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방법 논문

GFP Lentivirus 불리고 Organoids 환자 파생 결 장 종양에서 경작에 의해 생성 된 Micrometastases의 고감도 검출

9.7K 조회수

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DOI:

10.3791/57374

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2018년 6월 14일

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1Department of Coloproctological Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine, 2Department of Molecular Pathogenesis, Juntendo University Faculty of Medicine, 3Atopy Research Center, Juntendo University Faculty of Medicine, 4Department of Oral Pathobiological Science and Surgery, Tokyo Dental College, 5Department of Gastroenterology, Juntendo University Faculty of Medicine

이 논문에서

요약

있도록 매우 민감한 탐지 목표 인간의 대 장 암 (CRC) 세포 조직 정착, 우리 여기 PDX 파생 CRC organoid 셀에 녹색 형광 단백질 (GFP) lentiviral 입자의 효율적인 변환에 대 한 프로토콜을 표시 스테레오-형광 현미경 관찰 받는 쥐로 그들의 주입에의 사전

초록

인간의 대 장 암 (CRC) 치료에 현재 진보에도 불구 하 고 몇 가지 근본적인 치료는 CRC의 늦은 단계에 대 한 효과적입니다. 전 임상 모델으로 오래 된 인간의 암 세포 선 및 종양 모델 개발 되었습니다 많은 유전자 변형 마우스를 사용 하 여 종양이 종이 식 마우스 모델이 임상 문제를 극복 한다 그들은 부분적으로 인간의 carcinomas의 기능을 모방 하지만 종종 내 습 및 전이 포함 하 여 인간 악성의 주요 측면 정리를 하지. 따라서, 더 나은 인간 CRC에 악성 진행을 대표 하는 대체 모델은 오랫동안 기다려온 되었습니다.

우리는 여기 작은 CRC 조각 수술 환자에서 해 부의 피하 주입에 의해 종양 환자 파생 xenografts (PDXs)의 생성을 보여줍니다. 콜론 PDXs 개발 하 고 histopathologically 환자에 CRC를 닮은. 그러나, 몇 가지 자연 micrometastases는 PDX 모델에 영향을 받는 먼 기관의 기존 횡단면에서 감지. 먼 장기에 전이성 보급의 탐지를 촉진 하기 위하여 우리는 문화에서 콜론 PDXs에서 종양 organoid 세포를 추출 하 고 GFP lentivirus 매우 immunodeficient 끄 덕/시-scid IL2Rγ에 주입 하기 전에 그들을 감염null (노 그) 쥐. Orthotopically 주입 PDX 파생 CRC organoid 세포 지속적으로 양식 기본 종양 긍정적인 GFP에 대 한 받는 사람 쥐에서. 또한, 자발적으로 식민지 GFP 표현 특히 형광 현미경 검사 법에 의해 이러한 쥐의 폐에서 감지 micrometastatic 개발. 또한, CRC organoids의 intrasplenic 주입 자주 간 식민지를 생성합니다. 함께 찍은, 이러한 결과 다단계 프로세스 동안 시각적으로 감지 되도록 PDX 파생 CRC organoid 셀 GFP 표시 되 나 침공 전이 캐스케이드 나타냅니다. 설명된 프로토콜 GFP lentiviral 입자에 의해 불리고 해당 CRC organoid 셀의 3D 문화와 인간의 CRC의 PDXs의 설립을 포함 한다.

서론

대 장 암 (CRC)은 암 사망 세계1의 두 번째 주요 원인. 고급 단계 질병을 가진 환자의 일반적인 치료에 부족 한 응답 CRCs를 근본적으로 치료 하는 시도의 무효를 나타냅니다. 더 효과적인 치료 접근을 개발 하기 위해 Crc의 특성을 모방 하는 암의 다양 한 전 임상 마우스 모델 설립 되었습니다. 다양 한 CRC 셀 라인 생성 종양 xenografts 그들의 편 및 조작의 용이성 때문에 널리 사용 되어 왔습니다. 그러나, 암 세포 선의 장기 문화는 다양 한 독특한 세포 인구 꽤 특정 문화 조건 하에서 증식을 함으로써 신뢰할 수 없는 결과 및 전 임상 약에서 중요 한 제한의 결과로 종종 발생 개발입니다.

