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방법 논문

골 Adipocytes 차별화에 흑색 종 세포 유래 요인의 이중 효과

5.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57329

⸱

2018년 8월 23일

 ,  ,  , 
1Department of Rheumatology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 2Department of Nephrology and Rheumatology, Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University, 3Department of Medical Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University

이 논문에서

요약

여기, 우리 골 adipocytes에 흑색 종 세포 유래 요인의 이중 효과 보여준다 종양 세포와 골 adipocytes, 사이 상호 작용을 공부 하기 위한 안정적이 고 간단한 2 차원 (2D) coculture 시스템 제시 차별화 및 뼈 전이의 기계 론 적인 연구에 대 한 전통적인 방법 포즈.

초록

골 adipocytes와 종양 세포 사이 누화 뼈 전이 하는 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 다양 한 방법 공부 하는 중요 한 누화; 사용할 수 있습니다. 그러나, coculture에 대 한 2 차원 transwell 시스템은 고전적인, 신뢰할 수 있는, 그리고이 누화 연구에 대 한 쉬운 방법 남아 있다. 여기, 우리 골 adipocytes 및 흑색 종 세포의 coculture을 보여 주는 자세한 프로토콜을 제시. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 coculture 시스템 수 골 adipocytes에 의해 유도 된 암 세포의 세포 신호 transductions의 연구에 기여할 뿐만 아니라 또한 기계적으로 뼈에 대 한 새로운 치료 목표를 드러낼 수 있는 뼈 전이의 연구 전이입니다.

서론

뼈 전이 고급 암 환자 중 광범위 하지만 치료 치료는 아직 사용할 수 없습니다. 지방으로 에너지를 저장 전문, 넘어 adipocytes 골 수 및 다른 장기1,2,,34,,56에서 종양 성장 및 전이 지원할 수 있습니다. 또한, adipocytes 암 세포 생물학7,,89,10 및 대사4,11,12 조절에 필수적인 역할을 재생 ,13,14,,1516, 잘에서 뼈 전이1,,412로. 골 틈새, adipocytes도 암 세포4,,617의 생물 학적 행동을 달라질 수 있습니다. 골 adipocytes osteotropism와 암 세포 사이 상호 작용에 대 한 뼈 전이의 이해 중요 하다. 그러나, 약간은 알려진 다.

현재 연구를 바탕으로, 다양 한 방법은 adipocytes, 2 또는 3 차원 (2/3 차원)와 비보 전 문화17,,1819,20,21을 포함 하 여 적용 됩니다. 최근, Herroon 그 외 여러분 암 세포22골 adipocytes의 상호 작용을 공부 하는 새로운 3D 문화 접근 방식을 설계 되었습니다. 3D coculture는 생리를 흉내 낸 위한 최적의 adipocytes와 암 사이 상호 작용 세포 vivo에서, 그것은 가난한 재현성22,23에서 고통. 2D coculture 시스템에 비해 3D coculture 시스템 셀 형태학21,22,,2425,26같은 다른 세포질 고기를 제공할 수 있습니다. 또한, 고립 된 수가 뼈 조직 파편의 비보 전 문화 adipocytes의 강력한 파생물 교양된 골 셀17에서 발생할 수 있습니다.

그러나 이러한 이전 모델과 달리, 2D 셀 문화 모델 남아 있다 고전, 안정적이 고 쉽게 기술 생체 외에서1, 세포를 신속 하 게 스캔 후보 분자와 고기 adipocytes 또는 암에 변경에 대 한 4,6,12,,1527. 더 잘 이해 하려면 골 adipocytes와 흑색 종 세포 사이 누화, 우리 흑색 종 세포와 골 adipocytes의 2D coculture 시스템에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

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프로토콜

참고:이 프로토콜에서 사용 하는 모든 셀 냉동된 재고 셀에서 녹고 후 적어도 3 세대에 대 한 성장 해야 합니다.

