척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

등 쪽 척수 주변 신체와 뇌 사이의 정보 교환을 위해 근본적 이다. 열, 감기, 같은 감각 자극, 만지거나 유해 자극 척수의 등 쪽 뿔의 신경 세포에이 정보를 전달 전문된 주변 신경에 의해 감지 됩니다. 여기, 억제 및 흥분 성의 수의 복잡 한 네트워크 변조 하 고 결국 척추 프로젝션 뉴런 supraspinal 통해 릴레이 감각 정보 사이트^1,2. 척추에 의해 실시 계산 인터-프로젝션 뉴런 감각 정보, 정보 억제 또는 릴레이 강도에 따라서 결정 문 및. 변화 억제와 흥분, 밸런스 변경된 등 감각 자극의 통합에 과민 증 또는 용어인 (일반적으로 비-고통 스러운 자극 후 고통 스러운 감각) 등 감각 장애를 일으킬 수 있습니다. 이러한 변화는 다양 한 만성 통증의 근본 원인을 상태^3,4수 생각 된다. 따라서, 척추 회로 감각 처리에 높은 중요성의 따라서 생물체의 환경 및 자기 인식. 최근 출현 및 분자, 유전자의 조합 및 유전으로 확인 된 척추 신경 부분 모집단의 정확한 조작 하도록 하는 수술 기법, 과학자 들은 이제 이해 하기 시작 기본 척추 회로 고유 감각 modalities의 처리를 담당 합니다.

야생-타입 또는 유전자 변형 쥐에 rAAV의 intraspinal 주입 크게 기여한 조작, 분석, 및 척추 신경^5,6,7, 의 특정 하위 집합의 기능 이해 ^{8 , 9 , 10 , 11}.이 기술은 마커 단백질의 배달을 허용 (GFP 등 / GFP 융해 단백질), 기자 단백질 (예: GCaMP), 또는 effector 단백질 (예: 세균 독 소, channelrhodopsin, 또는 pharmacogenetic 수용 체)는 공간 척추 신경에 제한 된 방식 으로입니다. Cre recombinase 척추 신경의 특정 하위 집합에서을 표현 하는 유전자 변형 쥐로 Cre 종속 rAAVs의 로컬 주입 각각 신경 인구의 특정 분석을 허용 한다. 우리는 라벨, ablate, 억제 또는 척추 glycinergic 뉴런을 보여주는 그들은 척추 게이트 통증 제어의 필수적인 부분입니다 및 전송⁷을 렵 게 활성화에이 기술을 채용 했습니다. 이 실험에서 intraspinal 주입 Cre 종속 rAAV GlyT2::Cre 쥐 요 추 척수 신경 세포 glycinergic의 선택적 조작 사용할 수 있습니다. 따라서, glycinergic 신경 동물의 생존에 대 한 중요 한 포함 하는 supraspinal 회로의 동시 조작 피할 수 있습니다.

RAAVs의 intraspinal 주사 주입의 사이트에 감염 제한, 하는 동안 로컬 뉴런에서 뿐만 아니라 axonal 예측을 통해 사출 사이트에 연결 하는 신경 세포에 바이러스 성 변환 발생할 수 있습니다. 후자는 자주 사용 한다 특정 핵은 뇌에서 신경 입력을 제공 하는 추적 CNS 영역에. 그러나 Axonal 예측의 감염,, 수도 있습니다 혼동 요인의 정의 된 인구는 특정 사이트에서 공부 한다. 이러한 문제를 해결 하기 위해 우리가 최근에 AAV serotypes serotypes 및 발기인 최소화 또는 최대화 역행 변환 하는 데 사용할 수 있는 식별 식 카세트의 포괄적인 분석을 실시 했습니다. 척추 회로에서이 특정 연구의 맥락에서 우리 retrogradely transduce 지 루트 신경 절 (DRG), rostral ventromedial 모 수 (호), 및 ^{somatosensory 피 질 뉴런에 다른 serotypes 및 발기인의 능력 분석 12}.이 프로토콜에서 설명 하는 기술을 사용할 수 있습니다 따라서 척추 신경 주사 사이트에서 분석 하거나 투영 신경 척수의 삽입 된 사이트에 입력을 제공 하는 분석. 여기에 설명 된 프로토콜에서 요 추 척수의 왼쪽에 rAAV의 3 개의 주사 3 허리 세그먼트 (L3-L5)에서 뉴런의 변환 수 있도록 수행 됩니다. L3-L5 세그먼트는 사출 사이트에 hindlimb 동측에서 감각 입력의 대부분을 받습니다. 시연 L3-L5 유전자 레이블이 뉴런의 기능 조작 이다 강력한 행동 변화를 연상 하기에 충분 따라서 유전자 레이블이 신경 하위의 회로 기능에 대 한 기능 증거를 제공 합니다.

