Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

포유류의 신경 활동은 정보 전송 시간과 뇌 영역^1,2,,34사이 지원 네트워크 진동에 의해 조정 됩니다. 뇌 리듬 포함 매우 느린 (< 0.8 Hz) 초고속 (> 200 Hz) 주파수에서 배열 하는 진동. 증거의 큰 몸 인식^{5,6,7,,89,10 포함 하 여 다양 한 뇌 기능에 네트워크 진동의 참여 지원} , 파 킨 슨 병과 간 질^13,,1415등 정신병 질환 뿐 아니라 타고 난 행동^11,12 . 네트워크 진동의 실험 조작에 대 한 선택적이 고 일시적으로 정확한 방법 따라서 동기화의 순수 그럴듯한 모델의 개발 및 행동 인과 링크를 설정 하기 위한 필수적입니다.

네트워크 동기화는 다양 한 생물 학적 기판 및 프로세스, 흥분 및 네트워크 연결의 neuromodulation 이온 채널의 분자 id 및 그들의 활동에서 배열에 의해 중재 됩니다. 많은 뇌 리듬, 어떤 (예를 들어, 주파수, 진폭)의¹⁶ 를 공개 하는 발전기는 리듬의 생물학적 설계 뚜렷한 세포 유형 및 네트워크의 역학에 대해 가져온. 예를 들어, 금지 수 주 셀 somata를 대상으로 주파수 대역 및 뇌 영역^17,18, 세타^19,20, 감마²⁰ 를 포함 하 여 가장 중요 한 선수는 ^{, 21}, 그리고 리플 (140-200 Hz)²² 진동. 차례 차례로, 먼 셀의 위상 동기화 강력한 피드 포워드 신호 피라미드 세포의 수의 발사를 다시 설정 하 여 보장 됩니다. 진동, 동기화 된 신경 인구 크기의 중요 한 매개 변수 측정된 LFP 진동의 진폭에 밀접 하 게 관련 하 고, 적어도 빠른 진동에 따라 달라 집니다 수²에 흥분 성의 드라이브. 델타와 세타 리듬, 같은 느린 진동 cortico thalamic^23,24 hippocampal 중간 septal 예측^25, 에 의해 형성 된 장거리 재진입 루프에 의해 생성 되는 반면, ^26,27, 각각. 같은 회로에 진동 신호 전파 지연, 고르기, 반응과 참여 셀^28,,2930, 에 그들의 주파수 설정의 상호 작용에 의해 초래 됩니다. ^{31 , 32}. GABAergic parvalbumin (태양광 발전)에서 억제 계획-해 마^25,33, parahippocampal 지역에 entorhinal 외피²⁶ 수를 중간 심장 (MS)의 세포는 긍정적인 내측 측 두 엽에 세타 진동의 세대에 대 한 필수. 따라서, 네트워크 진동 및 신경 동기화의 생리 적 메커니즘 실시간 정밀 optogenetics를 사용 하 여 조작할 수 있습니다.

셀 형식 관련 optogenetic 조작 hippocampal 및 대뇌 피 질의 진동 체 외에서^{34,35,36,37,38} 의 연구에 대 한 적용 된 vivo에서^{30,39,40,41,,4243,44,45}, 기능 포함 감마^{5,12,36,,4647,48,49,50,} 의 조사 ^51,52 및 리플 진동^40,,5354 와 잠 스핀 들^55,56. 최근 우리 PV-Cre 쥐의 MS, hippocampal 세타 리듬의 세대에 대 한 주요 영역에서에서 Cre 종속 ChR2 바이러스 표현. 이 준비를 사용 하 여, hippocampal 세타 진동 (주파수와 시간적 안정성)의 기능 해 마¹¹에서 MS의 억제 계획의 optogenetic 자극에 의해 통제 되었다. 또한, 금지 중 hippocampal 예측의 세타 주파수 optogenetic 자극 깨어 부동 중 세타 리듬을 되 살려. optogenetically 최 LFP 및 신경 활동 수준에서 마우스에 자발적인 세타 진동의 세타 리듬 표시 속성.

이 프로토콜의 주요 기능 포함: hippocampal 흥분;에 난다 효과 피하는 동안 자발적인 세타 진동에 대 한 생리 적으로 중요 한 이다 억제 경로 (1) 활용 (2) axonal, 즉, 비 hippocampal MS efferents;에 직접적인 영향을 최소화 하기 위해 프로젝션 특정 자극 (3) 로컬 세타 리듬 빛 자극, 세타 리듬 중 hippocampal 역학와 세타 진동;의 글로벌 양자 유입 최소한의 직접 간섭을 보장 (4) 파라미터 제어 세타 진동 주파수 및 규칙; 그리고 (5) 부 량 유입 충실도 높은 시간 해상도 LFP를 사용 하 여 동물 행동에 양적 인과 분석. 때문에이 준비는 세타 세대^25,30중 hippocampal disinhibition의 잘 알려진 역할에 기본적으로 대문자로 표시, 강력한 제어할을 동작 쥐에 세타 진동의 여러 매개 변수를 수 있습니다. 연구 적은 조사 경로 세포 종류 중 hippocampal 회로의 다른 있던 조작^{38,,3947,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58} 공개 더 세타 리듬의 메커니즘.

