척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

요약

Intraspinal 주입 recombinase 종속 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV)의 척수에서 모든 유전자 이라는 셀 형식을 조작 하 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 transduce 요 추 척수의 등 쪽 뿔에 신경 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조작된 신경 하위의 기능 심문 수 있습니다.

초록

척추 신경 부분 모집단의 선택적 조작 주로 두 가지 방법으로 달성 되었다: 1) Intersectional 유전학, 그것에 의하여 이중 또는 삼중 유전자 변형 쥐 기자 또는 이펙터의 선택적 식 달성 하기 위해 생성 됩니다 원하는 척추 인구에서 유전자 (예를 들어, Rosa26 소재 시에서). Cre 종속 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV); 2) intraspinal 주입 여기 선택의 기자 또는 이펙터 유전자에 대 한 코딩 Cre 종속 AAV 벡터는 Cre recombinase 원하는 신경 부분 모집단에 표현 하는 쥐의 척수에 주입 됩니다. 이 프로토콜 Cre 종속 rAAV 벡터를 생성 하는 방법을 설명 하 고 어떻게 신경 요 추 척수의 등 쪽 뿔에 transduce rAAVs와 L3-L5 세그먼트. 요 추 척추 세그먼트 L3-L5는 hindlimbs에서 감각 정보를 전송 하는 그 주변 감각 뉴런에 의해 innervated 있습니다, 자연 스러운 행동 및 감각 테스트 사출 쪽에 동측 hindlimb에 적용에 대 한 응답 수 있습니다. 감각 처리에 조작된 신경의 기능을 검사 하기 위해 분석. 우리는이 기술을 사용 하 여 유전자를 분석 하는 방법을의 예 정의 척추 신경의 하위 집합을 제공 합니다. Cre 유전자 변형 쥐 클래식 리포터 transgene 마우스 유도 식에 비해 바이러스 중재 transgene 식의 주요 장점은 다음과 같습니다: 1) 다른 Cre 종속 rAAVs 다양 한 기자 또는 effector 단백질 인코딩 될 수 있습니다 주입 한 Cre 유전자 변형 줄, 따라서 여러 여러 유전자 변형 마우스 라인을 만들 필요가 극복 했다. 2) intraspinal 주입 조작 Cre 표현 셀 주사 사이트를 주입 후 시간을 제한합니다. 주요 불리는: 1) 리포터 유전자 발현 rAAVs에서 더 많은 변수 이다. 2) 수술의 척추 신경 transduce 필요 합니다. 두 가지 방법 중 어떤은 더 적절 한 해결을 신경 인구 및 연구 질문에 따라 달라 집니다.

서론

등 쪽 척수 주변 신체와 뇌 사이의 정보 교환을 위해 근본적 이다. 열, 감기, 같은 감각 자극, 만지거나 유해 자극 척수의 등 쪽 뿔의 신경 세포에이 정보를 전달 전문된 주변 신경에 의해 감지 됩니다. 여기, 억제 및 흥분 성의 수의 복잡 한 네트워크 변조 하 고 결국 척추 프로젝션 뉴런 supraspinal 통해 릴레이 감각 정보 사이트^1,2. 척추에 의해 실시 계산 인터-프로젝션 뉴런 감각 정보, 정보 억제 또는 릴레이 강도에 따라서 결정 문 및. 변화 억제와 흥분, 밸런스 변경된 등 감각 자극의 통합에 과민 증 또는 용어인 (일반적으로 비-고통 스러운 자극 후 고통 스러운 감각) 등 감각 장애를 일으킬 수 있습니다. 이러한 변화는 다양 한 만성 통증의 근본 원인을 상태^3,4수 생각 된다. 따라서, 척추 회로 감각 처리에 높은 중요성의 따라서 생물체의 환경 및 자기 인식. 최근 출현 및 분자, 유전자의 조합 및 유전으로 확인 된 척추 신경 부분 모집단의 정확한 조작 하도록 하는 수술 기법, 과학자 들은 이제 이해 하기 시작 기본 척추 회로 고유 감각 modalities의 처리를 담당 합니다.

야생-타입 또는 유전자 변형 쥐에 rAAV의 intraspinal 주입 크게 기여한 조작, 분석, 및 척추 신경^5,6,7, 의 특정 하위 집합의 기능 이해 ^{8 , 9 , 10 , 11}.이 기술은 마커 단백질의 배달을 허용 (GFP 등 / GFP 융해 단백질), 기자 단백질 (예: GCaMP), 또는 effector 단백질 (예: 세균 독 소, channelrhodopsin, 또는 pharmacogenetic 수용 체)는 공간 척추 신경에 제한 된 방식 으로입니다. Cre recombinase 척추 신경의 특정 하위 집합에서을 표현 하는 유전자 변형 쥐로 Cre 종속 rAAVs의 로컬 주입 각각 신경 인구의 특정 분석을 허용 한다. 우리는 라벨, ablate, 억제 또는 척추 glycinergic 뉴런을 보여주는 그들은 척추 게이트 통증 제어의 필수적인 부분입니다 및 전송⁷을 렵 게 활성화에이 기술을 채용 했습니다. 이 실험에서 intraspinal 주입 Cre 종속 rAAV GlyT2::Cre 쥐 요 추 척수 신경 세포 glycinergic의 선택적 조작 사용할 수 있습니다. 따라서, glycinergic 신경 동물의 생존에 대 한 중요 한 포함 하는 supraspinal 회로의 동시 조작 피할 수 있습니다.