모든 동물 실험 스위스 cantonal 수의 사무실 (취리히)에 의해 승인 했다 고 따라와 모든 관련 규제 기관 지침 준수에 있다.

참고: 각각의 제조 업체 및 공급 업체와 함께 모든 재료는 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.

1. 생성 Cre 종속 AAV 벡터의

참고: 다른 발기인 Cre 종속 벡터의 다양 한 구입하실 수 있습니다 ( 테이블의 자료를 참조) 또는, 원하는 식 구조를 사용할 수 없는 경우 기존 AAV 구문을 수정 하 여 생성할 수 있습니다. 참고, 발기인 및 serotype 바이러스 성 변환의 확산에 영향을 미칠 수 있습니다 ( ¹²참조). 이 프로토콜의 첫 번째 부분은 간단히 설명 합니다 이득에 대 한 적합 한 두 개의 다른 Cre 종속 AAV 벡터의 생성 및 손실의 기능 실험, 각각.

1. Pharmacogenetic 활성화 (기능의 이익)
   1. PAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq) 주문-mCherry ( 재료의 표참조) 디자이너 약물 (DREADD)에 의해 독점적으로 활성화 디자이너 수용 체에 대 한-중재 활성화.
   2. 세균성 찌 르 기 문화를 받으면 파운드 플레이트 (세균 학년 agar Luria Bertani 액체 매체에서 해산)에 박테리아에 밖으로 행진 적절 한 항생제와 보충. 37 ° C에서 밤새 incubate 고 날에 단 하나 식민지를 선택 합니다.
      참고: 포함 된 AAV 벡터 게놈 수 안정 및 재조합 바이러스 거꾸로 터미널 내 특히 바이러스 성 게놈의 반복 (ITR), 플라스 미드는 대장균에 증폭 하는 동안 발생할 수 있습니다. 같은 변종 recA-결핍/억압을 사용 하는 것이 좋습니다 MDS42 또는 Stbl3을 피하기 위해 재조합 AAV 게놈을 포함 하는 플라스 미드 내.
   3. 박테리아는 선택의 공급 업체에 의해 주어진 지침에 따라 증폭 DNA-맥시-키트 상용 DNA-맥시-키트와 함께 높은 품질 플라스 미드 DNA를 준비 하 고 (예를 들어, 테이블의 자료를 참조). 무결성 및 플라스 미드 DNA의 약 수의 제한 다이제스트 통해 플라스 미드 DNA의 id를 확인 하 여 플라스 미드 DNA 준비의 품질 관리를 수행 합니다.
      참고: 금지 endonuclease는 ITRs 내의 SmaI에 대 한 인식 사이트 있습니다. ITRs의 무결성을 확인 하는 품질 관리에 SmaI 다이제스트를 포함 합니다.
   4. 고품질 rAAV를 생성 하기 위하여 바이러스 성 벡터 핵심 시설에는 DNA를 보냅니다.
      참고: 높은 titer 고품질 바이러스 preps 고기 바이러스 준비에 오염으로 인 한 혼동을 피하에 대 한 중요 한 있습니다. 따라서 AAV 생산은 실험실에서 잘 설립 하지 않는 한 설립된 벡터 핵심 시설에서 생산 하는 선택의 rAAV를 갖는 것이 좋습니다.
2. 절제 (기능의 상실)
   참고: 세균성 독 소 또는 독 소 수용 체는 세포 제거 또는 신경 입을 중재에 사용할 수 있습니다. 우리는 생성 표현 디프테리아 독 소 조각 A (DTA)에 pAAV.EF1α.flex.DTA는 Cre 종속.
   1. Cre 종속 바이러스 성 벡터를 생성 하려면 선택 (예를 들어, pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP) 적당 한 발기인 Cre 종속 벡터. 그들의 돌출부 (참조 양 외 에 AscI 및 NheI 또는 호환 금지 endonuclease 인식을 포함 한 뇌관으로 연쇄 반응에 의해 선택 (예를 들어, DTA)의 코딩 순서를 증폭 ⁷)
   2. 표준 분자 생물학 기법을 사용 하 여, 금지 다이제스트 DNA 벡터의 수행 (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) PCR 증폭의 금지 endonucleases AscI 및 NheI로 (NheI-DTA-AscI) 삽입. 순화 단편 선
   3. 적합 한 박테리아에 결 찰 반응의 선택, 유능한 박테리아의 공급 업체에 의해 주어진 프로토콜에 따라 변환 하 고 파운드 격판덮개에 박테리아를 접시. RecA-결핍/억압을 사용 하 여, MDS42 또는 Stbl3, 같은 복제에 대 한 긴장과 플라스 미드 DNA의 후속 증폭.
   4. 변환 후에 일에 클론을 선택 하 고 파운드 매체로는 적절 한 항생제 37 ° c.에 보충에 접종 다음 날, 교양된 박테리아에서 플라스 미드 DNA를 추출 합니다. 성공적인 금지 다이제스트에 의해 복제 및 추출 된 플라스 미드 DNA의 시퀀싱을 확인 합니다.
   5. 높은 품질, 세균성 플라스 미드 DNA 증폭 (단계 1.1.3 참조). 증폭된 DNA 바이러스 생산에 대 한 바이러스 성 벡터 핵심 시설에 보내기.

