서 주 신장 조직 세그먼트와 소설 비 계 없는 건설 기술 관

요약

신장 구조 조직 설계 기관 부족 및 투 석의 해로운 효과 위한 솔루션을 제공합니다. 여기, 우리는 마이크로 프로토콜 설명 cortico 골 수 세그먼트의 격리 murine 신장 해 부. 이 세그먼트는 신장 organoids를 형성 세포 비 계 없는 구문으로 이식.

초록

신장 이식 이제 끝 단계 신장 질병을 위한 주류 치료 이다. 그러나, 대기자 명단 이식 달성이 환자의 단지 1 / 4에 대략 96000 명, 기관 실패와 그에 대 한 대안에 대 한 절박 한 필요가 있다. 그것은 지불 해야 하는 전체 의료 비용 함께 투 석의 해로운 결과 감소, 활성 조사 기관 이식에 대체 솔루션을 찾아 진행 중 이다. 이식 조직 설계 신장 세포 구조 등 가능한 방식을 한 손실된 신장 기능을 대체 있습니다. 여기, 처음으로 설명입니다 생활 corticomedullary의 격리 murine 신장 서 신장 세그먼트. 이러한 세그먼트 한번 이식 호스트 맥 관 구조와 신속한 연결 수 있는 비 계 없는 내 피-섬유 구조 내의 급속 한 합동 할 수 있다. 성인 마우스 신장 살아있는 기증자, 200-300 µ m 직경에서 신장 세그먼트를 stereoscope 서 뒤에서 조달 했다. 여러 신장 구조 한 신장에서 수확 기본 신장 세그먼트를 사용 하 여 조작 했다. 이 메서드는 기능 신장 조직 그렇지 않으면 삭제 될 것 입니다에서 구제할 수 있는 절차를 보여 줍니다.

서론

만성 신장 병 (CKD)는 현재 중요 한 공중 위생 도전 전세계¹중 하나입니다. 미국에서 CKD의 보급은 가장 심각한 형태, 끝 단계 신장 질병 (ESRD)²에서 고통 이상 600000 미국인과 전체 인구의 14% 이상. ESRD 있는 사람들을 위해 사용할 수 있는 현재 치료 옵션 포함 투 석 및 신장 이식. 약 25000 환자가 신장 이식 매년 받아야, 비록 환자 수가 매년 인명 기관 및 그 수신 이식³를 기다리고 그 사이 큰 차이가 이어지는 추가 됩니다. 장 수 및 삶의 질에 심각한 부정적인 영향, 뿐만 아니라 투 석 놀라운 금융 부담으로 연결 됩니다. 2014, 메디케어 클레임을 지불 ESRD 환자²$30 십억 이상 합계 했다. 제한 된 장기 공급 및 환자 투 석 요구에 아무 명백한 하향 추세, 연구 노력 투를 대체 솔루션 식별 목적으로 하 고 이식도 중요 하다. 투에 대 한 필요에도 비교적 짧은 지연 투 석 관련 비용^4,,56을 연기 하는 동안 환자 수 질 조정 된 생활 년 및 생산성을 실질적으로 증가 합니다.

있으 나 ESRD에서 그런 기능 조직 손실에 대 한 솔루션 전체 기관 공학 사용 하 여 비 계 기반 organoid 제조에서까지 널리 다양 한 접근법과 조직 공학 및 재생 의학 연구소에서 현재 공부 되 고 있다 오르간 구조 세포 이식^7,,89,10,11decellularized 업과 한계 또는 폐기 신장에서 복잡 한 신장 구조는 부분적 으로만 조사. 사실, 거의 20% 신장 이식에 대 한 조달의 다양 한 이유로^12,13에 대 한 삭제 됩니다. 이러한 상 상속 이식에서 신장 기능 조직 활용 고 하나 또는 여러 조직 설계 구조에 통합 될 수 있습니다. 사전 연구 신장 조직 공학 목적^14,15엑스트라 세포 매트릭스를 활용 하 여 이러한 폐기 장기 사용의 타당성을 설명 했다. 그러나, 몇 가지는 사용 건강 한 신장에서 기본 nephronal 조직 조직 공학 목적^16,,1718.

