신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관의 절연

요약

인간의 뇌 조직에서 분리 된 뇌 모세 혈관 장벽 기능 생리 및 병 태 생리 조건에서 공부 하는 전 임상 모델으로 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 제시.

초록

생리 및 병 태 생리 조건 이해 혈액-뇌 장벽 함수는 두뇌 약물 전달 향상, 두뇌 보호, 개선 및 두뇌 치료 약속을 잡고 새로운 치료 전략의 개발에 대 한 중요 한 장애입니다. 그러나, 인간의 혈액-뇌 장벽 기능을 공부 하 고 도전 이다. 따라서, 적절 한 모델에 대 한 중요 한 필요는. 이와 관련, 뇌 모세 혈관 뇌 조직에서 분리 가능한 상황 인간의 vivo에서 가까운으로 장벽 기능을 공부 하는 독특한 도구를 나타냅니다. 여기, 우리는 일관 된 품질과 순도 높은 수확량에서와 인간의 뇌 조직에서 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 모세 혈관에서 신선한 인간의 뇌 조직의 기계적 균질, 밀도 기울기 원심 분리, 여과 사용 하 여 격리 됩니다. 격리, 후 인간의 뇌 모세 혈관 단백질 표정 그리고 기능, 효소 활동, 또는 세포내 신호를 공부 하 누설 분석 실험, 라이브 셀 이미징 및 면역 기반 분석 등의 다양 한 애플리케이션에 사용할 수 있습니다. 고립 된 인간의 두뇌 모세는 인간의 혈액-뇌 장벽 기능의 규정 명료 하 독특한 모델입니다. 이 모델은 중앙 신경 조직 (CNS) 병 인, CNS 질환 치료를 위한 치료 전략의 개발에 도움이 될 것입니다에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

서론

혈액-뇌 장벽 혈액과 무슨 들어가는 및 두뇌에서 결정 하는 뇌 간의 긴밀 하 게 제어 인터페이스입니다. 해부학, 내 피 세포 혈액-뇌 장벽을 구성 하 고 복잡 한, 지속적인 모 세관 네트워크를 형성 한다. 순수,이 모 세관 네트워크는 동시에 이산화탄소와 대사 폐기물의 처분 하는 동안 산소와 영양소와 뇌를 제공 합니다. 중요 한 것은, 증거는 배리어에 변화 Alzheimer의 질병, 간 질, 및 뇌졸중^1,2,3,,45 를 포함 하 여 수많은 병 리에 기여 지원 ^{, 6 , 7}. 뇌 내 피 세포도 예뇌에 약물 흡수를 차단 하 여 치료에 방 벽으로 봉사., 화학 요법 세포종 님 다음 종양 절제술^8,9, 의 ¹⁰

프로토콜

아래 내용은 현재 안전 및 규제 표준 켄터키의 대학, 렉 싱 턴, 켄터키, 미국에서 기반으로 합니다. 안전 예방책으로 서 인간의 조직으로 작업 하기 전에 기관의 생물 안전 프로그램 최신 규정 및 권장 사항을 참조 하십시오.

주의: 인간의 조직 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), B 형 간염 바이러스 (HBV), C 형 간염 바이러스 (HCV), 및 다른 사람을 포함 하 여, 혈액을 매개로 병원 균의 원천이 될 수 있습니다. 인간의 조직 사용 혈액을 매개로 병원 체 감염의 위험을 포즈. 따라서, 특정 규제 및 안전 고려 사항은 실험실 직원을 보호 하기 위해 인간의 조직 작업할 때 필수적입니다. 미국에서 인간의 조직 작업 biosafety 수준 2 실험실 안전 조치 및 NIH 섹션 IV-B-7, 1970 절 5(a)(1) 및 사용자의 기관 생물 안전 프로그램의 OSHA Act에 따라 훈련을 요구 한다. 일반적으로, 인간의 물질 (조직, 체액)와 관련 된 어떤 연구를 수행 하기 전에 기관 Biosafety 위원회 및 기관 검토 위원회의 승인을 얻어야 합니다. 훈련과 인간의 재료를 사용 하는 모든 직원에 대 한 필요 포함 되어 기본적인 실험실 안전 교육, 예를 들어, 화학 위생 및 실험실 안전, 생물 안전, 유해 폐기물, 그리고 인....

결과

인간의 뇌 조직에서 격리 큰 혈관, 적혈구, 다른 단 세포와 일부 세포 파편의 작은 양의와 인간의 뇌 모세 혈관 (그림 1B)에 농축 현 탁 액을 산출 한다. 일부 모 세관, 분기 하 고, 일부, 적혈구는 모 세관 루멘에서 속은. 일반적인 모 세관 3-7 µ m 직경을가지고 있으며 약 100-200 µ m 오픈 루멘;와 긴 대부분 모 세관 끝 축소 됩니다. Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여, 고립 된 인간의 뇌 모세 혈관 관, 그대로 구조 및 형태학을 계시 하 고. 그림 2A 대표 전송 연결된 pericyte와 루멘 적혈구 모 세관 인간 두뇌의 밝은 이미지를 보여 줍니다. 직경, 크기, 형태에 관한 연구 결과의 모든 이전 보고서 고립된 뇌 모세 혈관^12,,