2입니다. 척추 셀의 변환

1. 바이러스 솔루션의 준비
   주의: 바이러스 감염 시 약 이며, 관련 지침에 따라 처리 합니다. 대부분의 경우, rAAVs biosafety 수준 1 (BSL1)에서 처리할 수 있습니다.
   1. 주입의 날, 얼음에 원하는 순화 된 바이러스의 주식 약 수를 녹 인 다 고 주사 전에 직접 얼음에. 이러한 바이러스의 효과적인 titer 감소 시킬 것 이다 동결-해 동 주기 일 반복된, 하지 마십시오.
      참고: 필요한 경우 aliquot defrosted 바이러스 수 보관 4 ° C에서 최대 3 일 동안.
   2. 살 균 0.9%의 바이러스 입자를 희석 NaCl 또는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS).
      참고: 적절 한 titer 그리고 실험 목적에 따라 실험적으로 결정 되어야 한다. 좋은 총 바이러스 부하로 시작 3 x 10⁹ 게놈 복사본 (3.33x10¹² GC/mL, 3 x 300 nL 주사) 이다. 초과 하 고로 모 세관을 로드 하는 동안 일부 손실 계정, 바이러스 솔루션의 약 2.5 µ L 각 마우스에 대 한 필요 하 게 됩니다.
2. Intraspinal 주사에 대 한 Micropipettes의 준비
   1. '당겨' 얇은 유리 모 세관 (외부 직경 1 m m) ~5.5 m m 긴 만들려고 micropipette 끌어당기는 사람에 얕은 칼. 3.0 m m 히터 필 라 멘 트 및 프로그램 00의 설정을 사용 하 여 표 1에서 적응 하는 P(A)와.
      참고: 철수 할 수 있습니다 사전에. 가져온된 모 세관 나중는 micropipette 방해할 수 있는 먼지를 피하기 위해 클레이 모델링에 닫히는 콘테이너에서 저장 되어야 한다. Micropipettes의 압력가 마로 소독 필요 하지 않습니다.
   2. 가져온 모 세관 칼 여 25-35 μ m의 내부 직경을 가진 팁을 만드는 약 4.5 ~ 5 mm의 길이를 laminectomy 집게와 클립. 마이크로 미터 규모와 현미경을 사용 하 여, 얼마나 큰 개방 해야 합니다, 또는 모든 micropipette 측정에 대 한 느낌을 여러 micropipettes의 내부 직경을 측정 합니다.
      참고: 작은 팁; 막힘으로 이어질 수 있습니다. 큰 팁은 조직 손상과 척수에 침투 하는 어려움이 발생할 수 있습니다.
3. 수술 설치 및 준비
   1. 장비는 깨끗 하 고를 사용할 수 확인 하십시오. 70% 에탄올으로 닦아 하 여 작업 영역을 소독 하 고 소독 압력가 마로 소독 하거나 그들을 소독 하 여 도구. 어떤 살 균 제 사용 되는 바이러스 성 벡터를 해칠 것 이라고 microliter 주사기에 두지 마십시오.
4. 마 취와 수술에 대 한 동물의 준비
   참고: 수술의 전체 기간이 60-90 분입니다.
   1. 수술 절차를 촉진 하기 위하여 6를 10 주 된 쥐를 선택 합니다.
      참고: 실험 설계에 필요한 경우 젊은 이상 동물의 주입 가능 하다. 어떤 긴장 든 지 및 남녀 원칙적으로 사용할 수 있습니다 하지만 동일한 배경 스트레인 (예를 들어, C57BL/6J)를 사용 하 여 다른 유전자 변형 마우스 라인 사이의 행동의 비교. 성별 차이 또는 조사, 분석 남성과 여성 별도 그룹에.
   2. ~ 5 %isoflurane 사용 하 여 마 취를 유도. 동물 stereotaxic 프레임 열 매트에 놓고 1-2.5 %isoflurane 마 취를 유지 (공기 흐름 속도 900 mL/min). 수술 내내 호흡 속도 모니터링 합니다.
   3. 수술 중 각 막 건조 방지 하기 위해 윤활제 눈 연 고를 적용 합니다.