PV-Cre 남성 쥐 노크에서⁵⁹, 10-25 주 이전, 사용 되었다. 쥐 동물 시설에서 표준 조건 하에서 지 내게 되었고 12 h 명암 주기에 보관. 모든 절차 국내 및 국제 지침에 따라 수행 하 고 지역 보건 당국 (Landesamt 위한 Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, 노르 트 베스트 팔 렌)에 의해 승인 했다.

1. 바이러스 주입

1. 전체 절차 동안 생물 안전 지침⁶⁰를 따르십시오. 실험실 외 투, 수술 용 마스크, 헤어, 그리고 장갑 두 켤레를 착용 합니다.
2. 약 1 m 길이 메 마른 메스와가 위 튜브를 잘라, 펌프, 주사기 홀더 블록에 삽입 하 고 그것을 해결.
   1. 주사기를 사용 하 여 완전히 실리콘 오일으로 튜브를 채우십시오.
   2. 튜브에 공기 방울 표시 여부를 확인 합니다. 공기 방울은 관찰 하는 경우 석유와 튜브 다시 리필.
   3. 미는 블록에 플런저를 수정 합니다.
   4. 플런저 팁 접촉 튜브 때까지 천천히 주사기 홀더 블록 쪽으로 미는 사전.
   5. 튜빙으로 플런저의 끝을 삽입 하 고 자동으로 주사기 홀더 블록에 도달할 때까지 명령 창 및 낮은 주입 속도 (예를 들어, 500 nL/min)에서 "고취"를 선택 하 여 느린 속도로 앞으로 미는 블록을 이동.
3. 주사 바늘 (34g)를 준비 합니다.
   1. 정밀 드릴/그 라인 더 절단 디스크에 연결을 사용 하 여 명확한 사용 바늘 허브를 제거 합니다. 필요한 경우, 갓 잘라 표면에서 금속 잔류물을 제거 하는 바늘을 사용 합니다.
   2. 바늘을 통해 모 세관 튜브 (3-4 cm 길이) 스레드.
   3. 슈퍼 접착제 튜브에 바늘을 붙입니다.
   4. Microsyringe 펌프에 연결 튜브의 끝에 주사 바늘을 연결 합니다.
4. Stereotaxic 홀더를 바늘을 연결 합니다.
5. 바늘 위에 투명 한 튜브에 공기 방울이 표시 될 때까지 공기를 철회 한다.
6. 1.5-3 %isoflurane 산소에서와 마우스 anesthetize 약 2-3 분 기다려 다음 마우스 완전히 발가락 핀치에 그것의 응답을 평가 하 여 마 취를 확인 합니다. 수술을 통해 동물의 호흡을 모니터링 하 고 필요한 경우 isoflurane 농도 조정 합니다.
7. 비 외상 성 귀 홀더를 사용 하 여 정위 적 프레임에 마우스를 놓습니다.
8. 지질 젤 마우스의 눈을 보호 합니다.
9. 0.01-1을 사용 하 여 머리 피부 아래 intradermally 0.1 mL lidocaine을 주입 mL 주사기와 26 G 주입 정.
10. 면도 하 고 에탄올 솔루션을 사용 하 여 마우스의 머리를 소독. 다음 세 번 2% 액체 수술 부위의 소독을 에탄올으로 대체.
11. 중간 절 개 bregma 및 람다 표시 되도록 눈의 레벨에는 귀 뒤에서가 고 날카로운가 위를 사용 하 여 수행 합니다.
12. NaCl 주사기를 사용 하 여의 약 50 µ L을 적용 하 여 두개골을 청소 하 고 건조 한 종이 티슈와에 어 퍼프.
13. 있도록 bregma 및 람다 같은 dorso 복 부 수준에 코 클램프의 dorso 복 부 레벨을 조정 하 여 마우스 머리 위치 (± 0.3 m m).
14. MS (AP 0.98와 L는 bregma에 관하여 0.5 m m) 위에 구멍을 드릴 합니다.
15. 이 시점에서, 실 온 (RT)에서 약 5 분에 대 한 바이러스 ( AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40의 적어도 2 µ L를 포함 한다)의 약 수 서 리 없애다.
16. 약 4000 x g RT에 1 분에 약 수 원심
17. 피펫은 Parafilm;의 조각에 바이러스의 2 µ L 이전 보호 측면을 사용 합니다.
18. 액체에서 주입 바늘의 팁을 잠수함 하 고 신중 하 게는 액체의 수준을 관찰 하는 동안 약 500 nL/min에 철회. 를 방지 하기 위해 공기 suctioning 바이러스가 완전히 채택 하기 전에 철수를 중지 합니다. 솔루션 점도;에 따라 철수 비율 조정 빠른 속도 높은 점도와 바이러스의 철수 용이 하 게 수 있습니다.
19. 종이 티슈로 바늘을 청소.
20. 바이러스는 튜브에 포함 된 바이러스와 오일 공기 방울이 구분 됩니다 확인 합니다. 바이러스는 주입 동안 성공적으로 주입 여부를 제어 하기 위해 튜브에서 바이러스의 수준을 표시 합니다.
21. craniotomy 위에 바늘을 천천히 첫 번째 주입 지점 (AP 0.98, L 0.5 V-5.2, 5.5 ° 측면)에서 뇌에 삽입.
22. 450 주사 100-150 nL/분 10 분에 대 한 대기의 비율로 바이러스의 nL 신중 하 게 0.1 m m까지 바늘을 이동 하 고 또 다른 5 분을 기다립니다.
    1. 두 번째 주입 포인트 (0.98, L 0.5 V-4.6 AP)에 바늘을 이동 하 고 또 다른 450 주사 nL 100-150 nL/분.
    2. 바늘 0.1 m m.까지 이동 하기 전에 다시 10 분 동안 대기 바늘을 제거 하기 전에 또 다른 5 분을 기다립니다.
23. 스퀘어 매듭을 사용 하 여 실크 블랙 꼰 봉합으로 봉합 절 개. 속도 복구를 빨간 램프와 동물을 따뜻한. 항생제 (Erycinum (1:4 살 균 NaCl) 0.3 mL)와 carprofen i.p. 수술 후 매일 2-3 일 관리.
24. 바이러스의 레벨을 표시 하는 마크 위에 튜브를 잘라. 추가 주사는 튜브를 사용할 수 있습니다. 각 주입 전에 신선한 주사 바늘을 준비 합니다.
    참고:이 수술은 약 1-1.5 h. 동물은 수술 후 5 분 이내에 일반적으로 일어난다. 최소 대기 시간이 충분 한 axonal 식 6 주 하지만 안 식 수준 감소 바이러스 주입 후 약 6 개월을 시작으로 정위 적 implantations를 수행 하기 전에 5 개월 이상.