RAAVs의 intraspinal 주사 주입의 사이트에 감염 제한, 하는 동안 로컬 뉴런에서 뿐만 아니라 axonal 예측을 통해 사출 사이트에 연결 하는 신경 세포에 바이러스 성 변환 발생할 수 있습니다. 후자는 자주 사용 한다 특정 핵은 뇌에서 신경 입력을 제공 하는 추적 CNS 영역에. 그러나 Axonal 예측의 감염,, 수도 있습니다 혼동 요인의 정의 된 인구는 특정 사이트에서 공부 한다. 이러한 문제를 해결 하기 위해 우리가 최근에 AAV serotypes serotypes 및 발기인 최소화 또는 최대화 역행 변환 하는 데 사용할 수 있는 식별 식 카세트의 포괄적인 분석을 실시 했습니다. 척추 회로에서이 특정 연구의 맥락에서 우리 retrogradely transduce 지 루트 신경 절 (DRG), rostral ventromedial 모 수 (호), 및 ^{somatosensory 피 질 뉴런에 다른 serotypes 및 발기인의 능력 분석 12}.이 프로토콜에서 설명 하는 기술을 사용할 수 있습니다 따라서 척추 신경 주사 사이트에서 분석 하거나 투영 신경 척수의 삽입 된 사이트에 입력을 제공 하는 분석. 여기에 설명 된 프로토콜에서 요 추 척수의 왼쪽에 rAAV의 3 개의 주사 3 허리 세그먼트 (L3-L5)에서 뉴런의 변환 수 있도록 수행 됩니다. L3-L5 세그먼트는 사출 사이트에 hindlimb 동측에서 감각 입력의 대부분을 받습니다. 시연 L3-L5 유전자 레이블이 뉴런의 기능 조작 이다 강력한 행동 변화를 연상 하기에 충분 따라서 유전자 레이블이 신경 하위의 회로 기능에 대 한 기능 증거를 제공 합니다.

프로토콜

모든 동물 실험 스위스 cantonal 수의 사무실 (취리히)에 의해 승인 했다 고 따라와 모든 관련 규제 기관 지침 준수에 있다.

참고: 각각의 제조 업체 및 공급 업체와 함께 모든 재료는 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.

1. 생성 Cre 종속 AAV 벡터의

참고: 다른 발기인 Cre 종속 벡터의 다양 한 구입하실 수 있습니다 ( 테이블의 자료를 참조) 또는, 원하는 식 구조를 사용할 수 없는 경우 기존 AAV 구문을 수정 하 여 생성할 수 있습니다. 참고, 발기인 및 serotype 바이러스 성 변환의 확산에 영향을 미칠 수 있습니다 ( ¹²참조). 이 프로토콜의 첫 번째 부분은 간단히 설명 합니다 이득에 대 한 적합 한 두 개의 다른 Cre 종속 AAV 벡터의 생성 및 손실의 기능 실험, 각각.