   4. 동물의 뒤를 면도 하 고 젖은 티슈로 조심 스럽게 머리를 제거 합니다. 요오드 솔루션 면도 피부를 소독 하 고 피부 건조를 허용 합니다.
   5. 진통 치료 (예, 0.1-0.2 mg/kg buprenorphine 피하).
5. 요 추 척수 수준에서 척추 칼럼의 노출
   참고: 때문에 척수와 척추 칼럼의 차동 개발, 각 수준을 정렬 되지 않습니다, 하지만 요 추 척수 세그먼트 L4 T13 흉부 척추와 동일한 수준에.
   1. 따라 척추 열 palpating 여 가장 꼬리 리브 쌍을 찾습니다. 메스를 사용 하 여, 가장 꼬리 리브 쌍에 그냥 rostral에서 시작 하는 피부에 1.5-2.5 c m 세로 컷을 확인 합니다.
   2. 집게와 함께 피부를 들어올리고가 위로 기본 근육에서 분리 합니다. 수술을 통해 노출 된 조직 촉촉한 유지 살 균 0.9 %NaCl.
   3. 좋은 집게 및 작은 위를 사용 하, 정중 선 옆 바로 다음, 얇은 막 층으로 절 개 하 고 spinous 프로세스에서 그것을 잘라. 기본 paraspinous 근육 별개 이지만 spinous 프로세스에 연결 된.
6. 척추 요 추 척수 수준에서의 식별
   참고: 일단 척추 열 노출 심근 인 대 및 등 spinous 프로세스 표시 되어야 합니다. 여러 가지 해부학 적 랜드마크 대상 (그림 1B)에 올바른 척추를 식별 도움이 됩니다.
   1. 다시 장 골도 머리 폭로 꼬리 쪽으로 피부를 당겨. 동일한 수준에서 보이는 심근 인 대의 가장 꼬리 쌍 L6 spinous 프로세스에 합류 했다. Rostral 방향을 식별 관심의 척추에 꼬리에서 거꾸로 계산.
   2. 따라 척추 열 만져. 가장 꼬리 리브 쌍 T13 척추를 그냥 rostral 있으며 엉덩이 수준에서 골반 뼈 L6 척추의 수준 이다.
   3. 척추 칼럼의 측면을 따라 힘 줄 백인 이며 가장 중간에 자리를 찾습니다. T13 척추는 그냥 rostral 있습니다. 요 추 척추 세그먼트 L4이이 척추 내에 위치한 이다.
7. 척추 및 요 추 척수의 노출 고정
   1. 올리고 조직 stereotaxic 프레임의 척추 클램프 상승의 쿠션에 동물을 놓습니다.
   2. 호흡으로 인해 척추 칼럼의 움직임을 피하기 위해 대상 척추 수정. 이 목표에 대 한 정렬 대상 척추에 인접 한 클램프, 위치에 있는 한 클램프를 수정 누르고 척추 칼럼 Adson 집게와 두 번째 클램프를 고정 시키는 동안.
      참고: 열 주입 평면에 수직 이어야 하며 단단히 고정 위에서 압력에 따라 이동 하지 않습니다. 필요한 경우, 클램프의 두 번째 쌍 척추 열을 해결할 수 있습니다. 이 경우 대상 척추에 인접 한 두 척추에 클램프의 두 쌍을 해결 하기 위해 유용 합니다.
   3. 관심의 척추 위에 paraspinous 근육을 제거 합니다. 메스를 사용 하 여 병렬 절 개 척추 열에 평행한 힘 줄에 그냥 중간으로 수직 절 개 rostral와 꼬리 하 게 대상 척추. 수 너무 깊이 잘라 하지 않도록 주의 하십시오. 눈물/컷 멀리 rongeurs를 사용 하 여 근육입니다. 하는 척추 또는 척추 공간에서 경질 위에 남아 있는 조직을 제거 겸 자 필요에 따라 사용 합니다.
   4. 척추 공간에서 등 쪽 혈관 척수의 중간 선 표시 표시 되어야 합니다. 일방적인 주입 부분 laminectomy 척추의 대상 쪽의 중간에 구멍을 시추에 의해 수행. 0.5 m m 원형 커터 장치 드릴링 좋은 치과 사용 하 고 척수를 접근할 때 특히 신중 하 게 드릴. 척수를 노출 26 G 경사진된 바늘으로 모든 나머지 뼈 파편을 제거 합니다.
   5. 26 G 경사진된 바늘을 사용 하 여, 드릴된 구멍, 그리고 rostral와 대상 척추, 등 쪽 혈관에 모두 약 200 µ m 옆에 꼬리 척추 공간 경질 구멍. 척수 구멍에서 이스케이프 해야 하 고 척수는 약간 밖으로 돌출 한다.