이전 김 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 한 가지 방법은 다음 polyglycolic 산 (PGA) 건설 기계 구조물 제작¹⁶에 시드 했다 건강 한 쥐 신장에서 신장 "세그먼트"의 분리를 포함 한다. 그러나, 작은 정보 정확한 해 부 방법론에 관한 부여 되 고 세그먼트 잘 닦지 및 여과의 조합에서 입수 했다. 우리는 마찬가지로 그대로 nephronal 아키텍처, 개별 신장 세그먼트 하지만 기정 기법에 의존 하는 대신이 프로토콜의 설명. Nephrectomies는 살아있는 성인 생쥐, 신장 어디 신장 캡슐을 제거 하 고 조직을 더 해 부 해 부 현미경을 전송 후에 수행 됩니다. 작은-내경 30½ G 바늘 절삭 악기로 사용 되 고도 가이드 해 부에 은닉, 바늘으로 직경은 신장 세그먼트의 대상 직경. 격리 된,이 경우 murine, 신장 세그먼트 문화에서 생존을 유지 하 고 비 계 없는 내 피-fibroblast 세포 구조¹⁹통합. 이러한 구문은 이전 바이오 인공 췌 장²⁰를 포함 하 여 다른 장기를 사용 되었습니다.

프로토콜

아래에 설명 된 모든 동물 수술 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 의학 대학의 사우스 캐롤라이나에서 어떤 동물 수술 전에 또는 사용의 어떤 동물의 조직에 의해 승인 되었다.

1. murine 신

1. 수술 용 마스크와 오염 위험을 최소화 하기 위해 bouffant 모자를 돈. 외과 영역의 설정 동안 불 임을 유지 합니다.
   1. 운영 테이블에 비 fenestrated 수술 커튼을 배치 합니다.
   2. 무 균 커튼에 압력가 악기의 팩을 엽니다. 신에 필요한 악기 3 작은 hemostats, 정밀한 집게 이빨, 이빨, 그리고 직선 아이리스가 위 없이 좋은 집게.
   3. 운영 테이블의 센터에 다른 비 fenestrated 외과 용 드 레이프를 배치 합니다.
   4. 5 mL의 Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS) 칼슘과 마그네슘, 1% 페니실린/스 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 보충을 준비 합니다. 얼음 운영 테이블 옆에이 솔루션을 배치 합니다.
2. 동물 주택 단지에서 8-12 주 오래 된 C57BL/6 마우스를 (남성 또는 여성)를 가져옵니다.
3. 마 취 유도 챔버 내부 마우스를 놓고 3.5% 흡입 isoflurane로 유도 합니다. 코 콘 2 %isoflurane 마 취 유지 보수에 대 한 사용 하 여 마우스를 놓습니다.
   1. 주기적으로 페달 반사 (회사 발가락 핀치)에 대 한 평가 하 여 수술 내내 마 취의 적절 한 깊이 대 한 모니터.
4. 제 모 크림을 사용 하 여 복 부 몸통에서 머리의 모든을 제거 합니다. 이 지역을 모든 머리에서 복 부 제거 되었습니다 되도록 증류수로 헹 구 십시오.
5. 최고 비 fenestrated 드 레이프에서 부정사 자리에 무 균 운영 테이블에 마우스를 전송 합니다. 그냥 마우스 복 부를 overlying 드 레이프에 2 x 2 cm² 창문 내기를 잘라.
6. Povidone-요오드 70% 에탄올 복 부 살 균 거 즈 또는 코 튼 볼을 사용 하 여 다음 적용 됩니다.
7. 가 위 치아와 아이리스 미세 집게를 사용 하 여, 3-4 cm 수직 복 부 피부 절 개를 중간, 중간의 왼쪽에 0.5 cm에 평행 하 게
   참고: 오른쪽 신장 제거 하려고,이 중간의 오른쪽에 0.5 c m 절 개 될 것입니다.
   1. 아이리스가 위로 복 부 캐비티를 입력 incise을 치아 없이 좋은 집게와 복을 잡고. Hemostats 피부와 긴장을 옆으로 배치 하 고 노출 강화 복의 뛰어난 및 하 부 측면 가장자리에 적용 됩니다.
   2. 섬세 하 게 노출 왼쪽된 신장에 복 부의 오른쪽 장 내용 이동. 부드럽게 복 부의 상승 신장에 견인 장소.
   3. 왼쪽된 신장 hilum 걸쳐 hemostat 장소. 아이리스가 위를 사용 하 여 transect ureter과 신장 혈관.
   4. 1% 왼쪽된 신장 에서도 얼음에 페니실린/스 DPBS 솔루션.
   5. 포함 하는 메 마른 조직 문화 후드에 신장 튜브를 전송 합니다. 15 mL 원뿔 튜브의 신장 60 mm 페 트리 접시 (그림 1)에 전송. 칼슘과 마그네슘 5 mL DPBS를 사용 하 여 두 번으로 하는 린스 신장 5 ml DPBS 60 mm 접시에 일시 중지 하십시오.
      1. 5 mL DPBS 기정 프로토콜 중 사용할 수와 함께 추가적인 60 mm 페 트리 접시를 준비 합니다.
   6. 승인 된 IACUC 동물 프로토콜에 따라 thoracotomy와 신장, 조달 다음 exsanguination 마우스를 안락사.

