방법 논문

멀티-omic 토양 샘플의 분석을 위한 MPLEx 프로토콜

DOI:

10.3791/57343

⸱

2018년 5월 30일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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프로토콜은 동시에 하나의 토양 샘플에서 대사 산물, 단백질과 지질을 추출, 감소 샘플 준비 시간 허용 및 한정 된 수량으로 샘플의 멀티-omic 질량 분석 분석을 활성화에 대 한 제공 됩니다.

초록

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질량 분석 (MS)-기반된 통합된 metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic (멀티-omic) 연구 우리의 능력을 이해 하 고 환경 및 생물 학적 시스템에서 미생물 지역 사회 특성을 변형 시키고 있다. 이러한 측정도 가장 복잡 한 토양 미생물 커뮤니티의 향상 된 분석 사용 하 고 있습니다 현재까지 알려진 복잡 한 미생물 시스템. 그러나 멀티-omic 분석,, 있다 샘플 준비 과제, 별도 기사는 일반적으로 매우 준비 시간과 필요한 샘플의 양을 증폭 각 omic 연구를 위해 필요 하기 때문. 이 한계를 해결 하기 위해 3-에서-1 방법 같은 토양 샘플에서 대사, 단백질, 지질 (MPLEx)의 동시 추출 용 매 기반 접근을 적응 하 여 만들었습니다. 이 MPLEx 프로토콜은 모두 간단 하 고 많은 샘플 유형에 대 한 강력한 복잡 한 토양 샘플의 한정 된 수량에 대 한 활용 하는 경우에 입증 되었습니다. MPLEx 메서드는 또한 크게 생물학과 환경 물결 따라 변화를 평가 하는 동안 각 미생물 커뮤니티의 구성원의 더 나은 이해를 얻기 위하여 필요한 급속 한 멀티-omic 측정을 사용할 수 있습니다.

서론

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토양 미생물 지역 사회 평가 탄소 순환, 기후 변화를 이해 하기 위한 중요 한 의미를 갖는다. 그러나 최근 연구는 어려움을, 다양 한 토양 유형 microbiota에 대 한 시퀀스 게놈의 부족 및 감지 하는 단백질의 많은 것의 알 수 없는 기능 등을 강조 했다. 이러한 도전 결과1,,23현재까지 알려진 가장 복잡 한 미생물 지역 사회 토양 때문. 멀티-omic 분석, metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic 연구에서 결과 결합 하는 최근 미생물 존재, 동안에 더 큰 이해를 얻기 위해 수많은 토양 연구에서 구현 되었습니다. 때문에 환경 섭1,,45분자 변화에 대 한 포괄적인 정보를 얻는. 멀티-omic 연구와 함께 한 가지 문제는 질량 분석 (MS)-기반으로 metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic 측정은 일반적으로 각 omic MS 호환

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프로토콜

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참고: 매우 젖은 토양 이전 효과에 손해 없이 추출 추출의 lyophilized 수 있습니다. 젖은 토양 또한 사용 될 수 있지만 특정 비율에 시 약을 추가할 때 고려해 야 합니다.

참고:이 좋습니다 추출, 두 50 mL 튜브 (최대 50 mL 튜브 당 10 g 토양) 사이 분할 한다 당 건조 한 토양 중량의 20 g을 사용 하 여. 추출 또는 사용 가능한 샘플에 따라 다름 아래로 확장할 수 있습니다.

참고: 건조 한 토양 샘플 균질 하 고 작은 뿌리와 바위를 제거 하기 위해 3 m m 스크린을 통해 sieved 될 수 있습니다. 샘플 화면에 붙어 얻을 것 이다 젖은 토양 샘플을 체질 하지 마십시오.

1. 토양 세포 세포의 용 해 및 대사, 단백질, 지질 (타이밍 ~ 1 d)의 추출

  1. 20 g 토양 샘플 당 메탄올/클로 프롬 호환 되는 두 개의 별도 50 mL 튜브에 10 g를 무게. 조심 선택, 튜브와 함께 클로 프롬 샘플 오염 대부분 플라스틱 거르는 것으로 합니다. 유리를 사용 하 여 언제 든 지 가능한 또는 플라스틱 튜브 폴 리 프로필 렌 또는 소계 (PTFE)에서 만든.
    참고: 계속 멋진 얼음 토양 초기 무게 및 균....