8. 분사 주사기의 준비
   참고: 주입 주사기 준비 되어야 한다 주입의 시작의 앞에 즉시 먼지 입자는 micropipette 막힘의 위험을 줄이기 위해.
   1. 이동식 바늘 압축 피팅 키트를 사용 하 여 microliter 주사기에 유리 모 세관을 탑재 합니다. 단단하고 안전한 적합을 보장 하기 위해 단단히 너트를 고정 시킵니다.
   2. 멸 균 증류수와 microliter 주사기와 플런저와 함께 밖으로 그것을 눌러 시작.
      참고: 거기는 너무 많은 저항 물 팁에서 쉽게 오지 않는다는 micropipette 가능성이 차단 되 고 교환 되어야 한다.
   3. 전자 제어 microinjector에 연결 된 micromanipulator에 주사기를 탑재 합니다. 수는 micropipette와 아무것도 만지지 않도록 주의 하십시오.
   4. microinjector을 사용 하 여, 물과 바이러스 사이의 거품을 생성 하는 공기의 약 1 µ L를 그립니다.
   5. 파라핀 필름의 조각에 바이러스 솔루션의 2.5 µ L 드롭릿 장소 신중 하 게는 micropipette 팁 stereotaxic 프레임을 사용 하 여 작은 물방울에 이동한 그것을 세우. 다음 신중 하 게 보도 분배까지 바이러스 솔루션의 비트는 끝에 나온다.
   6. 주사기를 철회 하 고, 펜을 사용 하 여, 규모와 micropipette 표시 하 고 바이러스 솔루션;의 수준 이 프로그램으로 주입 진행 여부의 모니터링을 촉진 한다.
9. Intraspinal 주사
   1. 경질에 구멍 중 하나 위에 micropipette의 끝을 이동 하 고 아래로 약간의 덴트 경질에 기록 될 때까지. 척추 등 혼을 주입을 대상으로 조직의 기계적 안정화 수 있도록 500 µ m 단위로 100 µ m 연속 (1 mm/s 속도) 및 최대 다음 200 µ m 아래로 이동 합니다.
      참고: 팁의 마지막 깊이 300 µ m를이 경우에 있지만 대상 지역에 따라 적용할 수 있습니다.
      1. 조직 침투에 저항 하는 경우는 micropipette 경질 잡기 될 수도 있습니다. 이 경우에 철회 하 고 눕는 구멍, 또는 다시 사용 하 여 바늘 침투 시도 반복 하기 전에 경질을 제대로 구멍을 약간 이동 합니다.
   2. 300의 대상 주입 볼륨 펌프 프로그램 주입 하려면 50 nL/min의 시작 버튼을 누르면 사출 속도로 nL.
   3. 주입 완료 여부 바이러스 수준 떨어졌다 볼을 천천히 주사기를 제거 하기 전에 equilibrate에 압력을 허용 하는 추가 3 분을 위한 장소에는 micropipette를 두고 규모를 확인 합니다.
   4. 2.9.1.-2.9.3 단계를 반복 합니다. 다른 두 개의 사출 사이트에 대 한.
10. 봉합 및 복구
    1. 척추 클램프 및 마우스 아래 쿠션을 제거 합니다.
    2. 레이어 비 흡수 봉합 흡수 봉합 표면 조직 층과 피부를 봉합 중단된 stiches에에서 상처를 닫습니다. Sutured 상처에 요오드 소독 제를 적용 합니다.
    3. 마 취 종료 되 고 그것은 그것의 집 감 금에 반환 하기 전에 복구 될 때까지 열 매트에 동물을 두고.
11. 수술 후 관리
    1. 수술 당일, 다음날, 그리고 매 2-3 일 후에 동물의 상태를 모니터링 합니다. 동물 확인은 정상적인 걸음 걸이, 건강 한 외관 (무게, 눈, 모피, 그리고 동작), 그리고 상처 치유.
    2. 진통 치료를 계속 (예를 들어, 0.1-0.2 mg/kg buprenorphine 피하) 하루에 세 번 필요에 따라.