2. murine 신장 서 신장 세그먼트 격리에 대 한

1. 메 마른 기술 프로토콜, 메 마른 장갑, 수술 용 마스크를 포함 하 여의이 부분에 대 한 사용 하 여 계속 bouffant 오염 위험을 최소화 하 고.
   1. 장소 살 균 영역 왼쪽 및 오른쪽 현미경의 악기에 대 한 멸 균 분야에 뿐만 아니라 스테레오 현미경 플랫폼에 커튼. 현미경 초점 손잡이에 플라스틱 접착 시트를 배치 하 고 70% 에탄올 스프레이. 무대를 빛 듀얼 목이 조명 기를 켭니다.
   2. 오픈 소독된 악기 (치아, 메스 핸들, #15 메스 블레이드, 두 직선 hemostats, 두 30½ 없이 미세 집게 게이지 빈 구멍 바늘) 무 균 커튼에. 메스에 장소 #15 블레이드 지금 처리 하 고 각 바늘 어댑터/허브 그림 1에서 보듯이 나중 사용을 위한 바늘 절 개 악기를 만들려고 한 hemostat를 연결 합니다.
2. 60 mm 페 트리 디쉬, 포함 하는 DPBS와는 다른 유일한 DPBS, 현미경 영역 조직 문화 후드에서 신장 하나를 이동 합니다.
   1. 목표 아래 60 mm 페 트리 접시를 놓고 신장 폭로 뚜껑을 제거 합니다. 나중에 사용에 대 한 멸 균 분야에 포함 하는 DPBS 접시를 옆에 둡니다.
   2. 만 신장의 앞쪽 또는 후부 표면 (즉, 접시의 바닥을만 지 다른 얼굴로 신장의 대형 평면 얼굴) 보기에 접시를 이동 합니다. 절차의이 부분에 대 한 3.2-4 배속 줌. 비 지배적인 손을 사용 하 여, 통과 하는 신장 신장 열 등 하 고 우량한 극 근처 요리에 대 한 핀 치아 없이 미세 집게를 사용 합니다.
   3. 신장 핀 장소에 비 지배적인 손을 계속. 지배적인 손을 가진 #15 블레이드를 사용 하 여 노출 된 표면에서 반투명 섬유 capsular 레이어를 제거 하. 신장 캡슐의 나머지를 제거의 노출 된 표면에서 가장 천박한 0.5 m m를 면도.
   4. #15 블레이드를 사용 하 여 조직의 약 2 m m³ 크기에서, decapsulated 지역에서 거꾸로 피라미드 해 부. DPBS만을 포함 하는 60 m m 접시를 검색 하 고 깨끗 한 접시에 조직의 피라미드를 배치. 신장에의 나머지를 삭제 합니다.
   5. 해 부의 나머지 부분에 대 한 1.5-2.0 X 확대를 감소. 때까지 조직 세그먼트 바늘 팁의 직경 보다 작거나 조직 조각 점차적으로 작은 조각으로 슬라이스 절단 악기 두 hemostat 바늘 악기를 사용 하 여. 크기의 신장 조직 2 m m³ 는 50 개 이상의 세그먼트를 한 번 완전히 해 부를 생산할 예정 이다.
   6. 조직 문화 후드에 신장 세그먼트와 60 mm 접시를 이동 합니다. 1000 µ L 피 펫 사용 DPBS를 제거 합니다. 5 mL DMEM, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보충을 추가 합니다.
   7. 문화 인큐베이터 또는 세포에 이식에서 37 ° C에서 3 일 동안 즉시 생성합니다.