2. 광학 섬유 (그림 1A)의 준비

1. 다중 모드 광섬유 광섬유 (105 µ m 코어, 실리 카 코어, 0.22 나 입은 유리)를 사용 합니다. 125 µ m 피복 섬유는 섬유 스풀에 여전히 연결 되어 동안 마이크로-스 트리 퍼를 사용 하 여 섬유 코어의 스트립.
2. 다이아몬드 칼을 사용 하 여 약 2-3 cm의 길이에 섬유를 잘라.
3. 지 르 코니 아 세라믹 스틱 아무에 섬유를 삽입 (ID: 126 µ m). 약 0.5-1 m m 광학 섬유는 아무의 볼록한 쪽에서 돌기 한다.
4. 바늘을 사용 하 여 에폭시 접착제 한 방울 양쪽 끝에 아무 하지만 하지는 아무의 측면에 적용 됩니다. 또는 슈퍼 접착제를 사용 하 여.
5. 적어도 30 분 동안 건조 접착제를 허용 합니다.
6. 다이아몬드 연마 필름 (3 µ m 밀가루) 섬유를 lapping를 사용 하 여 아무의 볼록한 쪽 폴란드어.
7. 광 파워 미터를 사용 하 여 빛 전송의 품질을 테스트 합니다.
   1. 사용 중인 레이저 같은 파장에 파워 미터에 파장을 설정 합니다.
   2. 센서의 중심에 직면 하는 팁과 패치 코드를 배치 합니다. 레이저 및 읽기 파워 미터에서 광 출력 전력. 값을 기록 합니다.
   3. 광학 섬유 짝짓기 슬리브를 통해 패치 코드를 연결 하 고 센서의 중심에 직면 하는 섬유의 끝에 위치. 레이저 및 읽기 파워 미터에서 광 출력 전력. 값을 기록 합니다.
   4. 전송 속도 계산: 첫 번째 값에서 두 번째 값을 나눕니다. 전송 속도 0.5이 하 있는 경우에, 섬유, 그렇지 않으면 주입을 위해 그것을 사용 하 여.
   5. 주입 하기 전에 각 섬유에 대 한 전송 속도 테스트 합니다.
   6. 나중에 실험에 대 한 광섬유 광섬유의 전송 속도를 레이저의 빛의 강도 출력 조정: 5-15 5-15 mW의 섬유 끝에서 마지막 빛 출력을 달성 하기 위해 전송 속도 나눈 패치 코드 끝에서 광 출력을 설정.
      참고: 또한 참고 ⁶¹ 광학 섬유의 준비에 대 한 참조.

3. 준비 텅스텐 와이어의 LFP에 대 한 배열 녹음 (그림 1B)