되지 않고 교양 생체 외에서, 종양 환자 파생 xenografts (PDXs) 또한 인간의 CRC 조직 수술 환자2,,34에서 해 부의 동물 모델에 이식 하 여 생성 된. PDXs는 업과 주요 histopathological 기능으로 널리 인식 되 고 유전 변경 원래에서 파생 된 환자의 종양에 존재. 또한, 종양 환자에서 파생 된 organoids 구성 종양 세포 클러스터 밀접 하 게 원래 종양5,6의 생물 학적 속성을 유사 3D 조건 문화에 의해 설립 되었다. 이러한 종양 organoids 또한 설계5맞춤된 치료를 함으로써 높은 처리량 마약 검사에 적용 했다. 그러나, 현저 하 게 다른 유형의 CRC 인구 간주 됩니다 종양 내의 질량. 특정 CRC 인구 수 선택적으로 증식 한 PDX와 종양 organoids의 구절의 vivo에서 그리고 생체 외에서 시리즈 중 각각 확장 합니다. 이 또한 수 있습니다 전체 진 식 프로필과 피/유전 상태를 변경 하려면 영향을 받는 CRCs의 그로 인하여 부모의 CRC에 최소한의 닮 았에서 결과.

환자에서 파생 된 CRC organoids와 noncancerous 인간 결 장 종양 돌연변이의 조합 또한 종양 침입과 전이 에 의해 궁 행 하는 인간의 종양 세포의 특징을 조사 하기 위해 고용 되었습니다 하버 설계에서 추출 6,7,,89. 그러나, immunodeficient 쥐로 orthotopic 이식 환자에서 파생 된 CRC에서에서 발생 하는 자연 스러운 전이의 발생률이 매우 낮은 했다 포함 하는 침략 전이 캐스케이드의 다단계 과정을 공부 하기 어려운 지역 내 습, intravasation, 혈 류, 넘쳐 흐름 및 먼 장기4,10의 식민지에서 전송. Micrometastasis로 ≤2 m m의 종양 세포 증 착에 의해 표현, CRC organoids 환자에서 파생 된에 의해 형성 된, 실험 마우스 모델에 영향을 받는 먼 장기에서 섹션의 histopathological 분석에 간과. 자연 스러운 micrometastases의 시각화 최소한의 비보에 효율적으로 받는 쥐로 그들의 주입 전에 종양 organoid 세포에 형광 마커를 도입의 어려움으로 인해 되었습니다. 이 연구에서 우리가 개발을 효율적으로 PDX 파생 CRC organoid 셀 받는 쥐로 주입에 앞서 3D 문화에 GFP lentivirus transduce 매우 민감한 탐지를 허용 하는 프로토콜의 스테레오-형광 현미경 검사 법, 고용 그들의 양식 micrometastases에 다른 장기 식민지

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프로토콜

환자 서 면된 동의 제공 하 고 프로젝트 준 텐도 대학의 학부의 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 마우스 실험 동물 연구 윤리 위원회의 준 텐도 학부의에 의해 또한 승인 되었다.

1. Immunodeficient 마우스에 CRC PDXs의 설립

CRC PDXs (1 단계) 구축을 위한 실험적인 절차 그림 1A에 설명 되어 있습니다.

