곤충 Spermatocytes에 염색체의 micromanipulation

요약

이 프로토콜에서 선택과 그 세포 내에서 염색체 위치를 micromanipulation에 대 한 적절 한 셀의 준비와 압 전 micromanipulator의 사용을 설명 합니다.

초록

염색체의 micromanipulation는 염색체 congression, 스핀 들 검사점 및 anaphase 염색체 운동에 대 한 메커니즘을 조명 하는 필수적인 방법 고 있다 염색체의 움직임을 제어 하는 무슨을 이해 하는 열쇠 셀 부 중. 숙련 된 생물학자는 micromanipulator 염색체는 세포 내에서 위치를 변경 하 고 아주 좋은 팁는 작은 유리 바늘을 사용 하 여 염색체를 힘을 적용 하는 스핀 들에서 염색체를 분리 사용할 수 있습니다. 섭 염색체 광학 트래핑 같은 다른 방법과 레이저의 다른 사용을 사용 하 여 만들 수 있습니다, 하는 동안 날짜, 아니 다른 메서드를 사용 하면 셀에 아무 손상도 거의 미크론의 수백에 10의 규모에 세포 구성 성분의 위치 .

선택과 적절 한 세포의 염색체, 메뚜기 및 귀뚜라미 spermatocyte 기본 문화권의 준비 라이브 셀 이미징 및 micromanipulation, 사용에 대 한 설명의 micromanipulation에 대 한 준비는 여기 설명합니다. 또한, 우리는 나누어 세포 내에서 염색체 위치를 그것에 붙어 있던 유리 바늘으로 세포, 그리고 조이스틱 제어 압 전 micromanipulator 사용 내 염색체 이동에 사용할 바늘의 건설을 보여줍니다. 샘플 결과 micromanipulator 기본 spermatocyte에 스핀 들에서 염색체를 분리 하 고 세포 내에서 해당 염색체 위치를 사용을 보여준다.

서론

Micromanipulation은 염색체 congression, 스핀 들 검사점 및 anaphase 염색체 운동에 대 한 메커니즘의 일부를 공개 했다. 가장 이른 간행물 micromanipulation 실험의 결과 설명 하는 로버트 챔버¹했다. 챔버는 여러 종류의 다른 세포의 세포질을 연결 된 유리 바늘 기계 micromanipulator를 사용. 불행 하 게도, 염색체와 살아있는 세포에 많은 다른 세포 구성 성분의 시각화를 허용 하는 대비 방법을 사용할 수 없었습니다, 당시 챔버 실험 재배치 같은 세포 구성 성분의 효과 표시 하지 수 있으므로. 초기 micromanipulations 염색체 위치를 변경 하는 이러한 조작 anaphase 메뚜기 neuroblasts^{2에서에서 염색체 팔의 위치를 변경할 수 보여주는 anaphase 셀에 스핀 들 midzone 청소 챔버 장치 사용} . 니와 그의 공동 작업자 최초로 염색체의 미세 micromanipulations 수행 염색체³스트레칭, 스핀 들에서 그들을 분리 하 고 재교육^3,4, 안정화를 유도 한 염색체

프로토콜

1. Micromanipulation에 대 한 기본 곤충 Spermatocyte 세포 배양의 준비

1. 슬라이드 준비
   1. 슬라이드의 중심에서 밖으로 잘라 20 m m 직경 원형 구멍 75 m m x 25 m m 유리 슬라이드를 가져옵니다.
      참고:이 창 유리 유리 슬라이드 중심에 구멍의 크기를 한 시트에서 절단 했다.
   2. 2 분 젠 버너 불꽃을 통해 25 m m x 25 m m #1.5 coverslip 실행 s.
   3. 유리 슬라이드에 구멍의 가장자리 주위에 진공 그리즈
   4. 그림 1과 같이 구멍에 coverslip 장소. 그것은 누르고 단단한 물개를 형성 하는 것을 확인 하십시오.
   5. 유리 슬라이드를 플립 하 고 halocarbon 기름으로 잘 해 부를 입력 합니다.
2. 현미경에 대 한 spermatocyte 문화 준비
   참고: 여기, 우리가 메뚜기 또는 귀뚜라미 셀을 사용 하 여 문화 준비 방법을 설명 합니다. 다른 절지동물의 testes 내용은 비슷한 방법을 사용 하 여 양식 수 있습니다.
   1. Subadult 남성 귀뚜라미 (메뚜기)를 가져옵니다. 감기-anesthetize에 약 2 분 동안 냉장....

결과

그림 6 micromanipulation의 가능한 사용의 몇 가지 예 2 인접 한 메뚜기 기본 spermatocytes의 샘플 micromanipulation를 보여 줍니다. 이 실험 수행 되었다 거꾸로, 단계 대조 현미경을 사용 하 여. 0:00 (시간 표시 있는 min:s) 이미지 조작 전에 두 셀을 보여 줍니다. 맨 아래 셀에 하나의 염색체 micromanipulation 바늘에 의해 적용 긴장 아래 표시 (0:05; 검은 화살표) 다음 스핀 들에서 완전히 분리 하 고 (0:10; 검은 화살표). 아래쪽 셀 (6시 25분; 노란색 화살표)에서 하나의 염색체 1 스핀 들 (7시 05분; 노란색 화살표) 해당 셀의 극을 향해 밀어 이며 (7시 10분; 노란색 영역) 주요 스핀 들 영역 외부 이동. 모두 조작된 염색체 (노란색과 검은색 화살표)이이 실험에서 새로운 스핀 들 첨부 파일의 형성을 방지 micromanipu.......

토론

연습으로, 세포에서 염색체를 이동 하는 것은 제 2의 천 될 수 있다. 충분히 뻣 뻣 한 그리고 충분히 얇은 밀고 바늘은 어려운 "의 요령" 조작, 하지만이 기능 또한 연습으로 온다. 그래서 괜 찮 그들은 변형 halocarbon 기름에 이동할 때 바늘 셀에 염색체를 추진 하는 데 유용 되지 않습니다. 그래서 바늘 그들의 팁을 볼 수 있습니다으로 염색체의 폭의 1/3로 (또는 더 큰)는 세포를 죽 일 가능성이 매우 무딘. 염색체를 충분히 괜 찮 아 요 하지만 셀 죽으로 너무 무딘 프로토콜의 중요 한 단계는 바늘의 창조.

성공에는 일반적으로 건강 한 유기 체는 spermatocyte 준비를 만들기 위해 사용 하 고 셀의 위쪽 표면 근처 염색체는 micromanipulation에 대 한 결과. 종종 셀의 coverslip 표면 근처 염색체를 조작 하는 시도 coverslip로 micromanipulation 바늘을 연 삭 및 실험 종료 따라서 puncturing 셀, 결과. 셀이 구.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
VWR 마이크로 커버 유리	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning 고진공 그리스	VWR	AA44224-KT
KEL-F 오일 #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
미세해부 가위, 스테인리스강	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm 외경, 0.65 mm 내경 Pyrex 유리관	Drummond Scientific	맞춤 주문 - 10X
또는 16X 저배율 대물렌즈 및 60X 또는 100X 고배율 대물렌즈가 있는 도립형 위상차 현미경	모든 브랜드
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