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결과

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MPLEx 프로토콜은 캔자스 네이티브 대초원 토양 (Mollisol 토양)에서 분자를 추출 하는 데 사용 됩니다, triplicate 분석 3376 펩 티 드, 105 지질 및 102 극 대사 (모든 고유 식별)에 대 한 결과 제공. 반면 MPLEx 프로토콜 지질과 대사 산물12,13,14,15,,1617,18의 일반적인 추출 잘 설립 되었습니다 ,19,

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토론

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그것은 특정 방법, 예를 들어 세포 단계, 적응 시킬 수 있다 그래서 모든 실험실 같은 사용 가능한 장비 해야한다 참고 해야 합니다. 그러나 여기 우리 사용 vortexing sonicating, 큰 50 mL 비드 때리는 사용 하 여 작동 합니다. Lyophilizer-105 ° C의 온도 수집기와 사용할 수 없는 경우 샘플 질소 스트림 아래 건조 수 있습니다. 또한 토양 유형을 크게 다르며 모래, 갯벌, 찰 흙,이 탄, 및 옥 토 (등), 포함 될 수 있습니다 그리고 그들은 또한 pH, 염 분, 유기 물 풍부에 따라 달라질 수 있습니다. 유연 하 고 필요할 때 조정 하는 것이 중요 하다 그래서 각 이러한 차이 프로토콜에 영향을 가질 수 있습니다. 그러나 그것은 중요 한,, 그 비율 및 백분율 동일 하 게 유지입니다.

MPLEx 프로토콜 수많은 생물 및 환경 시스템 및 토양 미생물 지역 사회의 멀티-omic 분석을 활성화 하는 기능에서 응용 프로그램에 대 한 큰.......