  1. 환자에서 종양의 외과 절제술 후 즉시 기본 CRC 티슈를 준비 합니다.
  2. 워시 차가운 멸 균 인산 염의 30 mL에 여러 번 부드러운 동요에 의해 기본 CRC 조직 50 mL 원뿔 튜브에 식 염 수 (PBS)를 버퍼링 되 고 얼음에 그것을 유지.
  3. 조직에 멸 균 핀셋을 사용 하 여 10 cm 배양 접시, 회 저 성 영역을 광범위 하 게 가능한 멸 균가 위를 사용 하 여 제거 놓고 작은 조각 (크기에서 5 m m3 x 5 x 5) 고체 종양 조직을 잘라 살 균 면도날을 사용 하 여.
    참고: 회 저 성 영역은 종종 하얀, 부드럽고 주변 지역 보다 더 어렵다면입니다.
  4. 6-잘 접시에 얼음 처럼 차가운 살 균 PBS의 2 개 mL의 멸 균 핀셋을 사용 하 여 종양의 작은 조각을 놓으십시오.
  5. 6 주 오래 끄 덕/시-scid IL2Rγ null (노 그) 높은 immunodeficient 마우스 세균-무료 및 특정 병원 체-무료 조건 하에서 번 식.
  6. 쥐와 isoflurane 흡입 작은 동물 흡입 마 취 장치를 사용 하 여 anesthetize 하 고 70% 에탄올으로 피부를 소독. 정상적인 속도 호흡의 깊이 적절 한 anesthetization에 대 한 발가락 핀치 반사의 부재를 보장. 눈에 수 의사 연 고 마 취에서 안구 건조를 방지 하는 옵션입니다.
  7. 건 열 살 균을 사용 하 여 모든 수술 도구를 소독 하 고 모든 절차에 대 한 이러한 도구를 사용 하 여 받는 사람 마우스에 상처 감염을 방지 하기 위해.
  8. 실험실 벤치에 발생 하기 쉬운 위치에 마 취 마우스를 놓습니다. 살 균가 위를 사용 하 여 조직 이식에 대 한 피하 주머니를 생성 하는 받는 사람 마우스의 오른쪽과 왼쪽 측면의 하단 부분에 작은 절 개를 확인 합니다. 알아서 하지 찔린 복 막. 이 절차와 함께 작은 출혈 이어야 한다.
  9. 부드럽게 위의 인공 세포 외 매트릭스의 50 µ L로 종양 조각 준비와 다음 오른쪽과 왼쪽 피하 주머니의 하단 부분에 그들을 이식.
  10. 봉합 상처 절 개 수술 절차를 겪고 쥐 클립. 이식된 종양 조직을 피부 절 개에서 어떤 거리에 위치 하는 것을 확인 하십시오.
    참고: 수술 절차를 최소화 하는 것에 따라 아무 치료 수술 후 통증 및 감염에 대 한이 연구에서 관리 되었다.
  11. 따뜻한 패드에 마우스를 놓고 충분 한 의식 복원 될 때까지 sternal 기댄 위치를 유지 합니다. 일단 완벽 하 게 복구 하 고 모든 4 개의 다리에 앉아서 수, 쥐 자신의 집 새 반환 수 있습니다. 포식을 방지 하기 위해, 동일한 장에 비 운영 동물 사육을 허용 하지 않습니다.
  12. 봉합 누설에 대 한 확인 하 고 생쥐는 안정 된 상태에서 수술 치료 그룹에서 다음 날 확인. 질병의 징후에 대 한 마우스를 확인 하 고 고용 캘리퍼스 일주일에 한 번, 각 마우스에서 종양 크기를 측정.

2입니다. 마우스에서 CRC PDXs의 해 부

CRC PDXs (2 단계)의 해 부에 대 한 실험 절차는 그림 1B에 설명 되어 있습니다.

  1. 종양 크기는 일반적으로 약 1-3 개월에서 ~ 1 c m3 를 피하 성장 하는 것을 허용 한다.
  2. 와 isoflurane 흡입 작은 동물 흡입 마 취 장치를 사용 하 여 마우스를 anesthetize 하 고 70% 에탄올으로 피부를 소독.
  3. 실험실 벤치에 발생 하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다. Incise 피부, 종양을 노출 하 고 조심 스럽게 멸 균가 위를 사용 하 여 종양에서 피부를 분리. 종양을 제거한 후 10 cm 배양 접시에 배치 하 고 어떤 조잡 한 괴 지역은 종양에서 다음 5 mL의 PBS로 두번 씻어.
    참고: 회 저 성 영역은 종종 하얀, 부드럽고 주변 지역 보다 더 어렵다면입니다.
  4. 얼음에 종양을 놓고 서로 다른 응용 프로그램 1) CRC organoid, 문화 2) 이식 보조 마우스, 3) 조직학 시험으로를 포함 하 여 4) 동결 및 종양 조각 저장 4 부분으로 동등 하 게 분할 합니다.
    1. CRC organoids의 생성에 대 한 고체 종양 조직을 살 균 PBS의 1 mL를 포함 하는 6 cm 배양 접시에 놓습니다. (3 단계) 처리까지 얼음에 조직 유지.
    2. 인간의 CRC에 대 한 PDX 모델을 설정 하기 위해 보조 마우스에 신선한 CRC PDXs 통로. 작은 조각 (크기에서 5 m m3 x 5 x 5) 종양 조직을 잘라 살 균 면도날을 사용 하 고 부드럽게 인공 세포 외 매트릭스의 50 µ L로이 조직 파편을 찍어. 그런 다음 1.8-1.11 단계에서 설명한 대로 노 그 마우스의 오른쪽과 왼쪽 피하 주머니의 하단 부분에이 파편을 이식.
    3. 조직학 분석, 2 일 동안 실 온에서 15 mL 원뿔 튜브에 10% 중립 버퍼링된 말린의 5 mL 샘플 수정 했다.
    4. Cryopreservation, 작은 조각 (크기에서 5 m m3 x 5 x 5)으로 종양 조직을 잘라 고 부드럽게 솔루션 1-1.5 mL cryovial 튜브에서 동결 세포의 500 µ L로 샘플을 찍어. 그런 다음-80 ° C 냉장고 관 전송.

