방법 논문

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

DOI:

10.3791/57354

⸱

2018년 7월 1일

 ,  , 
1College of Life Sciences, South China Agricultural University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

공동 기존 방법의 어려움을 극복 하기 위해 공장에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하기 위한 새로운 방법을 개발 했습니다. 그것은 단백질 공동 식 달성 하기 위해 카세트를 표현 하는 여러 기능적으로 독립적인 단백질을 포함 하는 단일 식 플라스 미드를 사용 하 여 활용 합니다.

초록

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단백질의 subcellular spatiotemporal localization(s)에 대 한 정보는 세포에서의 생리 기능을 이해 하는 중요 한. 형광 단백질 및 형광 성 융해 단백질의 생성 격렬 하 게 사용 되었습니다 효과적인 도구로 직접 단백질 지 방화 및 셀에서 역학을 시각화. 특히 관심의 단백질와 공동 식 후 잘 알려진 세포 기관이 마커를 비교 유용 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 단백질 공동 식 식물에 대 한 고전적인 접근 일반적으로 여러 개의 독립 식 플라스 미드를 포함 하 고 따라서 낮은 공동 식 효율, 식 수준 변화, 그리고 높은 시간을 포함 하는 단점을가지고 유전자 교차 및 심사 비용입니다. 이 연구에서 우리는 식물에 여러 공상 형광 단백질의 공동 식에 대 한 강력 하 고 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 여러 개의 반 독립적인 표현 카세트의 구성 된 단일 식 벡터를 사용 하 여 기존 방법의 한계를 극복 했다. 각 단백질 식 카세트 자체 기능 단백질 식 요소를 포함 하 고 따라서 그것은 유연 하 게 다양 한 식 수요에 맞게 조정할 수 있다. 또한, 그것은 간단 하 고 편리 하 게 수행 하는 어셈블리 및 조작 DNA의 추가 소화 및 결 찰 단계 없이 최적화 된 원스텝 반응을 사용 하 여 식 플라스 미드에 조각. 또한, 현재 파생 된 형광 단백질 바이오 이미징 기술 및 응용 프로그램, 무서 워, BiFC 등 완벽 하 게 호환 됩니다. 방법의 유효성 검사,으로 우리 붙일 융합 공동 급행 vacuolar 정렬 수용 체와 분 비 캐리어 막 단백질이 새로운 시스템을 채택. 결과 그들의 관점의 subcellular 지 방화는 과도 식과 유전자 변형 식물에 의해 이전 연구에서와 같이 보여.

서론

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공상 형광 성 융해 단백질 세포 역학 및 subcellular 지 방화를 연구 하 고 그들의 생리 적 기능 및 작동 메커니즘1,2, 양지 유용한 도구로 간주 되고있다 3 , 4. 공동 익스프레스 spatiotemporal 근거, 분포, 그리고 셀4 endomembrane 시스템 내에서 복수 위해 문제의 단백질으로 잘 알려진 세포 기관이 기자 단백질에 특히 유리 하다 , 5 , 6 , 7 , 8.

공상 형광 성 융해 단백질은 과도 식 통해 식물 및 안정적인 유전자 변환, 그들의 각각 장점과 제한9,,1011에 표현할 수 있습니다. 단백질의 과도 식 biolistic 폭격-, 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함 하는 편리한 접근 이다-, 또는 protoplasts 및 AgrobacteriumDNA 과도 식 electroporation 중재-중재 하는 잎에 침투 그대로 식물 세포, 그림 1A, B12,13,14,,1516와 같이. 그러나, 단일 식물 세포에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식 여러 독립 식 플라스 미드의 혼합물을 요구 한다. 따라서, 여러 개의 플라스 미드 단백질 공동 식 식물에 대 한 고용의 단점은 동시에 동일한 셀 단일 플라스 미드에 비해 입력 몇 plasmids의 극적으로 감소 된 우연 저수준 공동 식 그리고 각 유형의 셀17,18에 전송 되는 플라스 미드의 미친 듯이 임의의 금액으로 인 한 단백질 식 레벨의 변형입니다. 또한, 그것은 기술적으로 단일 Agrobacterium 단백질 공동 식9,,1011에 대 한 여러 독립 식 플라스 미드를 도전. 따라서, Agrobacterium-담배의 침투에 의해 과도 식 나뭇잎 중재 단백질은 그림 1B와 같이 한 번에 한 플라스 미드를 표현. 반면, 형광 성 융해 단백질을 표현 하는 유전자 변형 식물의 세대 보통 Agrobacterium 이진 변환 벡터를 전달 함으로써 이루어집니다. 그러나, 유전자 이동 및 식물 게놈으로 삽입 중재 이진 벡터는 단일 형광 성 융해 단백질 (그림 1B)9,,1012표현만 합니다. 여러 공상 형광 단백질을 동시에 표현 하는 유전자 변형 식물 생성 여러 라운드를 유전 교차점 및 심사, 공동 표현 될 유전자의 숫자에 따라 년 개월에서 걸릴 수 있습니다 필요 합니다.