1. (예: 6) 여러 접착제 테이프의 끈 적 한 면을 병렬로 100 µ m 실리 카 튜브 가이드. 한 조각, 약 4-6 m m, 1 개의 철사 배열 어셈블리에 대 한 잘라.
2. 집게를 사용 하 여 가이드 튜브를 통해 45 µ m 텅스텐 철사 formvar 절연 스레드.
3. 스트립 6에 나 멜 절연 괜 찮 구리 (약 5 m m 긴) 전선과 접지 와이어 (약 2-3 cm 긴) 양쪽에 단 열을 멀리 긁어 메스를 사용 하 여 결합. Nanoconnector 핀에 그들을 솔더.
4. 각각은 전도성 페인트, 한 방울을 사용 하 여 한 텅스텐 와이어에 각 본딩 와이어를 연결 합니다. 적어도 30 분 동안 건조 하자.
5. 와이어 커버 시멘트의 최소 금액을 적용 합니다. 뇌 조직에서 나는 nanoconnector의 위쪽 부분에 삽입 됩니다 텅스텐 와이어에 시멘트를 적용 되지 않습니다. 하자 적어도 30 분 동안 건조 시멘트.
6. 신뢰할 수 있는 이식 세타 진폭의 추정을 위해 너무 낮은 ventrally 지층 pyramidale에 인접 한 영역 이상 전선 아래 있도록 무딘 스테인리스 스틸이 위를 사용 하 여 텅스텐 와이어의 각도 컷 (5-20 °)를 수행 합니다 유입 정밀도입니다.
7. 긁어 멀리 단 메스를 사용 하 여 접지 와이어의 끝 (약 2 mm) deinsulate. 플럭스와 presolder 그것을 취급 합니다.
8. 잠재적인 체크 크로스-회담 디지털을 사용 하 여 전극 사이 멀티 미터. 이렇게 하려면 연결 커넥터 핀 멀티 미터, 저항 측정 모드로 설정 해야 합니다. 체크 없음을 조합의 채널; 5 m ω 아래 멀티 미터에 독서를 중요 한 크로스 토크를 나타냅니다.
9. 임피던스 측정기를 사용 하 여 식 염 수에 각 와이어 전극의 임피던스를 확인 하십시오. 일반적인 임피던스 값 100 k ω 같습니다.
10. 주입을 촉진 하기 위하여 섬유의 끝은 짧은 와이어의 수준에서 고 섬유 팁 근접, 하지만 안 만질 텅스텐 와이어에는 와이어 배열 한 광학 섬유 접착제. 이식 시 조직 손상을 방지 하기 위해 가능한 섬유의 각도 유지.
    참고: 또한 참고 ⁶² 텅스텐 와이어 배열의 제작에 대 한 참조.

4. stereotaxic Implantations

1. 1.6 1.13 단계에서 설명한 대로 준비를 수행 합니다.
2. 결합 조직 두개골의 정상에서 제거 하 고 목 근육 약 2 m m에 의해 철저 하 게 기록 하는 동안 근육 아티팩트를 방지 하기 위해 밀어.
3. 목화-팁 주걱 및 염 분를 사용 하 여 두개골을 청소 하 고 뼈 스테인리스 나사 (00-96 x 1/16) 지상 및 임 플 란 트 (그림 1D)의 안정화를 (앞에 2)와 소 뇌, 0.8 m m 직경의 위 2 4 구멍을 드릴. 소 뇌 위 한 구리 와이어 (대략 2-3 cm 길이)에 연결 되어 접지 나사를 놓습니다.
4. 완전히 electrophysiological 녹음 동안 근육 아티팩트를 방지 하기 위해 시멘트로 지상 스크류 커버. 모든 나사 (그림 1E)를 연결 하는 시멘트 반지를 빌드하십시오.
5. (해 마, AP-1.94, L 1.4 V 1.4는 bregma 참조) 주입 측의 위 craniotomy를 수행 합니다. 뇌 조직의 표면에 살 균 NaCl의 약 5 µ L를 적용 합니다.
6. 천천히 낮은 craniotomy에서 stereotaxis를 사용 하 여 와이어 배열. 단일 기록에 대 한 와이어 배열⁶³; 대신 실리콘 프로브를 임 플 란 트 optoelectric 빛 아티팩트를 방지 하기 위하여 임 플 란 트 해 마에서 별도로 광케이블 직접 조사를 직면 하는 섬유 팁 (그림 1C -I). 반구 사이 유입의 조정의 조사, 대 한 이식 contralateral hippocampal CA1 지역에서 추가 광학 섬유.
7. 뇌 조직을 보호 하기 위해 이식 사이트 위에 주사기 70 ° C에 미리 데워 따뜻한 액체 왁 스/파라핀 오일의 약 5 µ L를 적용 합니다.
8. 시멘트 와이어 배열 주위를 적용 하 고 시멘트로 두개골을 커버.
9. Presoldered 접지/참조 와이어를 예를 들어, 바늘을 사용 하 여 접지 나사에 연결 된 presoldered 와이어 속의 한 방울을 적용 하 고 납땜 기계를 사용 하 여 전선 퓨즈.
10. 시멘트로 전체 접지 와이어 커버.
11. 0.3 mL Erycinum (1: 4에서 살 균 NaCl)을 관리 및 수술 후 그리고 carprofen (5 mg/mL) i.p. 적어도 다음 2 일. 마우스는 일반적으로 수술 후 15 분 이내 일어난다. 회복을 빠르게 하는 적색 등으로 동물을 따뜻한.
12. 첫 주에 수술에 대 한 또는 무게 안정 될 때까지 마우스의 무게를 매일 모니터링 합니다. 체중 감소 수술 전에 기록 된 마우스 무게의 10%를 넘지 말아야 한다. 무게의 안정화를 가속 수술 다음 첫 번째 일 동안 젖은 음식과 연유와 마우스를 제공 합니다.
13. 유입 중 hippocampal 세포 활동을 기록, 임 플 란 트 (AP-1.94, 1.4 L, V 1, 후속 낮추는) 해 마에 실리콘 프로브 참고 ⁶² 에 설명 된 대로 (그림 1C -I). AP-3, 1.4 L, 1.6 V, 39 ° rostral 꼬리에서 해 마에 광케이블을 이식. 셀 somata의 자극을 원하는 경우 MS (AP +0.98, L 1, V 3.9, 15 ° 측면)에서 추가 광학 섬유를 이식.