3. CRC Organoid 문화에 대 한 셀 서 스 펜 션에 PDXs의 추출

CRC PDXs (3 단계)의 분리에 대 한 실험 절차는 그림 1B에 설명 되어 있습니다.

  1. 장소는 위의 (2.4.1 단계) 준비 종양 10 cm 배양 접시에 파편.
  2. 살 균 면도날을 사용 하 여 파편을 말하다 고 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS)의 8 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브로 그들을 전송-Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 콜라 효소 주식의 80 µ L ( 재료의 표참조).
  3. 튜브를 단단히 닫고 parafilm 누설을 방지 하기 위해와 모자를 포장 합니다. 부드럽게 2 h 37 ° c.에 대 한 선동 세포 현 탁 액에 다진된 종양 조각 해리, 하 Note는 아직 소화 되지 않은 조직의 튜브에 남아 있는 많은 조각 있을 것입니다.
  4. 4 ° C에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 튜브 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 10%의 10 mL를 사용 하 여 셀 펠 릿 해결 FCS-DMEM 세포 현 탁 액을 만들기 위해.
  5. 소화 되지 않은 조직 파편을 제거, 세포 현 탁 액 50 mL 원뿔 튜브에 설정 40 µ m 셀 스 트레이너를 사용 하 여 두 번을 필터링. 다음, 원심 분리기 통해 흐름 300 x g 에서 4 ° c.에서 5 분 상쾌한을 제거 하 고 얼음에 펠 릿을 유지.

4. 인공 세포 외 기질에 교양 CRC Organoids 세대

콜론 PDXs (4 단계)의 CRC organoid 문화에 대 한 실험 절차는 그림 1B에 설명 되어 있습니다.

  1. PDX 파생 CRC organoids ( 테이블의 자료, "CRC organoid 문화 매체" 참조)에 대 한 적합 한 문화 매체를 설정 미디어 이전 인간의 콜론 organoids11에 대 한 설명.
  2. 인공 세포 외 매트릭스의 150 µ L을 적용 ( 재료의 표참조) 당 얼음 12-잘 접시에 잘 고 다음 37 ° C, 5% CO2 배양 기는 젤을 공고히 하에 30-60 분 동안 품 어.
  3. 단계에서 3.5 CRC organoid 문화 매체와 (4.1 단계)에서 조정 3 x 105 셀/mL을 달성 하기 위해 5 %fcs 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. 그런 다음, 인공 세포 외 매트릭스 코팅 접시에 준비 단계 4.2에서에서 매체의 1 mL 씨. 37 ° C에서 5%에서 밤새 품 어 그리고 CO2. 셀 서 스 펜 션의 단일 세포 및 다세포 클러스터 부착 세포의 (그룹)를 포함 하 여 종양 세포의 수를 세는 hemocytometer를 사용 합니다.
    참고: 5 %FCS이 연구에서 콜라의 잔여 효소 활동을 풀기 위해 사용 됩니다.
  4. 신중 하 게 문화 매체를 수집, 부동 1.5 mL로 인공 세포 외 매트릭스 코팅 접시에서 분리 된 셀을 포함 하 여 다음 날에 튜브를 원심 1400 x g 5 분에 원심. 그리고 제거는 상쾌한 다시 얼음에 인공 세포 외 매트릭스의 70 µ L에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  5. CRC 세포 생존 능력을 증가 하는 종양 세포를 포함 하 인공 세포 외 기질 종양 organoid 세포 인공 세포 외 매트릭스 코팅 판에 부착 하 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기 공고히 하에 30 분 동안 품 어에 오버레이 인공 세포 외 매트릭스 코팅입니다. 다음, 품 어 그것의 37 ° C에서 1% fcs CRC organoid 세포 배양 매체 1 mL와 함께 아래 5% CO2.
  6. 둘째 날 모든 문화 매체를 변경 합니다. CRC organoids 매체 작성, 그것 매일 매체를 변경 하는 데 필요한 될 수 있습니다.

5. 세대 및 GFP Lentiviral 입자의 농축

생성 및 GFP lentiviral 입자 (5 단계)의 우라늄 농축 실험 절차는 그림 1C에 설명 되어 있습니다.