1. Pharmacogenetic 활성화 (기능의 이익)
   1. PAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq) 주문-mCherry ( 재료의 표참조) 디자이너 약물 (DREADD)에 의해 독점적으로 활성화 디자이너 수용 체에 대 한-중재 활성화.
   2. 세균성 찌 르 기 문화를 받으면 파운드 플레이트 (세균 학년 agar Luria Bertani 액체 매체에서 해산)에 박테리아에 밖으로 행진 적절 한 항생제와 보충. 37 ° C에서 밤새 incubate 고 날에 단 하나 식민지를 선택 합니다.
      참고: 포함 된 AAV 벡터 게놈 수 안정 및 재조합 바이러스 거꾸로 터미널 내 특히 바이러스 성 게놈의 반복 (ITR), 플라스 미드는 대장균에 증폭 하는 동안 발생할 수 있습니다. 같은 변종 recA-결핍/억압을 사용 하는 것이 좋습니다 MDS42 또는 Stbl3을 피하기 위해 재조합 AAV 게놈을 포함 하는 플라스 미드 내.
   3. 박테리아는 선택의 공급 업체에 의해 주어진 지침에 따라 증폭 DNA-맥시-키트 상용 DNA-맥시-키트와 함께 높은 품질 플라스 미드 DNA를 준비 하 고 (예를 들어, 테이블의 자료를 참조). 무결성 및 플라스 미드 DNA의 약 수의 제한 다이제스트 통해 플라스 미드 DNA의 id를 확인 하 여 플라스 미드 DNA 준비의 품질 관리를 수행 합니다.
      참고: 금지 endonuclease는 ITRs 내의 SmaI에 대 한 인식 사이트 있습니다. ITRs의 무결성을 확인 하는 품질 관리에 SmaI 다이제스트를 포함 합니다.
   4. 고품질 rAAV를 생성 하기 위하여 바이러스 성 벡터 핵심 시설에는 DNA를 보냅니다.
      참고: 높은 titer 고품질 바이러스 preps 고기 바이러스 준비에 오염으로 인 한 혼동을 피하에 대 한 중요 한 있습니다. 따라서 AAV 생산은 실험실에서 잘 설립 하지 않는 한 설립된 벡터 핵심 시설에서 생산 하는 선택의 rAAV를 갖는 것이 좋습니다.
2. 절제 (기능의 상실)
   참고: 세균성 독 소 또는 독 소 수용 체는 세포 제거 또는 신경 입을 중재에 사용할 수 있습니다. 우리는 생성 표현 디프테리아 독 소 조각 A (DTA)에 pAAV.EF1α.flex.DTA는 Cre 종속.
   1. Cre 종속 바이러스 성 벡터를 생성 하려면 선택 (예를 들어, pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP) 적당 한 발기인 Cre 종속 벡터. 그들의 돌출부 (참조 양 외 에 AscI 및 NheI 또는 호환 금지 endonuclease 인식을 포함 한 뇌관으로 연쇄 반응에 의해 선택 (예를 들어, DTA)의 코딩 순서를 증폭 ⁷)
   2. 표준 분자 생물학 기법을 사용 하 여, 금지 다이제스트 DNA 벡터의 수행 (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) PCR 증폭의 금지 endonucleases AscI 및 NheI로 (NheI-DTA-AscI) 삽입. 순화 단편 선
   3. 적합 한 박테리아에 결 찰 반응의 선택, 유능한 박테리아의 공급 업체에 의해 주어진 프로토콜에 따라 변환 하 고 파운드 격판덮개에 박테리아를 접시. RecA-결핍/억압을 사용 하 여, MDS42 또는 Stbl3, 같은 복제에 대 한 긴장과 플라스 미드 DNA의 후속 증폭.
   4. 변환 후에 일에 클론을 선택 하 고 파운드 매체로는 적절 한 항생제 37 ° c.에 보충에 접종 다음 날, 교양된 박테리아에서 플라스 미드 DNA를 추출 합니다. 성공적인 금지 다이제스트에 의해 복제 및 추출 된 플라스 미드 DNA의 시퀀싱을 확인 합니다.
   5. 높은 품질, 세균성 플라스 미드 DNA 증폭 (단계 1.1.3 참조). 증폭된 DNA 바이러스 생산에 대 한 바이러스 성 벡터 핵심 시설에 보내기.