5. Optogenetic 자극 및 Electrophysiological 데이터 수집

1. 녹화 설정 (예를 들어, 15 분 세션, 3 일 동안 하루 1-2 세션)에 마우스를 길 들. 첫 번째 실험과 함께 시작 하기 전에 동물의 동작을 검사 합니다. 마우스 환경, 스니핑, rearings, 등, 수행을 탐험 챔버에 이동 하는 경우 첫 번째 실험 세션을 시작 합니다.
2. 같은 방에 있는 다른 동물의 부재에 익숙한 챔버에 마우스를 놓습니다.
3. 접착 테이프를 사용 하 여 동물의 위치를 추적 하기 위해 머리-단계에 LED를 연결 합니다. 동물 실험을 시작 하기 전에 기록 챔버 탐구 기간 내내 카메라 LED 빛 캡처는 다는 것을 확인 하십시오. LED 빛을 추적 하기 위해 어둠 속에서 기록 합니다. 녹음 실 위에 카메라를 배치 합니다.
4. 패치 코드에서 광 출력을 확인 하십시오. 이식 하는 섬유의 전송 속도 따라 연결 후 섬유 팁에서 광 출력을 추정 합니다. 섬유의 끝에서 광 출력 안정적인 유입 수 있도록 5 ~ 15 mW 사이 인지 확인 합니다.
5. 만성 이식 커넥터 headstage 프리 앰프를 연결 합니다. Optogenetic 자극 실험에 대 한 만성 이식된 hippocampal 섬유에 fiberoptic 패치 코드를 연결 합니다. 제어 빛 자극 실험, 헤드셋에 연결 된 더미 아무에 광학 섬유를 연결 됩니다.
6. 녹음 실에서 마우스를 놓습니다.
7. 자극 프로토콜 생성을 자극 발생기를 제어 하는 소프트웨어를 엽니다.
8. 473 nm DPSS 레이저 제어 채널을 선택 합니다. 첫 번째 행에서 입력 3000 mV (1 열), 속도 30 ms (2 열), 값 0 mV (3 열), ms 112 시간 (4 열), 반복 840, 행 및 반복 1, 2 분 30 ms 긴 펄스와 7 Hz의 프로토콜을 생성 하. 다른 주파수 또는 다른 기간에 자극은 필요한 경우 4 열과 행 반복 횟수에 지속 시간을 조정 합니다. 두 번째 행 선택 0 mW에서 (1 열), 500 h 시간 (2 열), 행 1 및 그룹 반복 자극 프로토콜 종료 후 레이저 떨어져 전환 되 고는 되도록 1 반복.
9. 클릭 "파일 > 다른 이름으로 저장" 원하는 이름으로 저장 합니다.
10. 자극 TTL electrophysiological 인수 동기화 디지털 Lynx 아날로그 입력된 보드에 연결 되어 레이저 트리거 출력 보장 및 optogenetic 데이터.
11. 또는, 패라메트릭하게 세타 발진 주파수의 변화를 조절, 기간 다음과 같은 가우스 분포와 간 펄스 간격, 다양 한 광 펄스의 열차를 적용 합니다. 예를 들어, 3.2 15.1 ms²단계에서 서로 다른 프로토콜에 대 한 간 펄스 간격의 분산을 수정 합니다. 세타 epochs 세타 주파수 (그림 6)의 다른 다양성을 생성 하는 이러한 프로토콜을 적용 합니다.
12. 기록 시스템의 소프트웨어를 엽니다. "취득" 취득 하 고 "REC" 기록 클릭 하십시오. 기본 동작 (예를 들어, 검색 기준 속도를 2 분 또는 30 분 기준 장소 필드를 추출 하)를 기록 하는 빛의 개시 전에 기다려.
13. 자극 발생기를 제어 하는 소프트웨어를 엽니다. "파일 > 열기"를 클릭 하 고 선택의 프로토콜 파일을 선택 합니다. "다운로드 시작" 빛 자극을 시작 하려면 클릭 합니다.
    참고: 실험 조사 될 수 있다, 그리고 원격 제어;를 통해 시작 하는 자극 이 동물의 행동에는 실험의 존재의 영향을 제외합니다. 연구의 목표에 따라 자극 시작 고 특정 동작 동안 종료 될 수 있습니다.