  1. 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 중간 포함 10% fcs HEK293T 셀 문화 및 6 10 cm 요리 (요리 당 2 x 106 셀) 다음 transfection 절차에 대 한 준비.
  2. 접시 당 transfection, 500 µ L DMEM transfection 시 약 PRRL GFP 벡터 (5 µ g)12 의 20 µ L pCMV-VSV-G (1 µ g) 등 살 균 1.5 ml에서 pCMV dR8.2 dvpr (5 µ g), 두 개의 lentiviral 포장 플라스 미드를 포함 하는 혼합물의 준비 microtube입니다. 20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 유지 하 고 각 10 cm 요리에 오버레이 그리고 18 h에 대 한 그들을 품 어.
  3. 매체를 제거, 각 요리에 신선한 10% FCS RPMI 1640 매체의 5 mL을 추가 하 고 떠나 24 시간 동안 서.
  4. 50 mL 원심 분리기 관으로 각 접시에서 조절된 매체를 수집 하 고 하룻밤 30 mL 4 ° C에서 매체의 총 저장. 각 요리에 신선한 RPMI 1640의 5 mL을 추가 하 고 떠나 24 시간 동안 서.
  5. 50 mL 원심 분리기 튜브와 유지, 얼음에 매체의 총, 30 ml에서에 각 접시에서 조절된 매체를 수집 합니다. 그런 다음, 셀을 삭제 합니다.
  6. 60 mL (5.4-5.5 단계)에서 매체의 세포를 제거 하 고 ultracentrifugation에 대 한 12 5 mL 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브이 수량을 분할 하는 0.45 μ m 필터를 통해 필터링.
  7. 진동 물통 회전자를 사용 하 여 바이러스를 집중, 원심 ( 재료의 표참조) 4 ° c.에 1.5 h 85,327 x g 에서
  8. 매체를 즉시 제거. 집중된 바이러스 펠 릿을 해결 하려면 영양소 햄의 혼합물 F-12 (F12)의 250 µ L 장소 / 12의 각각에서 FCS 없이 DMEM 매체 튜브와 하룻밤 4 ° C에서 그것을 유지. 펠 렛의 바이러스는 종종 표시 되지 않습니다.
  9. 부드럽게 매체 수집의 집중 5 x GFP lentivirus, 아마도 108 시험 단위 (TU/mL) 당 GFP lentiviral 입자를 포함 한 총 3 mL를 플라스틱. 그런 다음, 최대 1 년-80 ° C에서 살 균 조건 하에서 (를 포함 하 여 튜브 당 250 µ L) 12 1.5 mL microtubes를 저장. 많은 작은 aliquots 여러-동결 해 동 주기를 피하기 위해 원래 솔루션의 준비.

6. GFP Lentiviral 입자와 교양 인공 세포 외 기질에 CRC Organoid 셀 라벨

GFP lentivirus (6 단계)와 CRC organoid 셀 라벨에 대 한 실험 절차는 그림 1C에 설명 되어 있습니다.

  1. CRC organoids 단계 7-10 일에 대 한 간섭 없이 성장 하 고 기계적으로 살 균 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 그들을 수확 1.5 mL microtube에 그들을 전송 4.6에서에서 준비 하실 수 있습니다.
    참고: CRC organoids 문화에서 성장 환자에서 원래 종양의 성격에 따라 달라 집니다. 새로운 인공 세포 외 매트릭스 코팅 12-잘 접시에 1:2 분할 비율에 전송 하기 전에 60-70% 합류에 그들을 유지 하 여 CRC organoids의 전면에 자라 난을 피하십시오.
  2. 1400 x g에서 3 분 동안 microtube 원심, 문화 매체를 제거 하 고 부드러운 두 드려서 PBS의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 해결 합니다.
  3. 1400 x g 에서 3 분 동안 microtube 원심 고 PBS를 제거 합니다.
  4. 부착 CRC organoids 해리를 분해의 세포 분리 솔루션의 500 µ L을 추가 하 고 셀에 collagenolytic 효소 튜브에 작은 부드러운 두 드려서 그것을 혼합. 그런 다음 실 온에서 10 분 동안 정착 관 둡니다.
  5. 1%의 추가 500 µ L로 세포 현 탁 액을 아주 부드럽게 플라스틱 대략 세포 분열을 여러 번에 1.5 mL microtube FCS DMEM. 가혹한 pipetting으로 CRC organoids에서 단일 세포의 생성은 현저 하 게 세포 생존 능력을 감소 시킨다. 따라서, 매우 부드럽게 1.5 mL microtube에 pipetting으로 세포 현 탁 액에서 시각적으로 감지 세포의 질량을 떠나 필수적 이다.
  6. 1400 x g 3 분 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
  7. 5 x GFP lentivirus 주식의 100 µ L의 혼합 셀 펠 릿을 해결 (> 108 화/mL) 5 x 105 의 농도를 조정 하려면 부드러운 드려서 1.5 mL microtube에 CRC organoid 문화 매체의 400 µ L 해리 500 µ L 당 종양 세포와 . (단계 4.3) 위에서 설명한 대로 세포 현 탁 액에 단일 셀 및 셀 그룹을 포함 하는 종양 세포의 수를 세는 hemocytometer를 사용 합니다.
  8. 4.2 단계에서 설명한 대로 인공 세포 외 매트릭스 코팅 12-잘 접시를 준비 합니다. 그런 다음, 접시에 6.7 단계에서 세포 현 탁 액의 500 µ L를 놓고 두고 37 ° C에 18 h 미만 5% CO2.
  9. 1.5 mL 원심 분리 관으로 인공 세포 외 매트릭스 코팅 접시에서 분리 떠 있는 세포와 매체를 수집 합니다. 1400 x g 에서 원심 다음는 상쾌한을 제거 하 고 다시 얼음에 인공 세포 외 매트릭스의 70 µ L에 펠 릿을 중단.
  10. CRC 세포 생존 능력을 증가, 단계 4.5에서에서 설명 된 종양 세포를 포함 하 인공 세포 외 매트릭스 인공 세포 외 매트릭스 코팅 12-잘 접시에, 연결 된 종양 organoids에 오버레이 합니다. 다음으로, 37 ° C, 5% CO2 배양 기 인공 세포 외 매트릭스 코팅을 공고히 하 고 그 문화 그것은 37 ° C에서 1% fcs CRC organoid 문화 매체의 1 mL와 함께 아래 5%에에서 30 분 동안 접시를 품 어 CO2.
  11. 거의 100%의 GFP 양성 lentiviral 입자 ( 그림 2A참조)의 높은 titer의 사용을 확인 하는 형광 현미경에서 감염 후 3 일에서 세포를 관찰 합니다.
  12. 확장 받는 사람 쥐로 주입에 앞서 세포 성장에 7-10 일의 기간에 대 한 CRC organoids 문화.

