한계는, 신호의 강도 따라 정량화 이미징 수 포화 종양 크기에서 증가 하 고 있는 동안 이다. 따라서, 높은 신호 강도 가진이 vivo에서 화상 진 찰은 처음 실험 그룹 간에 종양 부담을 정상화 하 고 나중에 실험적 치료 후 종양 크기에서 감소를 결정 더 유용 합니다. 추가적인 이미징 형식 또한 이용 될 수 있다, MRI, 애완 동물, 또는 코네티컷 작은 동물 등

Orthotopic 종양 복 부에서 전립선 내 주사 (그림 3A) 후 30 일에는 해 부 했다. Orthotopic 종양 앞쪽 전립선 엽의 사이트에 위치 해야 합니다. 종양은 복 부에 걸쳐 대 중 또는 전방 복 벽에 부착 된 부적 절 한 내 전립선 주입 및 누설을 나타냅니다. 적절 한 기술, 종양 볼륨 (그림 3B)와 무게 (그림 3C) 상대적으로 적은 표준 오류를 기록할 수 있습니다. 그러나, 관찰, 크고 작은 종양 질량을 가진 어떤 변화 있을 것입니다. 따라서, 실험 무기 간의 종양 부담을 맞춰야 전처리 영상 정량화의 초기 사용은 모든 실험에 대 한 중요 합니다. 또한, 이러한 murine 암 세포 immunocompetent FVB/뉴저지 쥐로 주입 했다로 TME CD3 T 세포 (그림 3D) (또는 다른 면역 세포 유형) immunohistochemistry (IHC) (또는 cytometry 또는 다른 기술)에 의해 분석할 수 있습니다. 마지막으로,이 모델 (그림 3E) 대형 기본 종양 질량 원인 출혈 복 부 ascites36 으로 객관적인 생존 끝점을 제공 하거나 ambulation, 손질, 및 piloerection37감소 합니다. 때때로, 죽음 또한 소변 출력을 차단 하는 종양 성장에 의해 발생할 수 있습니다.

마지막으로,이 모델은 androgen 종속 전립선 암 CRPC, 후자는 빈약한 예 지를 수 여 하 고 새로운 치료 옵션의 필요를 모두 공부 하 고 활용할 수 있습니다. Orthotopic 종양 개발 후 마우스 했다 수술 거세, 앞에서 설명한38로. 이것이 두 번째 주요 생존 수술, 여분 배려 복구 및 부작용 또는 합병증에 대 한 모니터링을 제공 합니다. 거세 후 3 일 이내 강한 종양 회귀 CRPC (그림 4A) 대표 약 30 일 후 후속 종양 재발 다음 관찰 되었다. CRPC 종양 조직학, 분석 그리고 그들은 높은 아칸소 수준을 유지 하 고 neuroendocrine 마커, synaptophysin (그림 4B)에 대 한 부정적인 어떤 neuroendocrine 차별화를 표시 하지 않습니다 해 부 될 수 있다.

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그림 1: 앞쪽 전립선 엽, 배수 림프 노드 및 내부 전립선 세포 주사에 대 한 대표적인 기술. (A) 오른쪽 앞쪽 전립선 엽의 이미지 (검정, *), 오른쪽 정액 소포 (흰색), 오른쪽 고환 및 지방 패드 (녹색), 방광 (노란색), (B) 양자 전립선 배출 파라 대동맥 림프절 (오렌지), (C)를 첨부 마이크로 해 부가 위, Graefe 집게, Graefe 조직 집게, 봉합 절단기, 바늘 홀더 및 28 게이지 바늘 (왼쪽), (D) 중간 절 개, (E) 정액 소포와 앞쪽 전립선 엽 50 µ L 주사기 외부화, (F), 내 전립선 주입, 및 (G) engorgement 앞쪽 전립선 엽의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 2: vivo에서 발광 및 형광 종양 영상. (A) Luciferase-와 (B) mCherry-표현 orthotopic Myc 모자 종양 IVIS 스펙트럼 이미징 시스템을 사용 하 여 몇 군데 있었다. 생물 발광은 총 속 (광자/s)에 의해 정량 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 3: 종양 부피, 무게, 면역 침투, 및 생존을 위한 조직학 Orthotopic 종양 분석. Orthotopic 종양 내 전립선 주사 후 30 일에 해 부 되었고 분석 (A) 총 영상, (B) 종양 볼륨 (π/6 × L × W × H; L = 종양, W의 가장 긴 축의 길이 = 수직 너비, H = 수직 높이), (C) 종양 무게, (D) CD3 IHC (눈금 막대 = 100 µ m), 그리고 복 부 출혈의 모습으로 객관적인 끝점 (E) 생존 ascites입니다. (A-B) 평균 ± 표준 오차의 의미로 표현 하는 데이터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 4: 내부 전립선 주사 androgen 종속 전립선 암과 CRPC를 후속 외과 거세. (A) orthotopic luciferase 표현 종양 방위 쥐 했다 생물 발광 사전 및 사후 거세 (Cx)에 의해 몇 군데와 (B) 재발 CRPC 종양 했다 해 부 (검은 orthotopic = 전립선 종양, 노란색 = 방광) H 분석 & E, 아칸소 IHC, 및 (와 함께 긍정적인 murine 제어) synaptophysin IHC (눈금 막대 = 50 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 원고에서 우리 외과 내 전립선 암 세포 주사를 수행 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 안 드로 겐 의존 및 MYC-overexpressing 활용 (MYC overexpression 볼까지 인간 전립선 암39의 80-90%) murine 전립선 암 세포 선, Myc-모자, 원래이 Myc 마우스32 에서에서 격리 33. 이 셀 라인 luciferase와 발광 및 형광 종양 영상 비-침략 적 비보에 대 한 mCherry를 각각 표현 하 불리고 안정적 이었다. 더, 외과 거세 또한 androgen 종속 종양 개발, 종양 회귀 및 연속적인 재발 후 수행 되었다. 따라서, 우리는 세부 모델 orthotopic androgen 종속 전립선 암 및 CRPC immunocompetent 호스트에 제공 합니다.