3. 행동 및 형태소 분석

1. 행동 분석
   참고: 새로운 실험 환경에 적응 하는 그들에 게 측정을 시작 하기 전에 적어도 30 분 동안 각각 설정에 맞게 동물 허용.
   1. 폰 Frey 테스트
      1. 약의 개별 구획에 동물을 개별적으로 배치 10 cm x 10 cm 금속 표 층에.
      2. 동적 폰 Frey 필 라 멘 트와 함께 주입 사이트에 hindpaw 동측의 발바닥 표면 자극. 동물 자극에서 그것의 발을 철회 하는 힘 note
      3. 5 번을 반복 하 고 각 동물에 대 한 6 측정에서 평균 철수 임계값을 계산 합니다.
   2. 핀 찌 르 기 테스트
      1. 동물에 대 한 개별 구획 장소 10 cm x 10 cm 금속 표 층에.
      2. 피부의 침투 없이 무딘된 26 G 바늘으로 주사 사이트에 hindpaw 동측의 발바닥 표면 자극. 점수 행동으로 제로 (반응 없음) 또는 (반응).
      3. 9 번 stimulations 사이 3 분의 간격으로 반복 하 고 각 동물에 대 한 10 측정에서 비율 응답을 계산.
   3. DREADD ligand clozapine N 산화물 (CNO)의 주입
      1. 실내 온도에 저장 될 수 있다 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 0.2 mg / µ L의 재고 솔루션을 만드는에서 CNO를 분해.
      2. 실험의 날, 살 균 0.9%에서 재고 솔루션을 희석 0.2 µ g / µ L에 NaCl intraperitoneally 10 µ L/g 몸 무게를 주사. 차량 제어 동물 주사 (0.9%에서 0.2% DMSO NaCl).
         참고: 경험에 따르면, 행동에 피크 효과 예상된 1-3 h 주입, 후 고 수 효과 24 시간 후 완전히 가시고 해야. Glycinergic 신경의 활성화의 경우 감소 통증과 가려움증 응답을 포함 하는 행동을 관찰 했다. DREADD 중재 하는 뉴런의 활성화에 의해 갖는 행동 척추 신경의 대상된 하위 집합에 따라 달라 집니다.
   4. 가려움을 유발 하는 Pruritogens의 주입
      1. Pruritogens 0.9%에서 디졸브 NaCl 8 mg/mL (클로로퀸) 또는 10 mg/mL (히 스타 민)의 솔루션을. CNO 관리 후 2 h 척추 주사 사이트에 hindpaw 동측의 발바닥 표면에 pruritogen 또는 차량 솔루션의 10 µ L을 피하 주사. 또는, intradermally 혐오 동작 자체는 면도 의해 발생을 줄이기 위해 하루 전에 면도 되어 종 아리에는 pruritogen를 삽입할.
   5. 자발적인 Nocifensive 또는 Pruritogen 유도 가려움 동작 분석을 찍고
      1. 장소 동물 개별적으로 투명 한 구획 (약 10 cm 직경)에 그들의 각각 집-새 장 바닥에에서 침구의 비트와 함께.
      2. Pruritogen 유도 동작 기록 자발적인 기록 5 분 및 30 분에 대 한 동물 비디오 테이프. 5 분의 쓰레기통에 오프 라인 비디오를 분석 합니다.
   6. 통증 가려움 동작 대
      1. 관찰 하 고 꽁, 핥 아, 그리고 무 동작 합니다.
         참고: 광대와 연결 됩니다 반면 무 통증, 응답으로 간주 꽁 하 고 영향을 받는 사이트의 사슬은.
      2. 정상 속도에서 비디오를 분석, 마우스 핥는 또는 영향을 받는 사이트를 무는 시간을 측정 하거나 핥 고 물고 반사 사이 더 정확한 구별을 위해 슬로우 모션에서 측정 한다. 또는, 핥 아/무/꽁 복싱의 수를 계산 합니다.
2. 형태소 분석
   1. 바이러스 또는 행동 실험의 끝에 주입 후 3 주에 한에서 형태소 분석을 수행 합니다.
      참고: 우리는 주입 후 48 h 곧 eGFP 식 감지는 하지만 또한 그 식 증가 크게 다음 내에서 일 하 고도 주를 발견. 강한 기자 식으로 셀에 대 한 인큐베이션 (관류까지 intraspinal 주사)에서 1 주일은 충분히 있을 수 있습니다. 약한 transgene 식, 약한 발기인 또는 약한 fluorophores, 바이러스는 세포에 대 한 더 이상 식 감지 수준을 보장 하기 위해 필요할 수 있습니다.
   2. 조직의 고정
      1. 다음 100 mL와 함께 차가운 인공 척수 (실제) 솔루션 (NaCl 125 m m, NaHCO₃ 25 m m, NaH₂포₄ 1.25 m m, D-포도 당 20 m m, KCl 2.5 m m, 및 CaCl2 2 m m MgSO4 1 m m)의 20 mL의와 먼저 각 마우스 transcardially를 perfuse 4% (0.1 M 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.4)에 얼음 처럼 차가운 paraformaldehyde.
         주의: Paraformaldehyde 독성 이며 관리와 처리 해야 합니다.
      2. 바로 요 추 척수 해 부 그리고 후 얼음에 4 %paraformaldehyde 2 h에 대 한 조직 수정. 짧게 0.1 M 나트륨 인산 염 버퍼 (pH 7.4) 후 고정된 조직 세척 하 고 4 ° c.에 하룻밤 (0.1 M 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.4)에 25% 자당 해결책에서 그것을 품 어
      3. cryostat에 30 μ m에서 cryoprotected 조직을 잘라내어 현미경 슬라이드 섹션을 탑재.
   3. 면역 형광 염색
      1. PBS에서 간단한 세척 후 300 μ 차단 솔루션의 적용 (0.3%에서 10% 정상 당나귀 세럼 트리톤-PBS) 실 온에서 1 h에 대 한 섹션에.
      2. 솔루션을 차단에 1 차 항 체의 각 조합의 300 μ와 슬라이드를 품 어 ( 재료의 표참조) 4 ° c.에 밤 동안 3 시간 5 분 각 PBS에 대 한 섹션을 씻어.
      3. 실 온에서 1 h 차단 솔루션에서 2 차 항 체의 각 조합에 있는 슬라이드를 품 어. 3 시간 5 분 각 PBS에 대 한 섹션을 씻어.
      4. 짧게 ddH₂O, 슬라이드 린스 후 형광 설치 매체를 사용 하 여 coverslips를 탑재.
      5. 20 x 40 x 목표와 confocal 현미경을 사용 하 여 형광 이미지를 취득 합니다.