7. 받는 사람 마우스에 GFP 표시 된 CRC Organoids에 의해 전이의 발생

CRC GFP 표시 organoids (7 단계)를 사용 하 여 전이의 세대에 대 한 실험 절차는 그림 1C에 설명 되어 있습니다.

  1. 세포 현 탁 액에 GFP 표시 된 CRC organoids 해리, 기계적으로 살 균 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 그들을 수확 하 고 (단계 6.1) 위에서 설명한 대로 1.5 mL microtube에 그들을 전송 합니다.
  2. 1400 x g에서 3 분 동안 microtube 원심, 문화 매체를 제거 하 고 부드러운 두 드려서 PBS의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 해결 합니다.
  3. 1400 x g 에서 3 분 동안 microtube 원심 고 PBS를 제거 합니다.
  4. 오버레이 셀 펠 렛 튜브에서에 세포 분리 솔루션의 500 µ L와 부드러운 두 드려서 섞는다. (단계 6.4) 위에서 설명한 다음, 효소 부착 CRC organoids 해리를 실 온에서 10 분을 위한 혼합물 서를 둡니다.
  5. 1%의 추가 500 µ L로 세포 현 탁 액을 아주 부드럽게 플라스틱 약 (단계 6.5) 위에서 설명한 대로, 세포를 해리를 여러 번에 1.5 mL microtube FCS DMEM. 가혹한 pipetting으로 CRC organoids에서 단일 세포의 생성은 현저 하 게 세포 생존 능력을 감소 시킨다. 따라서, 세포의 질량 세포 현 탁 액에서 시각적으로 감지 여 남길 1.5 mL microtube에 pipetting 매우 부드럽게.
  6. 1400 x g 3 분 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
  7. CRC PDXs의 자발적 전이 마우스 모델을 설정할:
    1. 세포 현 탁 액 마우스 당 50% 인공 세포 외 매트릭스와 PBS의 50 µ L에서 5 x 105 셀을 포함 하 여 준비 합니다. 사용 하기 전에 얼음에 현 탁 액을 유지 합니다. 4.3 단계에서 표시 된 대로 암 세포를 세는 hemocytometer를 사용 합니다.
    2. 와 isoflurane 흡입 작은 동물 흡입 마 취 장치를 사용 하 여 마우스를 anesthetize 하 고 1.6 단계에서 표시 된 대로 70% 에탄올, 피부 소독.
    3. 실험실 벤치에 부정사 위치에 그 노 그 마우스를 놓습니다. 멸 균 핀셋으로 직장 점 막을 잡고 부드럽게 항문 그것을 꺼내. 다음, 즉시 주입 세포 현 탁 액 단계 7.7.1 주사기를 사용 하 여 마우스의 직장 submucosa에서에서 준비 (바늘 크기: 22 G). 정기적으로, 그룹 당 4-6 마우스는 결과 평가 하는 데 사용 됩니다.
  8. CRC PDXs의 실험적인 전이 모델을 설정할:
    1. CRC organoid 셀 서 스 펜 마우스 당 PBS의 50 µ L 4 x 104 의 세포 등을 준비 합니다. 사용 하기 전에 얼음에 현 탁 액을 유지 합니다. hemocytometer를 사용 하 여 암 세포 (단계 4.3) 계산에 대 한.
    2. 와 isoflurane 흡입 작은 동물 흡입 마 취 장치를 사용 하 여 마우스를 anesthetize 하 고 1.6 단계에서 표시 된 대로 70% 에탄올, 피부 소독.