식물에 있는 여러 단백질의 공동 식에 대 한 단일 식 벡터 이전으로 보고 되었습니다 고용 연구19,,2021. 그러나, 효소 소화의 여러 라운드 및 DNA 분자 및 백본 벡터 DNA 결 찰 일반적으로에 단백질 공동 식 또는 오버 식에 대 한 최종 플라스 미드의 생성. 여기, 우리는 공동 식물에 여러 공상 형광 단백질을 표현 하는 새롭고 강력한 방법을 개발 했습니다. 모두 과도 식에 대 한 식물에 여러 단백질 공동 식와 영광 패션에 안정적인 변화는 매우 효율적이 고 편리한 방법 이다. 그것은 단백질 공동 식에 대 한 여러 기능적으로 독립적인 단백질 식 카세트를 포함 함으로써 기존 방법의 단점을 극복 하는 하나의 벡터를 사용 합니다. 또한, 그것은 매우 다양 한 시스템은 dna에서 조작 및 어셈블리 DNA 소화 및 결 찰의 추가 단계 없이 최적화 된 간단한 원스텝 반응에 의해 달성 된다. 작동 원리는 그림 2에 나와 있습니다. 또한, 그것은 공상 형광 성 융해 단백질을 기반으로 하는 현재 세포, 분자, 및 생 화 확 적인 접근을 완벽 하 게 호환입니다.

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프로토콜

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1. 뇌관 디자인 전략 및 DNA 증폭

  1. DNA 파편의 분자 클로닝을 위한 뇌관 디자인. 뇌관 20 bp 유전자 특정 바인딩 시퀀스 및 인접 한 DNA 분자의 상호 보완적인 겹치는 순서 (예를 들어 표 1 참조)는 20 ~ 25 bp 5'-끝 오버행 시퀀스 구성.
    참고: 각 DNA의 후속 어셈블리 조각, 다른 단백질 식 카세트의 결합 그리고 인접 한 중첩 시퀀스의 인식에 따라 모든 최종 식 벡터와의 통합.
  2. DNA 파편, 발기인, 형광 기자, 대상 유전자와 터미네이터를 포함 하 여 그들의 해당 뇌관으로 표준 PCR 반응에 의해 반 독립적인 단백질 식 카세트의 건설에 필요한 고 높은 증폭 피델 리 티 중 합 효소입니다.
    참고: DNA 증폭에 대 한이 연구에 사용 된 서식 파일은 이전 연구15,,2223에서 파생 됩니다. 어 닐 링 온도 확장 시간 PCR 반응의 뇌관과 유전자 종속 있습니다.