3. 신장 세그먼트 세포질 구조 제조

1. 문화 정상적인 인간 피부 섬유 아 세포 (NHDF) 그리고 인간의 지방 microvascular 내 피 세포 (HAMEC)를 10⁵ fibroblasts x 7.2와 1.8 x 10 원하는 구조 당⁵ 내 피 세포 몇 주 동안. 조직 문화 후드에서 agarose 금형 미리 혈관 비 계 없는 내 피 섬유 구조 (사양) 앞에서 설명한 Czajka 에 의해 형성에 막대 모양의 우물으로 (4:1) 내 피 세포를 섬유 아 세포의 적절 한 비율 씨 외 ¹⁹.
2. 멸 균된 hemostat, 30½ G 바늘 및 플랫 엔드 메 마른 주걱 얻을.
   1. 발음 및 신장 세그먼트를 제거 하지 않도록 주의 되 고 신장 세그먼트를 포함 하는 60 m m 플레이트에서 미디어의 대부분을 제거 합니다.
   2. 세그먼트의 주입을 시각화 하기 위해 외과 Loupes 장비.
   3. 10-15 세그먼트를 얻을, 주걱의 매우 끝에 따라 균등 하 게 퍼져 60 mm 접시의 바닥을 따라 부드럽게 주걱의 끝을 다쳤어요. 사양 시드 했다 잘의 입술에 최대한 가깝게 주걱의 끝을 놓습니다.
   4. 우물의 가장자리를 주걱 끝에서 각 개별 세그먼트를 이동 하려면 다른 손에 hemostat 30½ G 바늘 악기를 사용 합니다. 부드럽게 잘 사용 하는 약간 이전 시드 세포 현 탁 액에 빠져들 때까지 바늘 팁에 아래로 각 세그먼트를 이동 합니다.
   5. 2에서 신장 세그먼트 사양 문화: FGM-2/EGM-2/DMEM 매체 (2.5 mL 전체 볼륨)의 1:1 비율. 3 일 문화 미디어 모든 24 h를 변경 합니다. 구문에서 72 h 형에서 제거 하 고 수정 또는 플래시-동결 처리를 위해.

결과

설명 하는 프로토콜 신장 조직의 피라미드 2 mm³ 섹션 당 약 50 신장 세그먼트를 생성 합니다. 처리 되 고 몇 군데 신장 세그먼트 다른 비율 ( 그림 2참조) 관 및 사 구성 요소에 있는. 그대로 세그먼트는 3 일 동안 다른 세그먼트 한 번 모든 24 h의 생존 능력을 결정 하기 위하여 분석 결과를 받게 했다. 그린 형광 calcein-오전은 세포내 esterase 활동, 살아있는 세포의 지표와 함께 존재 합니다. 레드-형광 브로민 homodimer-1 원형질 막의 무결성의 손실 볼 수 있다. 이러한 세그먼트는 그대로, 3 차원 구조, 중요 한 분석 결과 침투 confocal 현미경 검사 법으로 감지할 수는 ( 그림 3참조).

세그먼...

