GFP Lentivirus 불리고 Organoids 환자 파생 결 장 종양에서 경작에 의해 생성 된 Micrometastases의 고감도 검출

요약

있도록 매우 민감한 탐지 목표 인간의 대 장 암 (CRC) 세포 조직 정착, 우리 여기 PDX 파생 CRC organoid 셀에 녹색 형광 단백질 (GFP) lentiviral 입자의 효율적인 변환에 대 한 프로토콜을 표시 스테레오-형광 현미경 관찰 받는 쥐로 그들의 주입에의 사전

초록

인간의 대 장 암 (CRC) 치료에 현재 진보에도 불구 하 고 몇 가지 근본적인 치료는 CRC의 늦은 단계에 대 한 효과적입니다. 전 임상 모델으로 오래 된 인간의 암 세포 선 및 종양 모델 개발 되었습니다 많은 유전자 변형 마우스를 사용 하 여 종양이 종이 식 마우스 모델이 임상 문제를 극복 한다 그들은 부분적으로 인간의 carcinomas의 기능을 모방 하지만 종종 내 습 및 전이 포함 하 여 인간 악성의 주요 측면 정리를 하지. 따라서, 더 나은 인간 CRC에 악성 진행을 대표 하는 대체 모델은 오랫동안 기다려온 되었습니다.

우리는 여기 작은 CRC 조각 수술 환자에서 해 부의 피하 주입에 의해 종양 환자 파생 xenografts (PDXs)의 생성을 보여줍니다. 콜론 PDXs 개발 하 고 histopathologically 환자에 CRC를 닮은. 그러나, 몇 가지 자연 micrometastases는 PDX 모델에 영향을 받는 먼 기관의 기존 횡단면에서 감지. 먼 장기에 전이성 보급의 탐지를 촉진 하기 위하여 우리는 문화에서 콜론 PDXs에서 종양 organoid 세포를 추출 하 고 GFP lentivirus 매우 immunodeficient 끄 덕/시-scid IL2Rγ에 주입 하기 전에 그들을 감염^null (노 그) 쥐. Orthotopically 주입 PDX 파생 CRC organoid 세포 지속적으로 양식 기본 종양 긍정적인 GFP에 대 한 받는 사람 쥐에서. 또한, 자발적으로 식민지 GFP 표현 특히 형광 현미경 검사 법에 의해 이러한 쥐의 폐에서 감지 micrometastatic 개발. 또한, CRC organoids의 intrasplenic 주입 자주 간 식민지를 생성합니다. 함께 찍은, 이러한 결과 다단계 프로세스 동안 시각적으로 감지 되도록 PDX 파생 CRC organoid 셀 GFP 표시 되 나 침공 전이 캐스케이드 나타냅니다. 설명된 프로토콜 GFP lentiviral 입자에 의해 불리고 해당 CRC organoid 셀의 3D 문화와 인간의 CRC의 PDXs의 설립을 포함 한다.

서론

대 장 암 (CRC)은 암 사망 세계¹의 두 번째 주요 원인. 고급 단계 질병을 가진 환자의 일반적인 치료에 부족 한 응답 CRCs를 근본적으로 치료 하는 시도의 무효를 나타냅니다. 더 효과적인 치료 접근을 개발 하기 위해 Crc의 특성을 모방 하는 암의 다양 한 전 임상 마우스 모델 설립 되었습니다. 다양 한 CRC 셀 라인 생성 종양 xenografts 그들의 편 및 조작의 용이성 때문에 널리 사용 되어 왔습니다. 그러나, 암 세포 선의 장기 문화는 다양 한 독특한 세포 인구 꽤 특정 문화 조건 하에서 증식을 함으로써 신뢰할 수 없는 결과 및 전 임상 약에서 중요 한 제한의 결과로 종종 발생 개발입니다.

되지 않고 교양 생체 외에서, 종양 환자 파생 xenografts (PDXs) 또한 인간의 CRC 조직 수술 환자^2,,34에서 해 부의 동물 모델에 이식 하 여 생성 된. PDXs는 업과 주요 histopathological 기능으로 널리 인식 되 고 유전 변경 원래에서 파생 된 환자의 종양에 존재. 또한, 종양 환....

프로토콜

환자 서 면된 동의 제공 하 고 프로젝트 준 텐도 대학의 학부의 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 마우스 실험 동물 연구 윤리 위원회의 준 텐도 학부의에 의해 또한 승인 되었다.

1. Immunodeficient 마우스에 CRC PDXs의 설립

CRC PDXs (1 단계) 구축을 위한 실험적인 절차 그림 1A에 설명 되어 있습니다.

1. 환자에서 종양의 외과 절제술 후 즉시 기본 CRC 티슈를 준비 합니다.
2. 워시 차가운 멸 균 인산 염의 30 mL에 여러 번 부드러운 동요에 의해 기본 CRC 조직 50 mL 원뿔 튜브에 식 염 수 (PBS)를 버퍼링 되 고 얼음에 그것을 유지.
3. 조직에 멸 균 핀셋을 사용 하 여 10 cm 배양 접시, 회 저 성 영역을 광범위 하 게 가능한 멸 균가 위를 사용 하 여 제거 놓고 작은 조각 (크기에서 5 m m³ x 5 x 5) 고체 종양 조직을 잘라 살 균 면도날을 사용 하 여.
   참고: 회 저 성 영역은 종종 하얀, 부드럽고 주변 지역 보다 더 어렵다면입니다.
4. 6-잘 접시에 얼음 처럼 차가운 살 균 PBS의 2 개....