2입니다. 척추 셀의 변환

1. 바이러스 솔루션의 준비
   주의: 바이러스 감염 시 약 이며, 관련 지침에 따라 처리 합니다. 대부분의 경우, rAAVs biosafety 수준 1 (BSL1)에서 처리할 수 있습니다.
   1. 주입의 날, 얼음에 원하는 순화 된 바이러스의 주식 약 수를 녹 인 다 고 주사 전에 직접 얼음에. 이러한 바이러스의 효과적인 titer 감소 시킬 것 이다 동결-해 동 주기 일 반복된, 하지 마십시오.
      참고: 필요한 경우 aliquot defrosted 바이러스 수 보관 4 ° C에서 최대 3 일 동안.
   2. 살 균 0.9%의 바이러스 입자를 희석 NaCl 또는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS).
      참고: 적절 한 titer 그리고 실험 목적에 따라 실험적으로 결정 되어야 한다. 좋은 총 바이러스 부하로 시작 3 x 10⁹ 게놈 복사본 (3.33x10¹² GC/mL, 3 x 300 nL 주사) 이다. 초과 하 고로 모 세관을 로드 하는 동안 일부 손실 계정, 바이러스 솔루션의 약 2.5 µ L 각 마우스에 대 한 필요 하 게 됩니다.
2. Intraspinal 주사에 대 한 Micropipettes의 준비
   1. '당겨' 얇은 유리 모 세관 (외부 직경 1 m m) ~5.5 m m 긴 만들려고 micropipette 끌어당기는 사람에 얕은 칼. 3.0 m m 히터 필 라 멘 트 및 프로그램 00의 설정을 사용 하 여 표 1에서 적응 하는 P(A)와.
      참고: 철수 할 수 있습니다 사전에. 가져온된 모 세관 나중는 micropipette 방해할 수 있는 먼지를 피하기 위해 클레이 모델링에 닫히는 콘테이너에서 저장 되어야 한다. Micropipettes의 압력가 마로 소독 필요 하지 않습니다.
   2. 가져온 모 세관 칼 여 25-35 μ m의 내부 직경을 가진 팁을 만드는 약 4.5 ~ 5 mm의 길이를 laminectomy 집게와 클립. 마이크로 미터 규모와 현미경을 사용 하 여, 얼마나 큰 개방 해야 합니다, 또는 모든 micropipette 측정에 대 한 느낌을 여러 micropipettes의 내부 직경을 측정 합니다.
      참고: 작은 팁; 막힘으로 이어질 수 있습니다. 큰 팁은 조직 손상과 척수에 침투 하는 어려움이 발생할 수 있습니다.
3. 수술 설치 및 준비
   1. 장비는 깨끗 하 고를 사용할 수 확인 하십시오. 70% 에탄올으로 닦아 하 여 작업 영역을 소독 하 고 소독 압력가 마로 소독 하거나 그들을 소독 하 여 도구. 어떤 살 균 제 사용 되는 바이러스 성 벡터를 해칠 것 이라고 microliter 주사기에 두지 마십시오.
4. 마 취와 수술에 대 한 동물의 준비
   참고: 수술의 전체 기간이 60-90 분입니다.
   1. 수술 절차를 촉진 하기 위하여 6를 10 주 된 쥐를 선택 합니다.
      참고: 실험 설계에 필요한 경우 젊은 이상 동물의 주입 가능 하다. 어떤 긴장 든 지 및 남녀 원칙적으로 사용할 수 있습니다 하지만 동일한 배경 스트레인 (예를 들어, C57BL/6J)를 사용 하 여 다른 유전자 변형 마우스 라인 사이의 행동의 비교. 성별 차이 또는 조사, 분석 남성과 여성 별도 그룹에.
   2. ~ 5 %isoflurane 사용 하 여 마 취를 유도. 동물 stereotaxic 프레임 열 매트에 놓고 1-2.5 %isoflurane 마 취를 유지 (공기 흐름 속도 900 mL/min). 수술 내내 호흡 속도 모니터링 합니다.
   3. 수술 중 각 막 건조 방지 하기 위해 윤활제 눈 연 고를 적용 합니다.
   4. 동물의 뒤를 면도 하 고 젖은 티슈로 조심 스럽게 머리를 제거 합니다. 요오드 솔루션 면도 피부를 소독 하 고 피부 건조를 허용 합니다.
   5. 진통 치료 (예, 0.1-0.2 mg/kg buprenorphine 피하).
5. 요 추 척수 수준에서 척추 칼럼의 노출
   참고: 때문에 척수와 척추 칼럼의 차동 개발, 각 수준을 정렬 되지 않습니다, 하지만 요 추 척수 세그먼트 L4 T13 흉부 척추와 동일한 수준에.
   1. 따라 척추 열 palpating 여 가장 꼬리 리브 쌍을 찾습니다. 메스를 사용 하 여, 가장 꼬리 리브 쌍에 그냥 rostral에서 시작 하는 피부에 1.5-2.5 c m 세로 컷을 확인 합니다.
   2. 집게와 함께 피부를 들어올리고가 위로 기본 근육에서 분리 합니다. 수술을 통해 노출 된 조직 촉촉한 유지 살 균 0.9 %NaCl.
   3. 좋은 집게 및 작은 위를 사용 하, 정중 선 옆 바로 다음, 얇은 막 층으로 절 개 하 고 spinous 프로세스에서 그것을 잘라. 기본 paraspinous 근육 별개 이지만 spinous 프로세스에 연결 된.
6. 척추 요 추 척수 수준에서의 식별
   참고: 일단 척추 열 노출 심근 인 대 및 등 spinous 프로세스 표시 되어야 합니다. 여러 가지 해부학 적 랜드마크 대상 (그림 1B)에 올바른 척추를 식별 도움이 됩니다.
   1. 다시 장 골도 머리 폭로 꼬리 쪽으로 피부를 당겨. 동일한 수준에서 보이는 심근 인 대의 가장 꼬리 쌍 L6 spinous 프로세스에 합류 했다. Rostral 방향을 식별 관심의 척추에 꼬리에서 거꾸로 계산.
   2. 따라 척추 열 만져. 가장 꼬리 리브 쌍 T13 척추를 그냥 rostral 있으며 엉덩이 수준에서 골반 뼈 L6 척추의 수준 이다.