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공개 사항

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

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작가 네이 선 존슨 수치 준비에 그의 원조에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는 미국 에너지 부의 사무실의 생물학과 환경 연구 (게놈 과학 프로그램), 전환 (민트) 실험실 감독 연구 개발에 Microbiomes에 의해 투자 되는 팬-omics 프로그램에 의해 지원 되었다 퍼시픽 노스 웨스트 국립 연구소, 국가 연구소의 건강 국립 연구소의 환경 건강 과학 (R01 ES022190)에서 이니셔티브와 NIH (P42 ES027704). KEBJ는 R21 HD084788 개발 하 고 새로운 멀티-omic 추출 기법 검증 재정 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에는 W. R. 윌 환경 분자 과학 실험실 (EMSL), 미상 국가 과학적인 사용자 시설 평화로운 북 서 국립 연구소 (PNNL)에서 수행 되었다. PNNL은 Battelle 계약 드-AC06-76RL01830에서 DOE에 대 한 운영 하는 멀티 프로그램 국립 연구소 이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
클로로포름시그마-알드리치650498-20°C에 보관됩니다. C ! 주의: 클로로포름은 급성 잠재적인 건강 영향, 피부 자극 및 가능한 화학적 화상, 호흡기 계통 자극, 신장, 간, 심장에 영향을 미칠 수 있습니다. 적절한 보호 안경, 의복 및 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.
메탄올Sigma-Aldrich34860-20°C에 보관됩니다. C ! 주의: 메탄올은 호흡기, 피부 및 눈 자극을 유발할 수 있으며 신경, 신장 및 간을 손상시킬 수 있습니다. 적절한 보호 안경, 의복 및 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.
MilliporeMilli-Q정수 시스템의
나트륨 도데 실 설페이트시그마 - 알드리치L6026! 주의: SDS는 급성 독성을 일으키며 가연성입니다. 피부, 눈 및 기도에 자극을 줍니다. 장갑과 보안경을 착용하십시오.
토양 단백질 추출 키트MoBio, NoviPure 토양 단백질 추출 키트, Qiagen30000-20
DL-dithiothreitolSigma-Aldrich43815
1M Trizma HCLSigma-AldrichT2694
Trichloroacetic acidSigma-AldrichT0699! 주의: TCA는 부식성, 독성이 있으며 피부 화상을 유발할 수 있습니다. 장갑과 보안경을 착용하십시오.
아세톤시그마-알드리치650501-20°C에 보관됩니다. C ! 주의: 아세톤은 호흡기와 피부 및 눈 자극을 유발할 수 있습니다. 가연성 액체 및 증기. 보안경, 장갑, 실험복을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.
우레아시그마-알드리치208884! 주의: 요소는 눈과 피부에 자극을 주므로, 장갑과 안전 안경을 사용하십시오
암모늄 바이카보네이플루카09830
트립신프로메가V528A20&마이크로; g 바이알
, Bicinchoninic acid protein assay kit, Pierce23227
Ammonium Formate, Sigma-Aldrich09735
Acetonitrile, Sigma-Aldrich34998! 주의: 아세토니트릴은 피부와 눈을 자극합니다. 가연성이 높습니다. 장갑과 보안경을 착용하십시오. 흄 후드에서 작업하십시오.
트리 플루오로 아세트산시그마 - 알드리치T6508! 주의: TFA는 피부 접촉, 눈 접촉, 섭취 및 흡입 시 매우 위험합니다. 특히 눈, 입 그리고 기도의 점막에 조직 손상을 일으킬 수 있습니다. 피부에 닿으면 화상을 입을 수 있습니다. 장갑, 실험복, 보안경을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.
메톡시아민 염산염시그마-알드리치226904! 주의: 메톡시아민 염산염은 심한 화상과 눈에 심각한 손상을 일으키며 피부 접촉에 의해 과민성을 유발할 수 있습니다. 보안경, 장갑 및 실험복을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.
피리딘시그마-알드리치270970! 주의: 피리딘은 피부와 눈에 자극을 일으키고 중추 신경계를 억제할 수 있습니다. 증기는 섬광을 일으킬 수 있습니다. 보안경, 장갑 및 실험복을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.
N-메틸-N-(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드와 1% 트리메틸클로로실란시그마-알드리치69478! 주의: MSTFA + 1% TMCS는 피부 부식, 심각한 눈 손상 및 특정 표적 장기 독성을 유발할 수 있습니다. 가연성 액체 및 증기. 보안경, 장갑 및 실험복을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.
염화칼Sigma-AldrichP9541
Milli-Q 정수 시스템Millipore모델 MPGP04001
VortexScientific IndustriesSI-0236Vortex Genie 2
프로브 초음파 발생기FisherBrand모델 FB505
냉장 원심분리기Eppendorf모델 5810R
50mL 튜브 스윙 버킷 로터EppendorfA-4-44
50mL 고정각 로터EppendorfFA-45-6-30
BalanceOHAUS모델 V22PWE150IT
혈청학 피펫 컨트롤러Eppendorf12-654-100
10mL, 25mL 유리 혈청학 피펫FisherBrand13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer ThermotopEppendorf5382000015 포함, 5308000003
0.9 – 2.0 mm 블렌드 스테인리스 스틸 비드NextAdvanceSSB14B
0.15 mm 가넷 비드MoBio13122-500
자석 교반 플레이트FisherBrand11-100-16SH
자석 교반 바FisherBrand14512130
pH 종이 스트립, pH 범위 0– 14FisherBrandM95903
15mL, 50mL 원추형 폴리프로필렌 원심분리기 튜브Genesee Scientific21-103 21-108클로로포름 호환
50mL 와류 부착MoBio13000-V1-50
얼음 양동이FisherBrand02-591-44
27.25x70mm 유리 바이알FisherBrand03-339-22K
호흡 더 쉬운 플레이트 멤브레인Midwest ScientificBERM-2000
알코올 와이프Diversified BiotechBPWP-1000
히터 셰이커 인큐베이터벤치 마크, Incu-Shaker 미니
아날로그 로티 세리 튜브 로테이터SoCal BioMed, LLC82422001
필터 지원 샘플 준비 키트FASP; Expedeon44250
마이크로플레이트 리더Biotek, EPOCH-
섭씨 20도 냉동고Fisher13986149-80
섭씨 냉동고스털링 초저온SU78OUE
Q-Exactive 이온 트랩 질량 분석기Thermo Scientific
Agilent 7890A 기체 크로마토그래프와 단일 사중극자 결합 5975C 질량분석기Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap VeloThermo Scientific
Waters NanoEquityTM UPLC 시스템Millford, MA
250mL 미디어 병FisherBrand1395-250
Waters 바이알Waters186002805
Glass MS 시료 바이알 및 인서트MicroSolv9502S-WCV, 9502S-02ND
Glass HPLC 바이알 및 스냅 캡MicroSolv9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC 96웰 플레이트Agilent5042-6454
대형 유리 바이알 27.25x70mmFisherBrand03-339-22K
동결건조기Labconco7934021
광택 스테인리스강 납작머리 주걱Spoonula; FisherBrand14-375-10
Kim 와이프Kimberly-Clark34721
XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 μ M with 4.6x20 mm guard columnWaters186003117, 186003064
Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템Agilent TechnologiesG1380-90000
1.7mL 원심분리기 튜브Sorenson11700
Hamilton 유리 주사기, 5mL, 50µ L 및 250µ LHamilton81517, 80975, 81175
파스퇴르 피펫FisherBrand13-678-20A
파스퇴르 피펫 전구Sigma-AldrichZ111597
Bath SonicatorBranson 1800 초음파 세척기
진공 원심 분리기Labconco Centrivap 내산성 농축기 시스템
MicroSpin 컬럼, C18 실리카둥지 그룹SEM SS18V
은 정제수.. 트 , , 륨 물 도

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
  2. White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from com....

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