Myc 캡 셀 쥐의 앞쪽 전립선 엽에 주입 했다. 마우스 전립선 앞쪽, 복 부, 그리고 dorsolateral 전립선 엽의 구성 되어 있으며 인간의 전립선 주변 영역, 과도 영역 및 단일 엽40내의 중앙 영역 구성 됩니다. 이전 연구는 해부학과 조직학 비교 인간의 주변에 dorsolateral 마우스 엽 동안 구역, 전립선 암41의 대부분과 이전 마우스 엽 인간의 중앙 영역42, 의 사이트 43, 더 최근과 포괄적인 분석 앞쪽 엽과 dorsolateral 엽 복 부 엽에 비해 밀접 하 게 관련된 유전자 표현 패턴 표시를 보여주었다. 44 추가, 전립선 암 개발 보석40, 앞쪽 엽에서 관찰 되었습니다. 그리고 내 전립선 절차에 대 한 최소한의 누설 암 세포 솔루션의 필요한 볼륨의 주입을 위해 앞쪽 엽 수 그리고 다양성입니다.

사우스 캐롤라이나 및 유전자 변형 보석을 사용 하 여 암 모델은 여러 개의 결함 및 제한. 인공 TME에서 성장 하는 사우스 캐롤라이나 종양 같은 셀 라인 및 인간 질병20,,2122에서 두 orthotopic 종양 달리 chemotherapies 차동 응답 있다. 이 안티-신생 치료18,19차동 반응에 의해 exemplified로 사우스 캐롤라이나 종양의 변경된 맥 관 구조 때문일 수 있습니다. 그와 반대로, orthotopic 종양 적절 한 TME, 배출 림프절 및 맥 관 구조, 개발 하 고 murine 셀 라인, 그로 인하여 또한 종양 면역학 및 immunotherapies에 대 한 응답의 분석에 대 한 수 있도록 수행할 수 있습니다.

유전자 변형까지 개발 된 immunocompetent 호스트에 적절 한 TME 종양 아직 이러한 모델은 일반적으로 단일 또는 몇 가지 유전 변경29와 종양을 개발 하 여 인간의 암을 지나치게 단순화. Myc 모자 및 다른 전립선 암 세포 라인의 분석은 그들은 훨씬 더 큰 체세포 복사 번호 변경 및 종양이 Myc 마우스 및 어떤에서 그들이 파생된29다른 보석 보다 염색체 변경 포함 된 밝혔다. 또한, 보석 쥐 충분 한 전력의 실험을 수행 하기 위해 번 식에 필요한 시간과 비용 증가 의해 제한 됩니다. Orthotopic 종양 모델링은 이러한 한계를 극복할 수 있다. 인간과 murine 전립선 암 세포 선 인간의 질병29, 관련이 많은 유전 변경 포함 하 고, 인간의 암 처럼 표시 또한 개별 셀30사이 좋은. Orthotopic murine syngeneic 종양 면역 분석에 대 한 허용 orthotopic 하면서 인간의 xenogeneic 종양 허용 인간 세포에 치료제의 분석. 마지막으로,와 달리 보석, 셀 라인 주입, 종양 성장, 모니터 발광 또는 형광 분자 이미징의 표현에 대 한 수 있도록 표준화 실험 그룹 간의 종양 부담 하기 전에 수정할 수 있습니다 모니터링, 처리 하 고 응답 따라 종양 회귀와 외과 거세 후 CRPC 되풀이 합니다.