2. DNA 조각 어셈블리 및 단백질 식 카세트의 건설

  1. DNA 전기 이동 법에 의해 1 라운드 PCR 제품의 품질을 검토 하 고 분 광 광도 계에 의해 계량. 1 %agarose 젤 전기 이동 법에 의해 DNA 저하 및 오염 발생 한 여부를 확인 합니다. PCR 제품의 OD260/OD280 1.6과 1.8 사이 이어야 한다.
  2. 다른 DNA 파편을 혼합 (0.05-0.1 pmol 각 단편에 대 한) 5 µ L의 최종 볼륨을 새로운 PCR 튜브에.
    참고: 혼합 DNA 분자를 위한 동일한 단백질 식 카세트 함께 한 PCR 튜브에. 그것은 연결 하는 데 필요한 DNA 분자의 증가 수 때문에 DNA 어셈블리의 효율성을 줄일 수 있기 때문에, 함께, 다른 식 카세트에서 DNAs를 혼합 하지 마십시오.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
  3. 5 x ISO 재고 버퍼 준비: 500 mM Tris HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 1 m m deoxynucleotide (dNTP); 50mm dithiothreitol; 25% 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 8000; 그리고 5mm 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD).
  4. ISO 재고 버퍼, T5 exonuclease, 고 충실도 DNA 중 합 효소의 62.5 단위, Taq 중 합 효소의 5000 단위 단위의 7.5 x 1 mL 마스터 혼합물 400 µ L 5에서에서 x 2를 만들기 ( 재료의 표참조), 및 소독된 이중 증 류 H2o.
    참고: 이것은 이전 연구24,25,의26;에서 적응 이러한 볼륨은 최적화 되어야 합니다.
  5. 튜브 및-20 ° c.에 게 마스터 혼합물 x 2의 aliquot 100 µ L
    주의: 빈번한 중지 및 재개 2 x 마스터 혼합물의 낮은 DNA 어셈블리 효율을 발생할 수 있습니다.
  6. 2 x 마스터 혼합물의 15 µ L 5 µ L DNA 혼합물에 추가 하 고 60 분 동안 50 ° C에서 품 어.

3. 식물에 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 표현 위한 벡터의 건설

  1. 전체 반 독립적인 단백질 식 카세트는 제품을 사용 하 여 2 차 PCR에 의해 증폭 (0.5-1.0 µ L) 템플릿과 바깥쪽 뇌관 (예를 들어, 1 FP35S 및 식에 대 한 1-RNOS로 1 라운드 등온선 어셈블리 반응에서 카세트 1)입니다.
    1. 50 µ L 반응 볼륨에서 고 충실도 중 합 효소의 사용 1 단위 다음 30 사이클 (94 ° C 30에 대 한 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 및 2 분 동안 68 ° C), 뒤에 5 분 동안 68 ° C에서 최종 확장.
  2. 최종 단백질 식 백본 벡터 pUC18 및 pCAMBIA1300, 4 단위 Sma 를 추가 하 여 단백질 과도 식 및 유전자 변환, 각각, 디자인 되는 선형화 최종 10 µ L 반응 볼륨으로 나 고 1-잠복기 25 ° c.에서 2 시간 20 분 동안 65 ° C에서 배양 하 여 제한 효소 비활성화.
  3. 5 µ L의 최종 반응 볼륨에 단백질 식 카세트 및 선형화 마지막 벡터의 아데닌 DNA 분자를 혼합. 그런 다음 마스터 버퍼와 60 분 50 ° C에서 배양 x 15 µ L 2와 혼합 하 여 2 차 DNA 재결합을 수행 합니다.
  4. 2 차 등온 재결합 반응의 최종 제품을 사용 하 여 유능한 대장균 을 변형 표준 절차27에 따르면 셀 (예: DH5α). 식민지 PCR와 DNA 시퀀싱에 의해 긍정적인 식민지를 다시 확인 합니다. 미니 플라스 미드 추출 키트를 사용 하 여 대장균 에서 긍정적인 플라스 미드를 추출 하 고-80 ° c.에 저장
    주의: 장기 저장을 위한 테 버퍼에 녹아 있는 플라스 미드 또는 두 배 증류수 H2O 대장균 변종에서 그들을 유지 하는 것 보다 더 안정.