1. 수확 흑색 종 세포 파생 요소

  1. 준비
    1. B16F10 세포 및 마우스 흑색 종 세포 라인을 얻을.
      참고:이 프로토콜에 대 한 마우스 흑색 종 세포 선 과학의 중국 아카데미의 줄기 세포 은행에서 얻은 했다.
    2. B16F10 세포 배양 (100 mL)에 대 한 완벽 한 매체를 확인 합니다. Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린, 50 U/mL 및 50 µ g/mL 스 보충을 사용 합니다.
    3. 혈 청 무료 매체 B16F10 세포 (50 mL)의 기아에 대 한 확인 합니다. DMEM 매체 FBS 없이, 페니실린, 50 U/mL 및 50 µ g/mL 스 사용 합니다.
  2. 흑색 종 조절 매체 (CM)를 준비
    1. 100 m m에서 씨 2.0 x 105 B16F10 세포 10%의 10 mL와 FBS DMEM 요리. 다음 24 h에 대 한 5% CO2 의 분위기 속에서 37 ° C 배양 기에서 세포를 품 어.
    2. 셀 합류의 약 80%에 도달, 문화 매체를 제거, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (1x, pH 7.4)의 5 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 10 mL 혈 청 무료 매체는 기아에 대 한 매체를 바꿉니다.
    3. 18-24 h에 대 한 보육을 셀을 반환 합니다.
    4. 기아, 후 한 피 펫과 바른된 매체 (CM)를 수집 하 고 신선한 50 mL 원심 분리기 튜브에 그것을 전송.
      참고: 조절된 매체 B16F10 세포 배양의 상쾌한입니다. B16F10 세포 CM를 수집 하기 전에 좋은 조건에는 다는 것을 확인 하십시오.
    5. 1000 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 CM을 원심
    6. 플라스틱은 상쾌한 하 고 신선한 무 균 튜브 또는 병에 그것을 전송.
      참고: 아래쪽 튜브의 펠 릿에서 pipetting 하지 마십시오.
    7. 셀 파편 제거, 살 균 병 또는 튜브 주사기 연결 0.45 μ m 필터를 통해 그것을 전달 하 여 CM을 필터링.
      참고: 0.22 μ m 필터는 CM을 필터링 하는 데 적합 합니다.
    8. -20 ° C에서 필터링 된 상쾌한 사용까지 저장 합니다.
      참고: 그것은-20 ° C에서 상쾌한 1 달 이상에 대 한 저장 하지 것이 좋습니다. 또는, 체형의 분화에 대 한 시간 더 연장된 기간에 대 한-80 ° C에서 CM을 저장 합니다.