   3. 척추 칼럼의 측면을 따라 힘 줄 백인 이며 가장 중간에 자리를 찾습니다. T13 척추는 그냥 rostral 있습니다. 요 추 척추 세그먼트 L4이이 척추 내에 위치한 이다.
7. 척추 및 요 추 척수의 노출 고정
   1. 올리고 조직 stereotaxic 프레임의 척추 클램프 상승의 쿠션에 동물을 놓습니다.
   2. 호흡으로 인해 척추 칼럼의 움직임을 피하기 위해 대상 척추 수정. 이 목표에 대 한 정렬 대상 척추에 인접 한 클램프, 위치에 있는 한 클램프를 수정 누르고 척추 칼럼 Adson 집게와 두 번째 클램프를 고정 시키는 동안.
      참고: 열 주입 평면에 수직 이어야 하며 단단히 고정 위에서 압력에 따라 이동 하지 않습니다. 필요한 경우, 클램프의 두 번째 쌍 척추 열을 해결할 수 있습니다. 이 경우 대상 척추에 인접 한 두 척추에 클램프의 두 쌍을 해결 하기 위해 유용 합니다.
   3. 관심의 척추 위에 paraspinous 근육을 제거 합니다. 메스를 사용 하 여 병렬 절 개 척추 열에 평행한 힘 줄에 그냥 중간으로 수직 절 개 rostral와 꼬리 하 게 대상 척추. 수 너무 깊이 잘라 하지 않도록 주의 하십시오. 눈물/컷 멀리 rongeurs를 사용 하 여 근육입니다. 하는 척추 또는 척추 공간에서 경질 위에 남아 있는 조직을 제거 겸 자 필요에 따라 사용 합니다.
   4. 척추 공간에서 등 쪽 혈관 척수의 중간 선 표시 표시 되어야 합니다. 일방적인 주입 부분 laminectomy 척추의 대상 쪽의 중간에 구멍을 시추에 의해 수행. 0.5 m m 원형 커터 장치 드릴링 좋은 치과 사용 하 고 척수를 접근할 때 특히 신중 하 게 드릴. 척수를 노출 26 G 경사진된 바늘으로 모든 나머지 뼈 파편을 제거 합니다.
   5. 26 G 경사진된 바늘을 사용 하 여, 드릴된 구멍, 그리고 rostral와 대상 척추, 등 쪽 혈관에 모두 약 200 µ m 옆에 꼬리 척추 공간 경질 구멍. 척수 구멍에서 이스케이프 해야 하 고 척수는 약간 밖으로 돌출 한다.
8. 분사 주사기의 준비
   참고: 주입 주사기 준비 되어야 한다 주입의 시작의 앞에 즉시 먼지 입자는 micropipette 막힘의 위험을 줄이기 위해.
   1. 이동식 바늘 압축 피팅 키트를 사용 하 여 microliter 주사기에 유리 모 세관을 탑재 합니다. 단단하고 안전한 적합을 보장 하기 위해 단단히 너트를 고정 시킵니다.
   2. 멸 균 증류수와 microliter 주사기와 플런저와 함께 밖으로 그것을 눌러 시작.
      참고: 거기는 너무 많은 저항 물 팁에서 쉽게 오지 않는다는 micropipette 가능성이 차단 되 고 교환 되어야 한다.
   3. 전자 제어 microinjector에 연결 된 micromanipulator에 주사기를 탑재 합니다. 수는 micropipette와 아무것도 만지지 않도록 주의 하십시오.
   4. microinjector을 사용 하 여, 물과 바이러스 사이의 거품을 생성 하는 공기의 약 1 µ L를 그립니다.
   5. 파라핀 필름의 조각에 바이러스 솔루션의 2.5 µ L 드롭릿 장소 신중 하 게는 micropipette 팁 stereotaxic 프레임을 사용 하 여 작은 물방울에 이동한 그것을 세우. 다음 신중 하 게 보도 분배까지 바이러스 솔루션의 비트는 끝에 나온다.
   6. 주사기를 철회 하 고, 펜을 사용 하 여, 규모와 micropipette 표시 하 고 바이러스 솔루션;의 수준 이 프로그램으로 주입 진행 여부의 모니터링을 촉진 한다.
9. Intraspinal 주사
   1. 경질에 구멍 중 하나 위에 micropipette의 끝을 이동 하 고 아래로 약간의 덴트 경질에 기록 될 때까지. 척추 등 혼을 주입을 대상으로 조직의 기계적 안정화 수 있도록 500 µ m 단위로 100 µ m 연속 (1 mm/s 속도) 및 최대 다음 200 µ m 아래로 이동 합니다.
      참고: 팁의 마지막 깊이 300 µ m를이 경우에 있지만 대상 지역에 따라 적용할 수 있습니다.
      1. 조직 침투에 저항 하는 경우는 micropipette 경질 잡기 될 수도 있습니다. 이 경우에 철회 하 고 눕는 구멍, 또는 다시 사용 하 여 바늘 침투 시도 반복 하기 전에 경질을 제대로 구멍을 약간 이동 합니다.
   2. 300의 대상 주입 볼륨 펌프 프로그램 주입 하려면 50 nL/min의 시작 버튼을 누르면 사출 속도로 nL.
   3. 주입 완료 여부 바이러스 수준 떨어졌다 볼을 천천히 주사기를 제거 하기 전에 equilibrate에 압력을 허용 하는 추가 3 분을 위한 장소에는 micropipette를 두고 규모를 확인 합니다.
   4. 2.9.1.-2.9.3 단계를 반복 합니다. 다른 두 개의 사출 사이트에 대 한.
10. 봉합 및 복구
    1. 척추 클램프 및 마우스 아래 쿠션을 제거 합니다.
    2. 레이어 비 흡수 봉합 흡수 봉합 표면 조직 층과 피부를 봉합 중단된 stiches에에서 상처를 닫습니다. Sutured 상처에 요오드 소독 제를 적용 합니다.
    3. 마 취 종료 되 고 그것은 그것의 집 감 금에 반환 하기 전에 복구 될 때까지 열 매트에 동물을 두고.
11. 수술 후 관리
    1. 수술 당일, 다음날, 그리고 매 2-3 일 후에 동물의 상태를 모니터링 합니다. 동물 확인은 정상적인 걸음 걸이, 건강 한 외관 (무게, 눈, 모피, 그리고 동작), 그리고 상처 치유.
    2. 진통 치료를 계속 (예를 들어, 0.1-0.2 mg/kg buprenorphine 피하) 하루에 세 번 필요에 따라.