4. Biolistic-사격 중재 식물에 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 과도 공동 식

  1. 사격에 대 한 담배 BY-2 현 탁 액 셀과 애기 청소년 식물을 준비 합니다.
    1. 두 번 주당 130 rpm에서 설정 하는 통에 25 ° C에서 subculturing에 의해 Skoog (MS)와 村 重 매체에서 문화 BY-2 셀. 70 밀리미터 압력가 필터 종이 통해 진공 펌프는의 조각에 경작 수집 30 mL 3 d BY-2 셀 40 mbar 진공 압력을 설정 하 여 필터링 합니다.
    2. 다음 단계를 수행 하는 동안 밖으로 건조에서 세포를 방지 하기 위하여 여러 방울 추가 BY 2 셀 액체 문화 매체의 페 트리 접시에 필터 종이 배치 하기 전에 (다음 단계).
    3. 그것에 새로운 배양 접시 (85 m m x 15 m m) BY-2 셀으로 필터 종이 전송.
    4. 표면 70% (v/v) 에탄올 0.05% 포함 된 vortexing는 혼합물에 의해 애기 thaliana (열 0) 씨앗을 소독 10 분 트윈 20.
    5. 벤치 가기 원심 분리기를 사용 하 여 2를 최대 속도로 씨앗 아래로 회전 s는 상쾌한을 제거 하 고 100% 에탄올과 씨앗 30 미 피 펫 멸 균 후드에 새로운 살 균 필터 종이에 씨앗 밖으로 한 번 세척. 그런 다음, 씨앗을 건조 하 고 ½ MS 한 접시에 그들을 확산.
    6. 다음 설정 사용 하 여 식물 성장 챔버로 그들을 전송 하기 전에 48 시간 동안 4 ° C에서 접시를 저장: 16 h 120-150 µ m m-2 s-1 강도, 22 ° C. 8 h 어두운 빛
    7. 폭격의 효율성을 증가 하는 새로운 ½ MS 중간 접시의 중앙에 30mm 직경 원형으로 7-하루 오래 된 샘플 식물을 전송 합니다.
      주의: 중복 식물 전송 하 고 새로운 ½ MS 접시에 그들을 배치 하지 마십시오.
    8. 식물의 수 분을 유지 하 고 다음 단계를 수행 하는 동안 밖으로 식물 건조 방지를 조직 표면에 ½ MS 액체 매체의 몇 방울을 추가 합니다.
  2. 플라스 미드 DNA와 금 입자 코트.
    1. 와 동 골드 microcarrier 솔루션, 철저 하 게 3 분에 대 한 새로운 1.5 mL 튜브 준비.
    2. 튜브와 소용돌이에 다음과 같은 솔루션을 순차적으로 추가: 25 µ L (1.5 m g) 골드 입자, 소용돌이 10 s; 25.46 mg/L spermidine, 소용돌이 10 s;의 10 µ L 5 1µg / µ L 플라스 미드 DNA의 µ L, 소용돌이 3 분; 25 277.5 mg/L CaCl2 솔루션의 µ L, 소용돌이 1 분.
      주의:이 단계 동안 vortexing를 유지.
    3. 펠 릿을 방해 하지 않고 5 s와 신중 하 게는 상쾌한 밖으로 피 펫에 대 한 최대 속도 벤치 가기 원심 분리기를 사용 하는 골드 microcarriers 아래로 회전 합니다. 절대 에타 놀의 200 µ L로 세척 하 고 다시 일시 중단 소용돌이 의해 펠 릿 5-10 s. 스핀 다운 5 s와 제거는 에탄올에 대 한 최대 속도.
    4. 절대 에타 놀 및 aliquot 6 µ L 입자 현 탁 액 3 macrocarriers의 중간에 18 µ L에 다시 금 입자를 일시 중단 합니다. 그들이 건조 한 공기 보자.
  3. 입자 사격을 통해 식물으로 DNA를 전송.
    1. 다음으로 입자 배달 시스템 설정: 1100 psi, 28 mm Hg 진공, 1 cm 간격 거리 및 9 cm 입자 비행 거리.
    2. 세 가지 다른 위치에서 세 번에 대 한 한 중간 접시에 셀/식물을도 배 하 고 사격 직후 어둠의 셀/식물을 유지.
      주의: 시스템에 고압 가스 및 고속 입자의 협회 때문에 입자 배달 시스템을 작동할 때 안전 안경 착용.
  4. 형광 신호 관찰 6 ~ 72 시간에 대 한 식물 성장 챔버에 어둠 속에서 포 격하 셀/식물을 유지. 24 h 어두운와 22 ° C에 식물 성장 챔버를 설정
    주의: 식 효율과 형광 신호 강도 발기인, 유전자 및 식물/조직-의존 합니다.

5. 공동 Agrobacterium에의해 여러 공상 형광 단백질을 표현 하는 안정적인 유전자 변형 애기의 생성-변화를 중재.