6. 결합 된 접근 Optogenetic 유입 및 Hippocampal 출력의 프로젝션 전용 금지

1. 섹션 1에서에서 설명한 대로 PV-Cre 쥐의 MS GABAergic 셀에 ChR2을 표현 한다.
2. 또한, CamKIIα 종속 halorhodopsin (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH)의 2.4 µ L의 총 두 등 hippocampal 반구 (AP-1.7;에 주입 L ± 1.05; V-2.05 및-1.4 m m; AP-1.7; L ± 1.7; V-2.05 및-1.55 m m; AP-2.3; L ± 1.5; V-2.2 및-1.3 m m; AP-2.3; L ± 2.2; V-1.65 및-2.45 m m).
3. 식 시간 6 주가 소요 됩니다.
4. 섹션 4에서에서 설명한 대로 hippocampal CA1 지구에 광학 섬유와 텅스텐 와이어 배열을 이식. 또한, 양자 광학 섬유 측면 심장에 이식 (LS, AP 0.1, 0.25 L, V-2.25 m m, 그리고 AP V L-0.3, 0.5-2.7 m m).
5. Optogenetic 세타 entrainment 실험 단계 5.4 5.5에에서 설명 된 대로 수행 합니다.
   1. ls hippocampal 출력의 동시 억제에 대 한 프로토콜 자극 생성 생성: 예를 들어, 트리거 출력 채널의 발병에 연결 된 593 nm DPSS 레이저 15 s 총 45에서 지속적인 연속 펄스를 실행 하기 전에 s 473 nm DPSS 레이저에 펄스 출력.
   2. 모두 섬유 패치 코드 593 nm DPSS 레이저에 다중 모드 광섬유 광섬유 커플러를 사용 하 여 통해 LS에 연결 합니다.
   3. 녹음을 시작 하 고 다운로드 하 고 자극 생성을 제어 하는 프로토콜 트리거.

7입니다. 데이터 처리

1. Electrophysiological 신호를 변환 하 고 신경 생리학 데이터 (ND) 관리자.dat 및.pos 형식, 각각⁶⁴와 추적 데이터를 배치 합니다.
2. 저역 통과 필터링 및 1250 hz ND 관리자⁶⁶를 사용 하 여 광대역 신호 다운 샘플링은 LFP를 얻을.
3. 각 기록에 세타 진동 (Neuroscope 사용)¹⁹의 최대 진폭으로 채널을 선택 합니다.
4. 알고리즘을 감지 임계값으로 레이저 펄스의와 자극 신기의 타임 스탬프를 검색 (MATLAB 함수 findpeaks.m를 사용 하 여 또는 이와 유사한)¹¹.
5. 멀티 채널 데이터 분석 소프트웨어에서.dat 파일을 가져오려면, 파일 > 가져오기 "" 클릭 하 고 데이터 형식으로 "이진 파일"을 선택.dat 파일을 선택 합니다. 구성 대화 상자에서 채널의 정확한 수 및 1, 250 Hz의 샘플링 속도 입력 하 고 "확인"을 클릭.smr 파일로 저장. "분석 > 새 결과 보기 > PowerSpectrum"를 선택 하 여 전력 스펙트럼을 플롯 합니다. 설정에서 가장 높은 세타 진폭 및 16, 384 FFT 크기와 채널을 선택, "새로 만들기"를 클릭, 자극 epoch의 시작과 "끝 시간"로 "시작 시간"으로 정의 자극 신 기원, 클릭 "프로세스"의 끝.
6. Optogenetic 자극 주파수 범위 내에서 유입 충실도 누적 전력 스펙트럼 밀도 (PSD)의 비로 계산 (자극 주파수 ± 0.5 Hz), 세타 (5-12 Hz) 밴드 multitaper 방법에서 누적 PSD에 (NW = 3, 창 크기 8,192) 10 s 신 기원에 대 한 (예를 들어, 툴킷 < http://chronux.org/>).
7. 녹음 epochs 지배적인 PSD 피크가 ≤ 제외 분석 (비 세타 신기, MATLAB 함수 find.m를 사용 하 여)에서 5 Hz.
8. LFP 전력 스펙트럼의 래스터 (MATLAB 함수 sortrows.m 및 pcolor.m을 사용 하 여) 계산된 유입 충실도 따라 모든 기록 된 신 기원에 대 한 플롯. 로드 파워 스펙트럼 및 유입 충실도 "파일 > 열기"를 클릭 하 여 저장 변수 인치 형 전원 = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:end))입니다.

섹션 1에서에서 설명한 대로 MS GABAergic 셀으로 ChR2의 타겟팅은 그림 2A에 나와 있습니다. Optogenetic 자극 등 해 마 CA1 영역 위에 이식 하는 광학 섬유를 통해 MS GABAergic 세포의 축 삭의이 세타 동측 (그림 2B)에 자극의 주파수에서 진동 contralateral 뿐만 아니라 반구 (그림 2C)입니다. 세타 진동의 효능 상대 세타 자극 주파수, 즉, 주위 LFP 전력으로 각 녹음 시대에 대 한 계산 된 optogenetic 자극 (그림 3A)에 의해 더 효율적으로 개입 될 수 있습니다. 유입 정밀도 (그림 3B)입니다. 0.3, 즉, 자연 스러운 빛을 녹음, 보다 높은 위에 유입 충실도 녹음 신기의 약 80%에서 관찰 되었다. Optostimulation 비 세타 주파수에서 더 적은 이었다 효과 (그림 3C).

명시적 즉, 세타 진동 주파수 세타 규칙의 긴급 변경에 의해 동반의 파라미터 조작: 세타 진동의 주파수와 진폭의 일시적인 규칙 높은 신 기원 동안에 증가 했다 유입 정밀도입니다. 진동의 안정성의 기간에 따라 다른 분산 (그림 4) 가우스 분포 하는 광 펄스의 열차를 적용 하 여 패라메트릭으로 또한 통제 수 있다.