3. 행동 및 형태소 분석

1. 행동 분석
   참고: 새로운 실험 환경에 적응 하는 그들에 게 측정을 시작 하기 전에 적어도 30 분 동안 각각 설정에 맞게 동물 허용.
   1. 폰 Frey 테스트
      1. 약의 개별 구획에 동물을 개별적으로 배치 10 cm x 10 cm 금속 표 층에.
      2. 동적 폰 Frey 필 라 멘 트와 함께 주입 사이트에 hindpaw 동측의 발바닥 표면 자극. 동물 자극에서 그것의 발을 철회 하는 힘 note
      3. 5 번을 반복 하 고 각 동물에 대 한 6 측정에서 평균 철수 임계값을 계산 합니다.
   2. 핀 찌 르 기 테스트
      1. 동물에 대 한 개별 구획 장소 10 cm x 10 cm 금속 표 층에.
      2. 피부의 침투 없이 무딘된 26 G 바늘으로 주사 사이트에 hindpaw 동측의 발바닥 표면 자극. 점수 행동으로 제로 (반응 없음) 또는 (반응).
      3. 9 번 stimulations 사이 3 분의 간격으로 반복 하 고 각 동물에 대 한 10 측정에서 비율 응답을 계산.
   3. DREADD ligand clozapine N 산화물 (CNO)의 주입
      1. 실내 온도에 저장 될 수 있다 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 0.2 mg / µ L의 재고 솔루션을 만드는에서 CNO를 분해.
      2. 실험의 날, 살 균 0.9%에서 재고 솔루션을 희석 0.2 µ g / µ L에 NaCl intraperitoneally 10 µ L/g 몸 무게를 주사. 차량 제어 동물 주사 (0.9%에서 0.2% DMSO NaCl).
         참고: 경험에 따르면, 행동에 피크 효과 예상된 1-3 h 주입, 후 고 수 효과 24 시간 후 완전히 가시고 해야. Glycinergic 신경의 활성화의 경우 감소 통증과 가려움증 응답을 포함 하는 행동을 관찰 했다. DREADD 중재 하는 뉴런의 활성화에 의해 갖는 행동 척추 신경의 대상된 하위 집합에 따라 달라 집니다.
   4. 가려움을 유발 하는 Pruritogens의 주입
      1. Pruritogens 0.9%에서 디졸브 NaCl 8 mg/mL (클로로퀸) 또는 10 mg/mL (히 스타 민)의 솔루션을. CNO 관리 후 2 h 척추 주사 사이트에 hindpaw 동측의 발바닥 표면에 pruritogen 또는 차량 솔루션의 10 µ L을 피하 주사. 또는, intradermally 혐오 동작 자체는 면도 의해 발생을 줄이기 위해 하루 전에 면도 되어 종 아리에는 pruritogen를 삽입할.
   5. 자발적인 Nocifensive 또는 Pruritogen 유도 가려움 동작 분석을 찍고
      1. 장소 동물 개별적으로 투명 한 구획 (약 10 cm 직경)에 그들의 각각 집-새 장 바닥에에서 침구의 비트와 함께.
      2. Pruritogen 유도 동작 기록 자발적인 기록 5 분 및 30 분에 대 한 동물 비디오 테이프. 5 분의 쓰레기통에 오프 라인 비디오를 분석 합니다.
   6. 통증 가려움 동작 대
      1. 관찰 하 고 꽁, 핥 아, 그리고 무 동작 합니다.
         참고: 광대와 연결 됩니다 반면 무 통증, 응답으로 간주 꽁 하 고 영향을 받는 사이트의 사슬은.
      2. 정상 속도에서 비디오를 분석, 마우스 핥는 또는 영향을 받는 사이트를 무는 시간을 측정 하거나 핥 고 물고 반사 사이 더 정확한 구별을 위해 슬로우 모션에서 측정 한다. 또는, 핥 아/무/꽁 복싱의 수를 계산 합니다.
2. 형태소 분석
   1. 바이러스 또는 행동 실험의 끝에 주입 후 3 주에 한에서 형태소 분석을 수행 합니다.
      참고: 우리는 주입 후 48 h 곧 eGFP 식 감지는 하지만 또한 그 식 증가 크게 다음 내에서 일 하 고도 주를 발견. 강한 기자 식으로 셀에 대 한 인큐베이션 (관류까지 intraspinal 주사)에서 1 주일은 충분히 있을 수 있습니다. 약한 transgene 식, 약한 발기인 또는 약한 fluorophores, 바이러스는 세포에 대 한 더 이상 식 감지 수준을 보장 하기 위해 필요할 수 있습니다.
   2. 조직의 고정
      1. 다음 100 mL와 함께 차가운 인공 척수 (실제) 솔루션 (NaCl 125 m m, NaHCO₃ 25 m m, NaH₂포₄ 1.25 m m, D-포도 당 20 m m, KCl 2.5 m m, 및 CaCl2 2 m m MgSO4 1 m m)의 20 mL의와 먼저 각 마우스 transcardially를 perfuse 4% (0.1 M 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.4)에 얼음 처럼 차가운 paraformaldehyde.
         주의: Paraformaldehyde 독성 이며 관리와 처리 해야 합니다.
      2. 바로 요 추 척수 해 부 그리고 후 얼음에 4 %paraformaldehyde 2 h에 대 한 조직 수정. 짧게 0.1 M 나트륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4) 후 고정된 조직 세척 하 고 4 ° c.에 하룻밤 (0.1 M 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.4)에 25% 자당 해결책에서 그것을 품 어
      3. cryostat에 30 μ m에서 cryoprotected 조직을 잘라내어 현미경 슬라이드 섹션을 탑재.
   3. 면역 형광 염색
      1. PBS에서 간단한 세척 후 300 μ 차단 솔루션의 적용 (0.3%에서 10% 정상 당나귀 세럼 트리톤-PBS) 실 온에서 1 h에 대 한 섹션에.
      2. 솔루션을 차단에 1 차 항 체의 각 조합의 300 μ와 슬라이드를 품 어 ( 재료의 표참조) 4 ° c.에 밤 동안 3 시간 5 분 각 PBS에 대 한 섹션을 씻어.
      3. 실 온에서 1 h 차단 솔루션에서 2 차 항 체의 각 조합에 있는 슬라이드를 품 어. 3 시간 5 분 각 PBS에 대 한 섹션을 씻어.
      4. 짧게 ddH₂O, 슬라이드 린스 후 형광 설치 매체를 사용 하 여 coverslips를 탑재.
      5. 20 x 40 x 목표와 confocal 현미경을 사용 하 여 형광 이미지를 취득 합니다.