  1. Thaw Agrobacterium 유능한 세포 (PMP90) 얼음에 30 분 동안 대기 후 2 µ L 이진 벡터 (100-200 ng) (준비 위) 유능한 세포에 추가. 10 분 동안 얼음에 혼합물을 앉아.
  2. 미리 냉장된 0.1 cm electroporation 베트로 혼합물을 전송 합니다. 멧 electroporation 시스템에 삽입 하 고 다음 설정으로 electroporation 수행: 1.6 k v, 600 옴, 25 µ F.
  3. electroporation 직후는 베트에 SOC 액체 매체의 1 mL을 추가 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에 세포를 플라스틱 120 분 200 rpm에서 수평 궤도 통에 28 ° C에서 품 어.
  4. 5 분 동안 실 온에서 2,348 x g에서 세포를 원심, 삭제는 상쾌한의 대부분, 부드럽게 다시 피 펫 팁 일지도 셀을 일시 중단, 50 mg/L Hygromycin B를 포함 하는 파운드 접시에 그들을 확산 그리고 28 ° C에서 2-3 일 동안 품 어.
  5. 애기 thaliana Col 0 식물에서 Agrobacterium, 이전에 설명한 대로 꽃 딥28 메서드에서 여러 단백질 식 카세트와 통합 이진 벡터 pCAMBIA1300 포함 된 변환 안정적인 유전자 변형 식물을 생성 합니다.
  6. 0.05%를 포함 하는 70% (v/v) 에탄올과 혼합 하 여 유전자 변형 애기 씨앗의 표면 소독 트윈 20. 벤치 가기 원심 분리기를 사용 하 여 2를 최대 속도로 씨앗 아래로 10 분 회전을 위해 소용돌이 s, 상쾌한, 제거 하 고 씻어 30 한 번 100% 에탄올과 씨앗 s.
  7. 살 균 후드에서 무 균 필터 종이에 씨앗 밖으로 플라스틱. 그 후, 건조 한 공기 하 고 긍정적인 progenies 심사 Hygromycin B를 포함 하는 ½ MS 한 접시에 그들을 확산.
  8. 2 일 동안 4 ° C에서 번호판을 품 어. 그런 다음, 전송 그들 문화와 식물 성장 챔버에 7 일.
  9. 형광 현미경 형광 신호를 확인 하 여 7 일 오래 된 생존 청소년 식물을 선택한 다음 추가 homozygous 식물의 심사에 대 한 토양에 식물을 전송 합니다.

6. 제약 치료

  1. 약 제 치료에 대 한 세포 또는 식물 부 화 하기 전에 그것의 적절 한 작동 농도 액체 MS 매체에서 각 약물을 희석.
    1. Wortmannin 치료: DMSO에 wortmannin 분말을 용 해 하 여 1 m m wortmannin의 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 주식을 저장 16.5 µ M wortmammin를 포함 하는 액체 MS 매체로 청소년 식물 또는 식물 세포를 전송 및 이미징 하기 전에 30-45 분 동안 품 어.
    2. Brefeldin A (BFA) 치료: DMSO에 BFA 분말을 용 해 하 여 1mm BFA의 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 주식을 저장 식물 세포 또는 식물 청소년 10 µ g/mL BFA 이미징 하기 전에 30-45 분을 포함 하는 액체 MS 매체에 전송.

7. confocal 현미경 이미징 및 단백질 Subcellular 공동 지역화 분석

  1. 젊은 식물 또는 기존의 유리 슬라이드에 현 탁 액 셀 전송 및 부드럽게 표준 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 이미징에 대 한 상단 커버 슬라이드를 입었다. 다음 설정을 사용 하 여: 63 X 물 목표 (한다 1.4), 0 배경, 700 증가, 0.168 mm 픽셀 크기, 및 광 전 증폭 관 관 탐지기. 485에서 단백질 GFP 태그 자극 nm 525에서 형광을 검출 하 고 nm. 514에 자극 RFP 태그 단백질에 대 한 nm 575에 감지 nm.
  2. 피어슨 Spearman 상관 (PSC) 공동 지역화는 앞에서 설명한8플러그인으로 이미지 J 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용 하 여 형광 신호의 공동 지역화 비율을 계산 합니다. 피어슨 상관 계수 또는 Spearman의 순위 상관 관계 계수 (그림 4) 결과에 표시 됩니다. 생산된 r 값 1-1에서 될 것입니다. 반면 + 1과-1 완전 긍정적이 고 부정적인 상관 관계, 각각, 2 개의 신호의 0, 2 개의 신호 감지 상관 관계가 보여줍니다.