이 프로토콜의 중요 한 단계를 찾는 등 다른 조직 손상 또는 세포의 30 µ L의 성공적인 내부 전립선 주사를 수행 정액 소포를 puncturing 없이 정액 소포와 연결 된 앞쪽 전립선 엽을 외부화 누설, 그리고 복 부에 걸쳐 비 orthotopic 종양의 개발을 방지 하기 위해 어떤 누설을 제대로 수집 하지 않고 현 탁 액. 내 전립선 주사의 주요 한계 쥐 사이 종양 변화를 최소화 하는 데 필요한 기술을 달성 이다. 이 외과 거세의 추가 변수가 CRPC 모델링에 대 한 특히 중요 하다. 내 prostatically 주입 하 고 거세 쥐 해야 합니다 또한 따라야 밀접 하 게 복구 및 불리 한 이벤트에 대 한 그들은 두 개의 주요 생존 수술 받은 대로. 또 다른 한계는 각 내부 전립선 주입의 시간 이다. 이 감소 될 수 있다을 최저 20 분, 그리고 외과 의사 조 수 준비 다음 마우스 현재 마우스 봉합 되 고. 마지막으로, orthotopic Myc 모자 종양 공격적, 빨리 성장 하 고는 생존 끝점 약 46 일에서 (35 일) 기본 종양 때문에 도달 하는 종양 질량입니다. 느린 종양 개발 또는 장기 치료를 필요로 하는 연구 초기 주입 세포 수 및 치료 처방에 대 한 경험적으로 최적화 되어야 합니다. 사우스 캐롤라이나 종양 및 보석의 한계, 달리 모든 orthotopic 종양 모델의 위의 한계 극복 될 수 있다, 그리고 프로토콜의 추가 수정 개별 실험 요구 사항에 따라 만들 수 있습니다.

orthotopic로 종양 모델 생체 외에서의 사용을 포함-처리 셀,이 연구의 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 여기, 우리는 안정적으로 luciferase vivo에서 종양 모니터링을 위한 mCherry을 표현 하는이 세포 수정. 우리는 또한 종양 억제기 PTEN, orthotopic 종양 (원고 검토에서)로 빠르게 성장 하는 공격적인, 임상 관련 셀 라인을 생성 하는 CRISPR Cas9 녹아웃을 수행 했습니다. Orthotopic 종양 모델, androgen 종속 전립선 암 CRPC, 및 이미징 형식 또는 최저 또는 overexpress 선택 유전자 표현을 공부 하는 능력의 장점으로이 프로토콜 모두를 위한 귀중 한 자원으로 역 전립선 암 연구입니다.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Sarki Abdulkadir (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995), 그리고 조나단 Anker (NCI F30 CA203472) 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Myc-CaP 세포주ATCCCRL-3255사용 전 마이코플라스마가 없는지 확인
마이크로 해부 가위RobozRS-5910
Graege 집게RobozRS-5135
Graefe 조직 집게RobozRS-5150
봉합사 절단기가 있는 Olsen-Hegar 바늘 홀더FST12002-12
50 &마이크로; L 주사기 705 RN SYRHamilton7637-01에틸렌 옥사이드 가스로 살균
28게이지 바늘 스몰 허브 RNHamilton7803-02포인트 스타일 4, 각도 45°C, 길이 0.75인치. 에틸렌 옥사이드 가스로 멸균
RPMIGibco18875-093
FBSGibco10437-028
Pencillin/StreptomycinGibco15140-122
PBSGibco14190-144
0.25% 트립신-EDTAGibco25200-056
Matrigel 기저 멤브레인 매트릭스, 페놀 레드 프리, LDEV 프리Corning3562374°C에서 얼음 위에서 해동; C 사용 전 하룻밤
IsofluraneHenry Schein11695-0500-2Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM)에서 획득26
5/8 게이지 주사기BD309597멜록시캠 및 부프레노르핀 주사용
부프레노르핀 하이로클로라이드 0.3 mg/mL12496-0757-5규제 물질, Northwestern University CCM
Ophthalmic에서 획득 연고 윤활제Akron17478-162-35
Betadine 수술용 스크럽(포비돈-요오드, 7.5%)Purdue Products67618-151-16
멸균 비접착 패드Moore Medical10775
멸균 알코올 물티슈Fisher Scientific22-363-750
수술용 현미경 Stemi DV4Zeiss
멸균 폴리 에스테르 팁 애플리케이터Puritan25-806 1PD
5-0 vicryl 흡수성 역 절단 바늘 봉합사eSuturesJ493G
4-0 나일론 몬필라멘트 비 흡수성 역 절단 바늘 봉합사eSutures699H
유리 구슬 살균기Fine Science Tools18000-45
멸균 식염수 0.9 % 염화나트륨Hospira0409-4888-02
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mLHenry Schein11695-6925-1Northwestern University CCM
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrateGoldbioLUCNA
IVIS Spectrum Imaging SystemPerkinElmer
Cauery 수술용 펜Bovie Medical CorporationAA01
CD3&엡실론; 항체 (클론 2GV6)Ventana790-4341
캘리퍼스Fisher Scientific14-648-17
안드로겐 수용체 항체Thermo ScientificRB-9030-P11:500 염색 희석
Synaptophysin 항체 (클론 Z66)Life Technologies18-01301:200 염색 희석

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