결과

인코딩 마커 단백질 rAAV의 intraspinal 주입에 의해 얻을 수 있는 식 수준을 설명 하기 위해 우리는 먼저 AAV1를 주입. 야생-타입 마우스의 요 추 척수로 CAG.eGFP. 3 주사 간격을 약 1 m m 떨어져 생산 L5 요 추 척추 세그먼트 L3는 거의 지속적인 감염 (그림 1A-C). 척추 표면에서 300 µ m의 깊이에서 바이러스 주입 척수의 등 쪽 뿔에 셀의 주된 감염에 지도 한다. 그러나, 감염 된 세포 복 부 경적 (그림 1D)에서 또한 찾아낼 수 있었다. 다음, 목표 Cre 유전자 변형 마우스 Cre 종속 rAAV 주입 때 rAAV 중재 식에 차이 보여주는 것 이었다. 우리는 그러므로 Cre 종속 AAV1 주입. CAG.flex.eGFP GlyT2::Cre 유전자 변형 쥐의 척수에 벡터. 으로, 전에 eGFP...

토론

Intraspinal 주입 AAVs의 강력한 기술 연구 실험실에서 척추 세포 높은 시간적 및 공간 솔루션의 분석을 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 세 가지 주요 척추 세그먼트는 hindlimb 그들의 주변 축 삭을 확장 하는 감각 뉴런에 의해 innervated 변환 수 있습니다. 3 개의 세그먼트를 시험 강력 하 고 재현할 수 행동 데이터를 생성 합니다. 그것은 또한 하나의 intraspinal 주입 후 가능한 보다 큰 감각 영역의 테스트 수 있습니다. 예를 들어 동일한 사출 정권 발 테스트 허용 (폰 Frey, 하 그 리브스, 등)와 허벅지 (피부 주사, 메카노 리셉터 자극), 해결 될 수 있는 감각 modalities 확대.