Optogenetic 제어 진동 주파수 세타 주파수와 운동 (그림 5A) 동안 afferents를 오름차순으로 MS 통해 주파수 제어와 실행 속도 사이의 상관 관계를 제거. Optostimulation는 또한 부동 (그림 5B) 동안 세타 진동 유발. 우선 발사 단계 지역의 기록에 CA1 피라미드 세포 상 상속에서 그리고 수 optogenetically 최 세타 발진 자발적인 세타 (그림 6)에 비해 상대적으로 변경 되지 않았습니다.

운동의 세타-중재 규칙에 측면 심장 통로에 해 마의 기여를 공부 우리 optogenetically이이 경로 저해. ChR2 이상으로 MS GABAergic 셀에 표현 했다 고 세타 진동 했다 optogenetically 최 (그림 7B) Halorhodopsin (eNpHR3.0) 양측 hippocampal 피라미드 세포 (그림 7A)에 표현 했다. 세타 유입 감소 속도 하지 마 LS 통로를 저해 했다 실행의 가변성 (그림 ℃).

그림 1: 광학 섬유, 전극 및 수술의 그림. (A) 광학 섬유의 그림. (B) 그림 hippocampal 세타 진동의 유입 동안 hippocampal LFP의 기록에 대 한 광학 섬유에 붙어 선 배열. (C) hippocampal 세포 활동의 기록, 실리콘 프로브는 마이크로 드라이브에 마운트되어. (D) 미니어처 나사는 두개골에 위치. 구리 철사는 소 뇌 위에 위치 하기 전에 지상 및 참조 나사를 presoldered. (E) 시멘트 커버와 나사를 연결에 적용 됩니다. 위 파란색 동그라미는 craniotomy 실리콘 프로브의 이식에 대 한 수행 했다 나타냅니다. 낮은 파란색 동그라미는 craniotomy 해 마에서 광케이블의 이식에 대 한 수행 했다 나타냅니다. (F) 한 광케이블 hippocampal CA1 지역 대상 rostral 꼬리 각도에 이식 합니다. 두 번째 섬유 셀 somata의 자극 (선택 사항) 원하는 경우 중간 심장에 이식 될 수 있습니다. (G)는 실리콘 프로브 hippocampal CA1 영역 위에 그냥 낮 췄 다. (H) 마이크로 드라이브 커넥터의 테두리는 임 플 란 트 및 접지, 확고 하 고 참조 전선을 납땜. (나) 구리 메쉬는 이식 하는 패러데이 케이지 역할을 건설 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: optogenetic hippocampal 세타 유입에 대 한 준비. (A) ChR2+ 중간 septal 전지의 태양광 Cre 마우스 (위 제도)에 표현 했다. MS (1, 2)에서 밝은 형광 somata에 성공적인 구조 식을 확인합니다. MS 섬유 fornix (f) 및 fimbria (fi) 해 마 (3-6);를 통해 프로젝트 aca: 전방 commissure; 앞쪽 부분입니다. 대각선 악대; 가로 사지의 HDB: 핵 또는: 지층 oriens. Optogenetic 블루 빛 자극에 대 한 광학 섬유 hippocampal 영역의 CA1 피라미드 계층 (낮은 구조) 위에 이식 합니다. 바 규모: 500 µ m (이미지 1, 3, 4) 및 50 µ m (이미지 2, 5, 6). (B) 자발적인 세타 진동 (왼쪽)와 7 Hz (가운데) 또는 10 Hz (오른쪽) optogenetic entrainment 동안 Hippocampal LFP. 블루 줄무늬 빛 응용 프로그램의 시간 창을 나타냅니다. 참고 화살표에 의해 표시 된 광 펄스에 의해 다시 설정 하는 단계. 참고 동안 자연과 개입 세타, 생리 세타 리듬의 지표로 감마 봉투. 지층 oriens 사이 반전 단계 (str. 또는.) 지층 radiatum (rad. str.) 또한 entrainment 동안 유지 됩니다. (C) 유입은 contralateral (낮은 플롯)로 서 동측 (위 작) 하는 동안 신뢰할 수 있는 optogenetic 자극. 제도 전극 위치에 섬유의 위치를 보여 줍니다. 세타와 광 펄스의 응용 프로그램 중 예 LFP 추적 중간에 표시 됩니다. 오른쪽에 동안 ipsi-contralateral 자극 자극 주파수에 따라 색상으로 구분 hippocampal LFP의 스펙트럼을 전원. 이 그림은 참고 11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: optogenetic hippocampal 세타 유입의 충실도. (A) 예 hippocampal LFP 낮고 높은 유입 충실도 동안 자취. (B) 행 (왼쪽), 세타 주파수 선도 따라 정렬 된 자발적인 세타, 그리고 7 Hz (가운데)와 유입 충실도 따라 정렬 행 10 Hz (오른쪽) optogenetic 자극 10 s 신기의 스펙트럼 밀도 전원. 각 예제에서는 파워 스펙트럼 (화살표로 표시) 위에 그려집니다. 신 기원에 걸쳐 안정적인 유입 충실도 note. 오른쪽에 세타 주파수에 대 한 유입 사실성의 누적 확률 표시 됩니다. (C) 유입 세타 리듬 자극을 필요합니다. Hippocampal 네트워크 활동은 6-12 Hz 사이 주파수를 사용 하 여 성공적으로 개입 수 있습니다. 낮은 주파수에서 (예를 들어, 2 또는 4 Hz) 또는 더 높은 주파수 (예, 20 Hz) 유입은 신뢰할 수 있는. 