인코딩 마커 단백질 rAAV의 intraspinal 주입에 의해 얻을 수 있는 식 수준을 설명 하기 위해 우리는 먼저 AAV1를 주입. 야생-타입 마우스의 요 추 척수로 CAG.eGFP. 3 주사 간격을 약 1 m m 떨어져 생산 L5 요 추 척추 세그먼트 L3는 거의 지속적인 감염 (그림 1A-C). 척추 표면에서 300 µ m의 깊이에서 바이러스 주입 척수의 등 쪽 뿔에 셀의 주된 감염에 지도 한다. 그러나, 감염 된 세포 복 부 경적 (그림 1D)에서 또한 찾아낼 수 있었다. 다음, 목표 Cre 유전자 변형 마우스 Cre 종속 rAAV 주입 때 rAAV 중재 식에 차이 보여주는 것 이었다. 우리는 그러므로 Cre 종속 AAV1 주입. CAG.flex.eGFP GlyT2::Cre 유전자 변형 쥐의 척수에 벡터. 으로, 전에 eGFP 식 관찰 되었다 등 쪽과 복 부 경적에. 그러나, 예상 했던 대로, eGFP 표현의 더 제한, 즉 표면 등 쪽 뿔에 상대적으로 스파스 표현과 깊은 지 경적 (그림 1E)에 밀도 식 GlyT2 + 뉴런의 분포를 반영 되었다.

다음, 척추 신경 부분 모집단, 두 개의 다른 Cre 종속 AAVs의 회로 기능을 주소 지정의 타당성을 설명 하기 위해 다른 effector 단백질 (DTA 및 hM3Dq)에 대 한 코딩 했다 주입 GlyT2::Cre 유전자 변형 쥐로. 유사한 바이러스 성 식 AAV1의 3 주사 후 관찰. CAG.eGFP 야생-타입 쥐로 억제 뉴런 (Pax2 +)의 강력한 제거에에서 있었던 허리 세그먼트 L3-L5 AAV1의 주입 후. Glyt2::Cre 쥐 (그림 2AC)로 EF1a.flex.DTA. 이 세그먼트에서 glycinergic 억제 뉴런의 손실 갖는 표시 기계적 과민 증 (그림 2D)와 자연 스러운 혐오 행동 지시 동측 hindlimb (그림 2E). 혐오 행동 자 해 병 변, 발, 종 아리, 허벅지에 관찰 될 수 있는 주도 (데이터, 참조 양 외. 7) 효과 반대 glycinergic AAV1.hSyn.flex.hM3Dq의 주입 및 CNO (그림 2B)의 후속 복 주입을 통해 신경 세포를 활성화 하는 때 관찰 되었다. 마우스는 유해 기계적 자극 (그림 2F) 및 기타 유해 자극 (참조 양 외 에 desensitized 되었다 7) 또한, pruritogens 히 스타 민 또는 클로로퀸 치료, glycinergic의 hM3Dq 중재 활성화 효율적으로 억제 prurifensive 응답 (그림 2G). 이 결과 요 추 척수에 rAAV의 3 개의 주사는 해당 hindlimb의 자극에 의해 갖는 강력한 행동 변화를 관찰 하기에 충분 한 요 추 척수의 영역 transduce 수 보여줍니다.