2. 흑색 종 세포에서 파생 된 요소에 의해 골 Adipocytes의 유도

  1. 준비
    1. Adipogenic 유도 중간28의 100 mL를 확인 합니다. 완전 한 DMEM 인슐린, 0.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1 µ M dexamethasone의 5 µ g/mL와 보완을 사용 합니다. 4 ° c.에 2 주까지 저장하시오
    2. Adipogenic 유지 보수 매체의 100 mL를 준비 합니다. 완전 한 DMEM 사용 또는 50%의 흑색 종 5 µ g/mL의 인슐린으로 보충 하는 CM와 혼합.
    3. 기름 빨간 O 재고 솔루션을 확인 합니다. 소 프로 파 놀 (≥ 99.5%)의 10 mL에 기름 빨간 O 가루 30 mg을 녹이 고 소용돌이 의해 잘 그들을 믹스.
      참고: 4 ° c.에서 1 년 저장
    4. 기름 빨간 O 작업 솔루션을 확인 합니다. 증기 두건에서 3: 2의 비율에 있는 이온된 수로 (2.1.3 단계)에서 기름 빨간 O 재고 솔루션을 희석. 실 온에서 15 분 동안 혼합물을 품 어 하 고 사용 하기 전에 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.
      참고:만 2 시간 안에 신선한 작업 솔루션을 사용 합니다.
  2. 체형 차별화
    1. 문화 stromal 세포 5% CO2의 분위기 속에서 37 ° C 배양 기에서 80 %confluency 완전 한 DMEM와 60 mm 접시에 마우스 골 수29 에서 14F1.1 라인.
      참고:은 주 골 수 유래 중간 엽 세포3014F1.1를 또는 바꿉니다.
    2. 1-2 분 동안 인큐베이터에 0.25 %trypsin 솔루션의 1.5 mL와 셀 trypsinize
    3. 셀에 10 %FBS 매체의 5 mL을 추가 하 고 유리 hemocytometer;와 셀 숫자의 개수 계산 다음 1-2 105/mL x 약 셀 밀도 조정 합니다.
    4. 씨앗 5 x 104 24-잘 접시에 잘 당 14F1.1 세포의 adipogenic 유도 매체의 0.5 mL와 함께. 2 일 후 부 화, 셀 합류의 약 90%에 도달.
      참고:이 단계는 매우 중요 한입니다. 골 수 기질 세포 adipogenic 유도 매체 없이 adipocytes에 유도 될 수 없습니다.
    5. 유도 매체를 제거 하 고 씻어 1 mL의 PBS로 두 번 셀 때마다.
    6. Adipogenic 유지 보수 매체의 1 mL를 변경 하 고 adipocyte 성숙까지 셀 문화 계속.
      참고: 현미경, adipocytes 소형 또는 대형 비누 방울 처럼 모양과 아주 쉽게 인식할 수 있습니다. 일반적으로, 성숙 adipocytes 6번째 또는 8번째 날에는.
    7. 기름 빨간 O와 성숙한 adipocytes 얼룩 또는 adipocytes 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 분석을 위해 수집.
  3. 체형 얼룩
    1. 워시 차별화 된 14F1.1 세포를 PBS로 2 배 및 1 h 3.7% 포름알데히드에 그들을 수정.
    2. 60% 소 프로 파 놀 셀 린스를 완전히 건조 하도록 허용 합니다.
    3. 우물에 기름 빨간 O 작업 솔루션의 0.2 mL를 추가 하 고 0.5 ~ 2 h에 대 한 실 온에서 품 어.
    4. 셀 언바운드 염료를 제거 하는 물으로 씻는 다.
    5. 가벼운 현미경 염색된 adipocytes 사진.

3. 흑색 종 세포와 골 Adipocytes의 coculture

  1. 준비
    1. 성숙한 뼈 골 수 adipocytes 준비: 2 일, adipogenic 유도 매체와 24-잘 접시에 성숙한 BM adipocytes에 14F1.1 세포를 유발 하 고 다음 추가 6-8 일에 대 한 adipogenic 유지 보수 매체에서 그들을 유지.
    2. B16F10 세포 준비: DMEM 매체의 5 mL와 60mm 요리에서 B16F10 세포 문화.
    3. 축 축 하 게 막 삽입 (예: transwell): 0.4 µ m 기 공 크기 막 삽입을 FBS 무료 DMEM 매체의 150 µ L을 추가 하 고 24-잘 접시 가득 FBS 무료 DMEM 매체의 500 µ L의 우물에 그들을 담가.
  2. Coculture 설정
    1. 천천히 각 삽입의 매체에서 피 펫입니다.
      주: 매체를 분리할 때 막을 삭제 하지 마십시오.
    2. 3.2.1 단계에서 시드 B16F10 세포 (0/103/105/106) 0.4 µ m 기 공에 삽입합니다.
    3. 3.1.1 단계에서 성숙 골 adipocytes에 우물에 adipogenic 유지 보수 매체를 바꿉니다. 완전 한 DMEM 매체의 600 µ L와.
    4. Coculture 실험 (3.2.3 단계)에서 성숙 골 adipocytes와 우물에 (에서 단계 3.2.2) B16F10 세포로 가득 삽입 전송.
    5. 2 일 동안 37 ° C, 5% CO2 cocultures를 품 어.
    6. 외피의 48 h 후는 coculture의 삽입을 제거 하 고 다음 씻어 adipocytes 2 x 1 x PBS의 500 µ L.
      참고: 필요한 경우 필요에 따라 분석에 대 한 삽입에서 B16F10 세포를 수집 합니다.
    7. 기름 빨간 O 작업 솔루션 adipocytes 얼룩 또는 정량 분석을 위한 adipocytes 수집.
      주: 단계 2.3에서에서 착 절차를 참조 하십시오.
    8. 가벼운 현미경 염색된 adipocytes 사진.