이 그림은 참고 11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 세타 진동 규칙의 매개 변수 조작. (A) 자극 7.8 Hz 다음과 같은 가우스 분포의 평균 주파수와 세타 범위 내에서 다양 한 주파수에 적용 되었다. 간 펄스 간격의 표준 편차 σ에서 프로토콜을 통해 증가 되었다 = σ를 3.19 15.09 =. 총에서 11 프로토콜 생성 하 고 각각 1 분의 자극 epoch의 총 기간 적용 했다. 이들의 5 프로토콜의 확률 분포는 그림의 왼쪽에 표시 됩니다. 각 프로토콜의 응용 프로그램 동안 hippocampal LFP의 1-14 Hz의 범위 내에서 전력 스펙트럼 밀도 그림 가운데에 그려집니다. 각 프로토콜의 응용 프로그램 동안 세타 기간의 확률 오른쪽에 그림은. (B)는 적용의 분산 간 펄스 간격 결정 동시 세타 기간의 분산 (피어슨의 r = 0.94, p = 0.0002). (C) 세타 진폭 변화와 간 펄스 사이의 관계 간격 (피어슨의 r = 0.61, p = 0.08). 이 그림은 참고 70에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: Optogenetic 세타 리듬 유입 동작 동안 hippocampal LFP를 결정 합니다. (A) Optogenetic 자극 주파수 세타 주파수 운동 동안에 결정. 따라서, 속도 관련 afferents hippocampal 세타 주파수 영향을 주지 않습니다 그리고 결과적으로, 속도 상관 하지 세타 주파수 (파란색)으로 자발적인 세타 (블랙) 동안. 조용히 깨어 동안 ± s.e.m. (B)를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다, 그리고 hippocampal 세타 운동의 부재에 elicited 될 수 있습니다. Hippocampal LFP 트레이스 전과 성공적인 진입 중, 위에 표시 됩니다 및 예 속도 추적 entrainment 동안 기록 다음과 같습니다 (빨간 추적 hippocampal LFP 추적 위의 묘사에 해당). 블루 줄무늬 빛 자극 펄스의 시간 창을 표시합니다. 이 그림은 참고 11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6: 세타 entrainment 동안 Hippocampal 세포 활동. (A) 세포 활동 실리콘 프로브 (스키마)를 사용 하 여 기록 했다. 단일 수와 피라미드 세포는 고립 된 그들의 각각 파형에 따라 식별. 여기에 표시 된 평균 파형 (중간) 및 자동-correlogram의 예를 들어 격리 된 피라미드 셀입니다. (B) 피라미드 세포 (Pyr)의 기본 출력 단계는 자발적인 동안 다른 (검정, n에서 = 29 신경) 및 optogenetically 최 (블루, n에서 = 30) 세타 (p = 0.79). (C) 표시 여기는 자동-correlogram (왼쪽)와 자연 스러운 동안 빠른 발사 interneuron의 우선 발사 단계 optogenetically 최 세타와. 자연 (왼쪽) 및 개입된 (오른쪽) 세타 hippocampal LFP 리듬 해당 아래 (D) 빠른 발사 수의 선호 방전 단계 동안 다른 아니었다 (블랙)에서 자연 및 optogenetically 최 (블루, n에서 = 28 신경) 세타 (p = 0.97). 평균 자동-correlogram는 왼쪽에 표시 됩니다. (E) 평균 자동-correlogram str. oriens 셀. (F) str. oriens 수의 선호 방전 단계 아니었다 다른 자발적인 (블랙)과 optogenetically 개입 (파란색, n = 10 신경) 세타 (p = 0.56). 선호 방전 단계 막대 그래프 오른쪽에 표시 됩니다. (G) 평균 발사 속도 세타 유입 피라미드 세포에 의해 영향을 받지 했다 (p = 0.98), 빠른 발사 수 (p = 0.96) 또는 str. oriens 수 (p = 0.85). 이 그림은 참고 11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 7: hippocampal 세타 유입 및 optogenetic의 억제는 hippocampal 바꾸어 LS를 통해 출력의 조합. (A) eNpHR3.0 (halorhodopsin) hippocampal 피라미드 세포 (위 제도)에 표현 했다. 구성의 성공적인 식 밝은 형광 somata 말머리 (위 이미지)과 LS (아래 이미지)에서 축 삭에 의해 확인 되었다. 광학 섬유는 LS (낮은 구조) 위에 양측 이식 했다. 바 규모: 500 µ m (왼쪽 이미지), 50 µ m (오른쪽 이미지). (B) Hippocampal 세타는 LS 통로에 해 마의 억제 동안 성공적으로 개입 된다. 여기 표시 된 출력 억제 중 9 Hz 블루 빛 자극에 대 한 전력 스펙트럼 밀도 있습니다. 주요 hippocampal 바꾸어 출력 통로의 (C) 저해 hippocampal 세타 유입 속도에 영향을 방지합니다. 여기는 optogenetic 유입 (흰색 바 파란색 테두리)와 함께 시 속도 변화에 감소는 결 석 LS 통로 (파란색 테두리와 노란색 바)에 해 마의 동시 억제 시. 각각 평균 초기 속도 왼쪽에 표시 됩니다. 이 그림은 참고 11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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