    3. 실험실 벤치에 발생 하기 쉬운 위치에 마 취 노 그 마우스를 놓습니다. 왼쪽된 측면의 아래 부분에 작은 절 개를 만들고 조심 스럽게 멸 균가 위 핀셋을 사용 하 여 비장을 폭로 하는 복을 잘라. 멸 균 핀셋으로 비장에 연결 된 지방 조직 파악 한 다음 비장에 세포 현 탁 액 (위에서, 준비 단계 8.1)의 50 µ L를 천천히 주입 합니다. 세포 현 탁 액 비장에서 외부 유출 없이 적절 하 게 주입 될. 정기적으로, 그룹 당 4 마우스는 결과 평가 하는 데 사용 됩니다.
  9. 모든 마우스 따뜻한 패드에 수술 후 놓고 1.11 단계에서 설명한 대로 충분 한 의식 복원 될 때까지 sternal 휴식 위치에 유지 합니다. 쥐가 완전히 복구 하 고, 일단 자신의 집 새에 그들을 반환 합니다. 포식을 방지 하기 위해, 동일한 장에 비 운영 동물 사육을 허용 하지 않습니다.
  10. 봉합 누설에 대 한 확인 하 고 쥐가 살아, 수술 치료 그룹에서 다음 날 확인. 질병 및 측정 종양 크기, 캘리퍼스, 모든 마우스는 일주일에 한 번에 고용의 흔적에 대 한 마우스를 확인 하십시오.
  11. 주입 후 (최대 2.5 개월 기간)에 대 한 자발적 전이 실험 전이 (1 개월)을 감지 하는 쥐를 관찰 합니다.
  12. 마 취 및 지정된 일에 자 궁 경부 전위를 통해 쥐를 희생. 기본 종양과 간, 폐를 포함 하 여 다양 한 조직 해 부. 해 부 종양 및 장기 10 cm 배양 접시에 얼음 처럼 차가운 PBS의 5 mL에 놓고 얼음에 그들을 저장 합니다.
  13. 셀을 검출 GFP-긍정적인 CRC organoid, 해 부 조직 스테레오-형광 현미경으로 관찰 합니다. CCD 카메라와 함께 이미지를 수집 하 고 표준 이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여 준비.

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결과

주 대 장 선 암으로 알맞게 차별화 된 진단 TNM 분류, 단계 IIIa, 수술 후 화학요법 뒤와 76 년 오래 된 여성에서 수술로 절제 된 했다. 기본 CRC 셀 immunohistochemically carcinoembryonic 항 원, 기-67, 팬 cytokeratin 및 E-cadherin 긍정적인 스테인드. 절제 종양의 조각도 피하 콜론 PDX 모델 생성 노 그 쥐에 이식 했다. CRC organoid 셀이이 마우스에 피하 개발 했다 결 장 PDX에서 조직 문화에 대 한 다음 추출 되었다. CRC organoids 지속적으로 인공 세포 외 기질에 구절의 시리즈 중 다세포 클러스터를 형성 할 수 있었다. 우리가 높은 감도와 CRC organoid 셀의 비보에 탐지를 허용 하는 마우스 모델을 개발 하려고으로 종양 organoids 조직학 및 유전자 환자5,

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토론

CRC PDX 모델 기본 종양의 성장 연구에 널리 고용은, 비록이 모델 인지 종양 전이 조사에 적용 또한 되지 아직 되었습니다 완전히 해명 했습니다. 자연 스러운 전이 간, 다양 한 보고 콜론 PDX 모델4,10의 폐에서 거의 감지 했다. 높은 감도 가진 micrometastases를 감지, 우리는 GFP lentiviral 입자 PDX 파생 CRC organoids 그들의 orthotopic 받는 쥐로 정 맥 주사 이전에 시험에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 주의 우리 수 있었다이 방법은 CRC organoid 파생 된 micrometastases의 매우 민감한 탐지 수 보여 먼 장기에 자발적으로 그리고 실험적으로, 둘 다 형성.