4. 정량 분석 체형 관련 유전자 서명의

  1. 24-잘 접시에서의 준비에 사용 RNA 격리 시 약 잘 당 0.5 mL를 추가 성숙한 체형에 검색할 준비가 되어.
  2. RNA 추출 및 cDNA 합성31에 대 한 표준 프로토콜을 따릅니다.
  3. 18S와 GAPDH 뇌관을 사용 하 여 컨트롤 및 CEBPα/β, 가진, FABP4, leptin, Pref-1, 또는 adiponectin 체형 관련 유전자 서명 (표 1)에 대 한.
  4. 다음 반응 열 cycler에서 실행: 20 95 ° C s 1에 대 한 95 ° C의 40 주기 다음 s 및 20 60 ° C s.
  5. 2-ΔΔCt 메서드를 사용 하 여 배32변경 계산 하.

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결과

골 수에서 adipocytes 녹는 요인을 통해 종양 진행을 지원 하기 위한 초기 단계에서 종양 microenvironment1,13,33,,3435 에 나타날 수 있습니다 또는 osteoclastogenesis6,,1236, 특히 비만6,12 노화37의 컨텍스트에서 활성...

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토론

Cocultures 삽입과 셀 상호 작용을 공부 하 널리 사용 되었습니다. 2D coculture 시스템 어떻게 두는 우리가 여기 골 adipocytes에 두 개의 다른 암 세포 기반 효과 보여주는 누화에서 생체 외에서부품을 관찰 하는 효과적인 방법입니다. 많은 연구소는 adipocytes 및 암 세포6,12,,2739사이 누화를 조사 하기 위해이 방법을 활용 하 고 있다.

일반적으로, 따라서, 2D coculture 셀 누화 연구에 가장 간단 접근 이다. 그러나, 그것에 올 때 undifferentiated 셀 라인 추가 연구에 대 한 준비, 몇 가지 독특한 도전 있다. 여기에 설명 된 프로토콜에서 골 수 기질 세포의 기능 상태를이 a...

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공개 사항

저자는 선언할 수 없다.

감사의 글

우리 Dov Zipori (바이 츠만 과학 연구소, Rehovot, 이스라엘) 친절 하 게 제공에 감사 우리 murine 골 수 기질 세포 라인 14F1.1. 이 연구는 중국 국가 자연과학 기초 (81771729 번)과 충칭 의료 Yongchuan 병원 대학 (개에서 교부 금에 의해 지원 되었다 YJQN201330; YJZQN201527)입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMInvitrogen 주식 회사
소 태아 혈청Invitrogen Inc.16000– 044
인산염 완충 식염수Invitrogen Inc.14190-144
인슐린시그마-알드리치91077C
3-이소부틸-1-메틸-크산틴시그마-알드리치I5879
덱사메타손시그마-알드리치D4902
오일 레드 o시그마-알드리치O0625
24웰 플레이트코닝CLS3527
트랜스웰 인서트MilliporeMCHT24H48
페니실린/스트렙토마이신Invitrogen15140-122
이소프로판올Sigma-AldrichI9516
0.25% 트립신Thermo Scientific25200056
혈구계Bio-Rad1450016
배양 인큐베이터Thermo Scientific
50 mL FalconCorningCLS430828
클린 벤치Thermo Scientific현미경
Olympus-200
μ L 피펫 팁BeyoGoldFTIP620
1,000mL 피펫 팁BeyoGoldFTIP628
11965092

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