결과

주 대 장 선 암으로 알맞게 차별화 된 진단 TNM 분류, 단계 IIIa, 수술 후 화학요법 뒤와 76 년 오래 된 여성에서 수술로 절제 된 했다. 기본 CRC 셀 immunohistochemically carcinoembryonic 항 원, 기-67, 팬 cytokeratin 및 E-cadherin 긍정적인 스테인드. 절제 종양의 조각도 피하 콜론 PDX 모델 생성 노 그 쥐에 이식 했다. CRC organoid 셀이이 마우스에 피하 개발 했다 결 장 PDX에서 조직 문화에 대 한 다음 추출 되었다. CRC organoids 지속적으로 인공 세포 외 기질에 구절의 시리즈 중 다세포 클러스터를 형성 할 수 있었다. 우리가 높은 감도와 CRC organoid 셀의 비보에 탐지를 허용 하는 마우스 모델을 개발 하려고으로 종양 organoids 조직학 및 유전자 환자^5,

토론

CRC PDX 모델 기본 종양의 성장 연구에 널리 고용은, 비록이 모델 인지 종양 전이 조사에 적용 또한 되지 아직 되었습니다 완전히 해명 했습니다. 자연 스러운 전이 간, 다양 한 보고 콜론 PDX 모델^4,10의 폐에서 거의 감지 했다. 높은 감도 가진 micrometastases를 감지, 우리는 GFP lentiviral 입자 PDX 파생 CRC organoids 그들의 orthotopic 받는 쥐로 정 맥 주사 이전에 시험에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 주의 우리 수 있었다이 방법은 CRC organoid 파생 된 micrometastases의 매우 민감한 탐지 수 보여 먼 장기에 자발적으로 그리고 실험적으로, 둘 다 형성.

프로토콜 내에서 중요 한 단계는 부드럽게 passaging 시리즈 동안 CRC organoids를 pipetting으로 인공 세포 외 매트릭스에 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) 마우스	The Central Institute for Experimental Animals, Kanagawa, Japan		번식 6주 된 수컷 마우스를 무균 및 특정 병원체가 없는 조건에서
상처 클립 2× 10mm	Natsume 제조, 사용 전 일본	#C-21-S	오토 클레이브
해밀턴 주사기 바늘 크기 : 22 게이지	도쿄 과학, 일본		70 % 알코올 및 멸균 PBS로 소독합니다.
6웰 플레이트	BMBio	#92006
12웰 플레이트	BMBio	#92412
15ml 원뿔형 튜브	스미토노 베이클라이트	MS-57150
50ml 원뿔형 튜브	스미토모 베이클라이트	MS-57500
마이크로튜브	Eppendorf	#0030120086	사용 전 오토클레이브
혈구계	Erma	#03-202-1
40&뮤; m cell strainer	Corning	#352340
Matrigel 기저막 매트릭스	Corning	#354234	-20°C. 에서 aliqupts 저장 사용할 때까지 얼음 위에 놓으십시오
Collagenase type 1	Sigma	#C1030	150 mg/ml collagenase type1 in 1× PBS입니다. -20°C에서 aliqupts를 보관하십시오. 최대 1년 동안 C
Accutase	Innovate Cell Technologies	#5V2623A	4°C에 보관하십시오.
GlutaMAX&trade를 가진 DMEM/F-12;	Gibco	#10565018	4°C에 저장. 37°C에 따뜻함; C 사용 전
Cell banker 1plus	ZENOAQ	#628	4°C에서 보관. 1개월 이내
사용 Penicillin	Gibco	#15140122	4°C에서 보관. 1개월 이내
사용 스트렙토마이신	Gibco	#15140122	4°C에서 보관. 1개월 이내 사용
hEGF	PEPROTECH	#AF-100-15	-20°C에서 보관. 사용
과 동시에 중간에 매체 추가Y27632, ROCK 억제제	Wako	#253-00591	를 사용하는 것과 같은 날 에 매체에 추가
			g/ml 스트렙토마이신. 4°C에 보관하십시오. 1개월 이내에 사용하십시오.
CRC 오가노이드 배양 배지 with 1% or 5% FCS			DMEM/F-12 with GlutaMAX™ 보충 (Gibco #10565018) 1% 또는 5% FCS, 100 U/ml 페니실린, 100 µ g/ml 스트렙토마이신, 2 ng/ml hEGF 및 10 &마이크로; M Y27632, ROCK 억제제. 4°C에 보관하십시오. 1개월 이내에 사용하십시오.
FuGENE 6 형질주입 리젠트	Roche	11814 443001
Minisart 0.45 µ m 필터	Sartorius stedim	17598-K
5ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	Beckman Coulter	326819
PRRL-GFP 벡터	Robert A. Weinberg
선물 pCMV-VSV-G	Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr	Robert A. Weinberg
SW55Ti 스윙 버킷 로터	Beckman Coulter
a Zeiss Axioplan 2 실체 형광 현미경	Zeiss