토론

메서드 구문 두 종류의 세포와 생체 재료 활용, 그리고 많은 경우에,에 관해서는 넓게 변화 신장 조직 생활 하는 데 사용 되는 오래 된 또는 하지 잘 성격을 나타낸 문학⁷. 많은 줄기 세포 접근을 사용 하는 또는 업과 고립에서 신장 아키텍처의 개별 구성 요소, 인위적으로 세포 현 탁 액에서 26 다른 차별화 된 세포 유형으로 전체 기관 재현의 전망 ²¹고려를 압도. 이것은 아마 왜 다른 신장 조직의 세그먼트를 사용 하 여 조직 엔지니어링 응용 프로그램에에서 접근을 이동입니다. 위에서 설명한 대로 이전 작업은 PGA 건설 기계¹⁶에 시드를 위한 신장 세그먼트의 격리에서 수행 되었습니다. 그러나, 세그먼트의 격리를 설명 하는 데 사용 하는 방법 좀 자세하게에서 설명 했다 고 세그먼트 하지 어떤 일정 기간 생존 능력에 대 한 평가 대 한 교양 했다. 여기, 세포 생존 능력 분석 결과 사용 하 여 함께 설명 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Non-fenestrated Sterile Field	Busse 병원 일회용품	696
Fenestrated Sterile Field	Busse 병원 일회용품	697
Halsted 모기 집게 5 곡선	Miltex	Mil-7-4	원고의 "Hemostat"
초미세 Graefe 집게, 치아가 있는 곡선	Fine Science Tools	11155-10	치아가 있는 미세한 집게
엑스트라 파인 그레이프 집게, 톱니 모양 (치아 없음)	Fine Science Tools	11152-10	이빨이없는 파인 펜치
파인 가위 - 텅스텐 카바이드	파인 사이언스 도구	14568-09	아이리스 가위
Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5 %	Purdue Products LP	67618-151-17
멸균 면 거즈 패드(4" x 4")	Fisher Healthcare	22-415-469
Dulbecco의 인산염 완충 용액	Corning	21-030-CV
페니실린/스트렙토마이신 용액, 100X	Corning	30-002-Cl
이소플루란, USP	제조사: Piramal, 유통업체: McKesson	2254845
Nair Hair Remover	Nair	22600-23307	제모 크림 텍스트
200 프루프 에탄올	Decon Laboratories	2705	70% 에탄올 용액으로 희석
BioLite 60mm 조직 배양 접시	Themo-Scientific	130181
Press'n Seal	Glad	12587-70441	입체 스코프에 적용
SZX16 실체 현미경	Olympus	SZX16
광섬유 조명기	Cole Parmer	41720-20
자체 지원 이중 광 파이프, 23" L 구즈넥	Cole Parmer	EW-41720-60
메스 핸들 #3	Miltex	Mil-4-7
멸균 립백 탄소강 블레이드, 블레이드 크기 15	Bard-Parker	371115
31 1/2 게이지 바늘	ThermoFisher Scientific	14-826F	Becton Dickinson 305106
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-017-CV
태아 선택 100% 소 혈청	Atlas Biologicals	FS-0500-AD
정상 인간 피부 섬유아세포	Lonza	CC-2511
인간 지방 미세혈관 내피 세포	Sciencell Research Laboratories	7200
수술용 확대경(2.5x)	Orascoptic	(N/A) 맞춤 주문
FGM-2(FGM-2 SingleQuots 추가)	Lonza	CC-3131, CC-4126
EGM-2(EGM-2 SingleQuots 추가)	Lonza	CC-3156, CC-4176
포유류 세포용 Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit	ThermoFisher Scientific	L3224
항사이토케라틴-18 항체	Abcam	ab668
염소 항 마우스 IgG, Alexa Fluor 633	ThermoFisher Scientific	A-21052
염소 항 토끼 IgG, Alexa Fluor 546	ThermoFisher Scientific	A-11010
항 폰 Willebrand 인자 항체	Abcam	ab6994
알부민, 플루오레세인 이소티오시아네이트 Conjugate	Sigma Aldrich	A9771-50MG
Hoescht 33342	BD Pharmingen 561908
배경 버스터	Innovex Biosciences	NB306