중요 한 단계:

강력한 형태학과 행동 데이터를 얻기 위해와 유물을 피하에 대 한 중요 한 몇 가지 단계가 있습니다. 바이러스 성 벡터의 디자인 및 발...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Equipment
micropipette 끌어당기는 사람: DMZ-Universal-Electrode-Puller	Zeitz	NA
마취 장치: Oxymat3 산소 발생기	Weinmann	NA
마취 장치: VIP 3000 수의학 기화기	Midmark	NA
열 매트: Mio Star Thermocare 100	Migros
전기 면도기	Philips	BT9290
수술용 현미경(OPMI pico)	Zeiss	NA
소동물 입체 기구	Kopf	NA
Neurostar StereoDrive(옵션)	Neurostar	NA
모델 51690 Cunningham 마우스 척추 어댑터	Harvard Apparatus	72-4811
PHD 울트라 주사기 펌프와 나노마이트	하버드 장치	70-3601
해밀턴 701 RN 10 μ l 유리 마이크로 리터 주사기	해밀턴	7635-01
해밀턴 탈착식 바늘 (RN) 압축 피팅 1mm	해밀턴	55750-01
미세 치과 드릴링 장치 : Osada 성공 40	Osada	OS-40
구형 커터, 0.5mm	Busch	12001005B
전자 폰 프레이 마취계	IITC	23905
유연한 폰 프레이 헤어	IITC	#7
LSM710 파스칼 컨포칼 현미경	Zeiss	NA
0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective	Zeiss	NA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective	Zeiss	NA
strong>Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cm	Fine Science Tools	10004-13
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Adson 집게, 1 x 2 이빨, 12cm	Fine Science Tools	11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, 곡선형, 0.7mm 컵	Fine Science Tools	16121-14
Dumont #2 laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20
Olsen-Hegar 바늘 홀더, 톱니형, 8.5mm 클램프 길이	Fine Science Tools	12002-12
Fine Forceps #5	Fine Science Tools	11254-20
Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
>소모품 및 화학
Thin-wall glass capillary, 1mm 외경	World Precision Instruments	TW 100-3
주사기(1, 5 및 20ml)	B. Braun	(9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G 경사진 바늘	B. Braun	4665457
멸균 메스 블레이드	B. Braun	BB523
외과용 봉합사 Safil Quick+ 4/0, 흡수성	B. Braun	C1046220
외과용 봉합사 Premilene 5/0, 비흡수성	B. Braun	C0932191
멸균 PBS 또는 식염수(0.9%)		NA
에탄올, 70% (소독제)		NA
요오드 용액(예: Braunol)	B. Braun	18380
마취제(예: Attane isoflurane)	Provet	2222
Aldasorber	333526
진통제(예: 부프레노르핀: temgesic)	개별	GTIN: 7680419310018
안과 연고(예: vita-pos)	Pharma medica	GTIN: 4031626710635
면봉(예	출처)IVF Hartmann	1628100
안면 조직(예	출처)Uehlinger AG	2015.10018
Superfrost plus microscope slides	ThermoScientific	J1800AMNZ
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
>Mice
C57BL/6J mice (wildtype)	The Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J 마우스 (RORβ Cre)	잭슨 연구소	RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 마우스 (R26Tom)	잭슨 연구소	RRID: IMSR_JAX:007914
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Viral vectors
AAV1. 씨엠씨7. CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1. CAG.eGFP)	펜 벡터 코어	AV-1-PV1963
AAV1. CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1. CAG.flex.eGFP)	펜 벡터 코어	AV-1-ALL854
AAV1. CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1. CAG.flex.tdTomato)	펜 벡터 코어	AV-1-ALL864
AAV1. EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1. EF1a.flex.DTA)	펜 벡터 코어	커스텀 프로덕션
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))	펜 벡터 코어	커스텀 프로덕션
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
>Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry	Addgene	44361
pAAV.EF1α. flex.hChR2(H134R)-eYFP	Addgene	20298
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Bacteria
MDS42	ScarabGenomics
Stbl3	ThermoScientific	C737303
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
>Reagents
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Quiagen	12362
NucleoBond PC 500	Machery & Nagel	740574
clozapine-N-oxide (CNO)	Enzo Life Sciences	BBL-NS105-0025
클로로퀸 디포스페이트 염	Sigma	C6628
히스타민	Sigma	H7125
Dapi	Invitrogen	D3571
Name	Company<	strong>카탈로그 번호	코멘트
항체 (희석)
Rabbit anti-GFP (1:1000)	Molecular Probes	RRID:AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000)	Abcam	RRID:AB_10711153
Goat anti-Pax2 (1 : 200)	R & D Systems	RRID:AB_10889828
기니피그 anti-Lmx1b (1 : 10 000)	Dr Carmen Birchmeier	Muller et al. 2002
Rabbit anti-GFAP (1 : 1000)	DakoCytomation	RRID:AB_10013382
당나귀에서 제기된 2차 항체 (1:800)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	NA