토론

현재 프로토콜 신선한 조직에서 그대로 하 고 가능한 인간의 두뇌 모세 혈관의 격리를 설명합니다. 이 섹션에서 우리에 대해 자세히 다음: 1) 프로토콜, 2) 일반적인 오류 문제 해결, 3) 기술의 한계, 4) 기존 기준 모델 및 대체 혈액-뇌 장벽 모델의 중요성에 대 한 수정 및 5) 고립 된 인간의 뇌 모세 혈관에 대 한 잠재적인 응용 프로그램입니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 신선한 인간의 담당 조직의 10 g에 최적화 되어 있습니다. 그러나, 그것은 상대적으로 간단 하 게이 절차에 대 한 수정: 조직, 2) 고정된 뇌 조직, 또는 3) 뇌 조직 이외에 담당 뇌 영역에서의 10 g 보다 1) 더 많거나 적은. 첫째,과 뇌 조직의 10 g 보다 다소 버퍼의 필요한 볼륨 간단 하 게 확장할 수 있습니다 위 또는 조직의 사용 가능한 양을 아래로. 따라서, 뇌 조직의 5 g를 사용할 수 있는 경우에 버퍼의 양은 절반으로 감소 한다. 둘째, 우리가 사용 하는 신선한 뇌 조직, 모 세관.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium	VWR, Radnor, PA, USA	32916-636
PPE 일회용 보호 랩코트	VWR, Radnor, PA, USA	470146-214	PPE; 인체 원료의 특성으로 인해 일회용 실험실 코트의 사용이 권장됩니다
. 페이스 쉴드, 일회용	Thermo Fisher Scientific, 피츠버그, 펜실베니아, 미국	19460102	PPE; 인체 원료의 특성상, 일회용 페이스 쉴드의 사용이 권장됩니다
안전 재료
Clavies 고온 오토클레이브 백 8 x 12	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20"	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	14-206-32	작업 영역 담당
VWR Sharps Container Systems	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	75800-272	중고 메스
표백제 8.2% Clorox 살균 64 oz.	영국 공급 센터, 렉싱턴, 켄터키, 미국	323775
Equipment
4 ° C 냉장고	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	13-986-148
Accume BASIC AB15 pH	Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	AB15
Heidolph RZR 2102 Control	Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA	501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	75004521
Leica L2 해부 현미경	Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove, IL, USA		막을 제거하는 데 사용
POLYTRON PT2500 Homogenizer	Kinematica AG, Luzern, Switzerland	9158168
Scale P-403	Denver Instrument, Bohemia, NY, USA	0191392
Standard mini Stir	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar	Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA	11-670-4C	는 조직을 동결하는 데 사용됩니까?
Voyager Pro Analytical Balance	OHAUS, Parsippany, NJ, USA	VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope	Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA		분리된 모세관
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	21377823T1	세척 모세관 제거
필터 Finnpipette II 피펫 100-1,000 &마이크로; L	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	21377821T1	BSA
Pipet Boy	Integra, Hudson, NH, USA	739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs	VWR, Radnor, PA, USA	21008-951
EISCO 메스 블레이드	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	S95938C	뇌 조직을 다지기 위해
필름	VWR, Radnor, PA, USA	52858-000	비커 및 부피 플라스크 처리
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	21-377-304	필터에서 모세혈관 세척
Luer-Lok	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	BD309653	모세혈관 여과를 위해 커넥터 링과 함께 사용
메스 핸들 #4	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	10060-13
Dumont Forceps #5	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	11251-10	수막을 제거하는 데 사용
Potter-Elvehjem Tissue Grinder	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	3431E25	50 mL 용량, 여유 공간: 150-230 μ m
Dounce 균질화 기	VWR, Radnor PA USA	62400-642	15 mL 용량, 클리어런스 : 80-130 μ m
스펙트럼/메쉬 우븐 필터(300 &마이크로; m)	Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA	146424	현탁액을 여과하여
pluriStrainers(기공 크기: 30 µ m)	pluriSelect Life Science, 라이프치히, 독일	43-50030-03
커넥터 링	pluriSelect Life Science, 라이프치히, 독일	41-50000-03
절연 버퍼 준비를 위한	1L 부피 플라스크
			1% BSA 및 Ficoll® 제조용; Ficoll<
Schott 병 (60 mL			);
얼음 양동이			모든 것을 차갑게 유지하는
100mm 페트리 접시	뇌 조직의 다지기를 위한
	VWR, Radnor, PA, USA	89260-222	원심분리
<강한>화학
BSA 분획 V, A-9647	Sigma-Aldrich, St. 미국 미주리주 루이스	A9647-500g	Ca2+ & Mg2+ 전날. 준비하는 동안 거품을 피하십시오. 냉장고에 보관하십시오. 사용하기 전에 10분 동안 천천히 저어줍니다.
Ca2+ 및 Mg2+	Hyclone	SH30264.FS	DPBS - 절연 버퍼
Ficoll PM400	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F4375	여기서 정확한 측정이 중요합니다. 젓는 막대가 있는 병에 넣어 무게를 잰다. DPBS를 첨가한 후 세게 흔듭니다. 냉장고에 보관하십시오. 아침에는 맑을 것입니다. 사용하기 전에 10-15분 동안 부드럽게 저어주십시오. 사용할 때까지 얼음에 넣어 보관하십시오.
포도당(D-(+) 포도당)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G7528	포도당(D-(+) 포도당) 농도: 5mM
수산화나트륨 표준 용액	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	71474	DPBS의 pH 조정
	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P2256	농도: 1mM

. 수는 파라 모혈관 다중 재사용 1% BSA 교반 막대 준비를 위한 1L 비커 sup>® 준비를 위한 페트리 접시 의 일부