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결과

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식물에 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식에 대 한 강력 하 고 매우 능률적인 방법을 개발 했습니다. 그것은 종래의의 장벽을 통해 휴식 같이 그림 1A, B를 통해 접근 단백질 공동 식에 여러 개의 분리 된 플라스 미드를 사용할 과도 식 또는 안정적인 유전자 변환. 이 새로운 방법에서는, 우리는 단백질 공동 식 한 번에 (그림 1 cD)를 달성 하기 위해 여러 단백질 식 카세트의 구성 된 단일 식 벡터를 생성 합니다. 고 단백질 식 카세트 기능 단백질 표정에 대 한 그것의 자신의 필수 DNA 요소와 반 independently. 따라서, 각 단백질 식 카세트 수 사용자 지정할 수 없는 독립적으로 단백질 표정에 대 한 다양 한 요구에 따라. 최종 단백질 공동 식 벡터에 관해서는 그것에...

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토론

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여기 우리 튼튼하게 공동 식물에 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하는 새로운 방법 설명 했다. 그것은 과도 식 및 유전자 변환 사용할 수 있으며 현재 형광 단백질 기반 바이오 이미징, 분자, 및 생 화 확 적인 응용 프로그램 및 기술9,10,13와 호환 . 또한, 그것은 단백질 공동 식에 대 한 몇 가지 개별 식 플라스 미드를 사용 하는 기존 방법의 어려움을 극복 한다. 대조적으로, 그것은 여러 단백질 식 카세트와 그들의 자신의 개인 발기인, 형광 태그, 대상 단백질, 종결자를 포함 하는 단일 식 벡터를 사용 합니다. 또한, 단백질 식 카세트 관리할 수 있습니다 하지 독립적으로 특정 발기인의 사용 대상 단백질으로 형광 단백질의 N-또는 C 터미널 공상 융합 등 다양 한 식 요구 사항에 맞게. 따라서, 단백질 식 카세트 기능 같은 플라스 미드에 반 독립적으로 작동...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 유용한 토론 및 의견을 위한 왕 실험실의 구성원 감사. 이 작품은 호우에는 국립 자연 과학 재단의 중국 (NSFC, 보조금 번호 31570001)와 및에 의해 자연 과학 재단의 광 동성 광저우 시 (no. 2016A030313401 및 201707010024 부여) 지원

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
KOD-FX 중합효소TOYOBOKFX-101
Sma INEBR0141L/S/V
Tris-HClBBIA600194-0500
MgCl2BBIA601336-0500
dNTPNEB#N0447V
DTTBBIC4H10O2S2
PEG 8000BBIA100159-0500
NADBBIA600641-0001
T5 엑소뉴클레아제진원지T5E4111K
Phusion 고충실도 DNA 중합효소NEBM0530S
Taq DNA 중합효소NEBB9022S
Murashige 및 Skoog 기초 염 혼합물(MS)SigmaM5524
에탄올BBIA500737-0500
트윈 20BBIA600560-0500
한천BBIA505255-0250
스페르미딘BBIA614270-0001
금 마이크로캐리어 입자Bio-Rad165-22631.0 &마이크로; m
CaCl2BBICD0050-500
MacrocarriersBio-Rad165-2335
Rupture diskBio-Rad165-2329
정지 스크린Bio-Rad165-2336
TryptoneOXOIDLP0042
효모 추출물OXOIDLP0021
NaClBBIA610476-0001
KClBBIA610440-0500
포도당BBIA600219-0001
Hygromycin BGenviewAH169-1G
WortmanninSigmaF9128
Brefeldin ASigmaSML0975-5MG
Dimethylsulphoxide (DMSO)BBIA600163-0500
T100 열 순환기Bio-Rad1861096
성장 챔버PanasonicMLR-352H-PC
PSD-1000/He 입자 전달 시스템Bio-Rad165-2257
Gene PulserBio-Rad1652660
CuvetteBio-Rad1652083
벤치탑 원심분리기Eppendorf5427000097
컨포칼 현미경ZeissLSM 7 DUO (780& 7Live)
NanoDrop 2000/2000c 분광 광도계Thermo Fisher ScientificND-2000
EPS-300 전원 공급 장치TanonEPS 300
형광 현미경MshotMF30
AgroseBBIA600234
AmpicillinBBIA100339
Ethylene Diamine Tetraacetie AcidBBIB300599

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  2. Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
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