프로토콜 내에서 중요 한 단계는 부드럽게 passaging 시리즈 동안 CRC organoids를 pipetting으로 인공 세포 외 매트릭스에 ...

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공개 사항

저자는 공개 관심의 잠재적인 충돌 있다.

감사의 글

이 일 준 텐도 대학 영 탐정 수상 (2013, 2014, 2015) 요, 공동 프로젝트 수상 (2013 및 2014) K. M.에 의해 지원 되었다 고 교육, 문화, 스포츠, 과학에서 과학 연구에 대 한 원조를 부여 하 고 기술, 일본 (Y. K.을 16 K 15625 및 16 K 15598 밀리에). 우리는 특히 유용한 토론 및 기술 지원에 대 한 부의 Coloproctological 수술 및 분자 병 리의 모든 구성원에 게 감사입니다. 우리 또한 orthotopic 이식 마우스 및 박사에 대 한 수술 절차에 관대 한 기술 지도 대 한 박사 히로유키 곤노 (하 마마 츠 대학 학교 의학) 및 박사 히데키 기타지마 (국제 대학 보건 및 복지)을 감사합니다. 에 대 한 기술적인 조언 수행 종양 organoid 문화 요시타카 마 (치 바 암 센터)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) 마우스The Central Institute for Experimental Animals, Kanagawa, Japan번식 6주 된 수컷 마우스를 무균 및 특정 병원체가 없는 조건에서
상처 클립
2× 10mm		Natsume 제조, 사용 전 일본#C-21-S오토 클레이브
해밀턴 주사기
바늘 크기 : 22 게이지		도쿄 과학, 일본70 % 알코올 및 멸균 PBS로 소독합니다.
6웰 플레이트BMBio#92006
12웰 플레이트BMBio#92412
15ml 원뿔형 튜브스미토노 베이클라이트MS-57150
50ml 원뿔형 튜브스미토모 베이클라이트MS-57500
마이크로튜브Eppendorf#0030120086사용 전 오토클레이브
혈구계Erma#03-202-1
40&뮤; m cell strainerCorning#352340
Matrigel 기저막 매트릭스Corning#354234-20°C.
에서 aliqupts 저장 사용할 때까지 얼음 위에 놓으십시오
Collagenase type 1Sigma#C1030150 mg/ml collagenase type1 in 1× PBS입니다. -20°C에서 aliqupts를 보관하십시오. 최대 1년 동안 C
AccutaseInnovate Cell Technologies#5V2623A4°C에 보관하십시오.
GlutaMAX&trade를 가진 DMEM/F-12;Gibco#105650184°C에 저장. 37°C에 따뜻함; C 사용 전
Cell banker 1plusZENOAQ#6284°C에서 보관. 1개월 이내
사용 PenicillinGibco#151401224°C에서 보관. 1개월 이내
사용 스트렙토마이신Gibco#151401224°C에서 보관. 1개월 이내 사용
hEGFPEPROTECH#AF-100-15-20°C에서 보관. 사용
과 동시에 중간에 매체 추가Y27632, ROCK 억제제Wako#253-00591를 사용하는 것과 같은 날
에 매체에 추가
g/ml 스트렙토마이신.
4°C에 보관하십시오. 1개월 이내에 사용하십시오.
CRC 오가노이드 배양 배지
with 1% or 5% FCS		DMEM/F-12 with GlutaMAX™ 보충 (Gibco #10565018) 1% 또는 5% FCS, 100 U/ml 페니실린, 100 µ g/ml 스트렙토마이신, 2 ng/ml hEGF 및 10 &마이크로; M Y27632, ROCK 억제제.
4°C에 보관하십시오. 1개월 이내에 사용하십시오.
FuGENE 6 형질주입 리젠트Roche11814 443001
Minisart 0.45 µ m 필터Sartorius stedim17598-K
5ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브Beckman Coulter326819
PRRL-GFP 벡터Robert A. Weinberg
선물 pCMV-VSV-GRobert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvprRobert A. Weinberg
SW55Ti 스윙 버킷 로터Beckman Coulter
a Zeiss Axioplan 2 실체 형광 현미경Zeiss
-20°C에 저장. GlutaMAX&trade와 함께 배양 배지 Gibco DMEM/F-12; 5% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 &마이크로로 보충된 보충제;박사의박사의 선물박사의 선물

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