실험의 최종 세트, 우리 Cre 기자 바이러스에 비해 Cre 기자 마우스를 사용 하 여 잠재적인 차이 보여 싶 었 어 요. 따라서, Cre 드라이버 유전자 그 이전 마우스 척수에 제한 된 표현 패턴 표시로 기술 되었다 선택 되었다. RORβ 유전자 억제 수 깊은 등 쪽 뿔13,14에서 주로 표현 될 제안 되었습니다. 이 연구 RORβCre 노크에서 마우스를 사용 하 고 Rosa26lox-정지-lox-tdTomato (R26톰) Cre 기자 쥐, Cre 식 분석 (전에 시간 언제 든 지 표시 하는 모든 셀에 tdTomato의 표현으로 이어질 그들을 넘어 그림 3A)입니다. TdTomato + RORβCre; 세포의 특성 R26톰 쥐 신경에 이다 (그림 3BC) 등 혼의 식을 드러냈다. 사실, tdTomato + 셀의 정량화 Cre 중재 재결합 (58%)를 받고 세포의 대부분은 비 신경 했다 제안 했다. 우리는 다음 주입 Cre 종속 tdTomato 기자 rAAV (AAV1. CAG.flex.tdTomato) P40 RORβCre 생쥐 (그림 3D)의 척수에. R26톰달리-중재 기자 식, 우리 모든 tdTomato + 셀 수 신경 (그림 3EF) 기자 바이러스에 의해 분류를 발견. 마지막으로, tdTomato + 뉴런의 정체성 쥐 (RORβCre;의 두 세트에서 분석 R26톰 고 RORβCre AAV1 주사. CAG.flex.tdTomato). 두 경우 모두, 뉴런의 대부분은 금지 했다 (> 85%)와 신경 흥분 성의 소수 민족 (< 20%) (그림 3 G-난), 이전 평가 RORβ + 신경13,14의 정체성의 계약입니다.

그림 1: Intraspinal AAV1-eGFP/AAV1-플렉스-eGFP 주입
(A)는 AAV1의 intraspinal 주사의 도식 적인 그림. CAG.eGFP (AAV1-eGFP)는 hindlimb에서 innervated 요 추 척수에. (B) 요 추 척수 세그먼트 L3-L4의 해 부 위치는 마우스의 다시 보기 다운 상단에서 볼 수 있습니다. 피부 노출 척추 열을 열었습니다. T13-L6 척추의 척추 프로세스는 해 부 참조로 표시와 화살표 장 골도 머리를 나타냅니다. (C) 전체 산 허리 척수의 대표 이미지. 녹색 형광 척수의 바이러스 불리고 영역을 나타냅니다. (D)는 AAV1 eGFP 불리고 요 추 척수 야생-타입 마우스에서 통해 횡단면의 대표 이미지. (E)는 AAV1의 크로스 섹션의 대표 이미지. 척추 코드의 CAG.flex.eGFP 불리고 GlyT2::Cre 마우스의. 파선 회색 물질의 개요, 척수의 표면 등 쪽 뿔을 나타냅니다. 스케일 바 C = 1 m m, D = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 척추 Cre 표현 기능 조작 Glycinergic 신경
(A + B) AAV1의 intraspinal 주사의 도식 적인 그림. EF1a.flex.DTA (A) 또는 한 AAV1. 요 추 척수로 EF1a.flex.hM3Dq (B) . Pharmacogenetic 디자이너 수용 체 hM3Dq의 Cre 종속 식 GlyT2 신경에 의해 다시 렌더링 하는 동안 Cre 종속 표현의 디프테리아 독 소 조각 A (DTA) glycinergic 신경 (GlyT2 +) (A)의 절제 이어질 것입니다. clozapine N 산화물 (CNO) (B). (C) AAV1의 3 개의 주사. EF1a.flex.DTA GlyT2::Cre 마우스의 L3-L5 세그먼트로 각 세그먼트는 동측의 아니지만의 contralateral 측면에서 억제 뉴런의 표시 손실에 지도 했다. (D) 손실의 GlyT2 신경 주사 AAV1 GlyT2::Cre 마우스의 동측 뒷 발에 기계적 폰 Frey 자극에 오랫동안 과민성을 되 살려. EF1a.flex.DTA, 하지만 아무 변화가 Cre 음수가 마우스 주입 했다 관찰 했다. ((E)) 손실의 GlyT2 신경 갖는 자연 스러운 혐오 동작 만성 가려움의 연상입니다. (F) hM3Dq 중재 활성화 GlyT2 신경의 pinprick 자극에 의해 evoked 유해 기계적 통증 완화. (G) hM3Dq 중재 활성화 GlyT2 신경의 감소 (클로로퀸 또는 히 스타 민) pruritogen-혐오 행동을 불러 일으켰다. 데이터 평균 ± SEM.로 표시 됩니다 * * * p < 0.001; p < 0.01입니다. C 바 규모 1. g = = 그램. 이미지를 다시 사용 하 고 양 외 에서 수정 7 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: RORβ 표현 세포의 유전과 바이러스 중재 라벨. (A) RORβCre;에 Cre 종속 표현의 형광 tdTomato 기자에 대 한 전략을 보여 주는 다이어그램 Rosa26lox-정지-lox-tdTomato (R26톰) 쥐. (B) Immunostaining RORβCre;의 척수 부분에 R26톰 쥐 밝혔다 NeuN + RORβ-톰 뉴런 하기 IV에서 찾을 수 있습니다. (C) tdTomato의 Cre 종속 표현 또한 GFAP + RORβCre; 세포에서 관찰 되었다 RORβ은 개발 중 이다에서 표현 제안 R26톰 쥐 화살촉 표시 lamina III에에서 두 번 표시 이다. (D) 다이어그램 RORβCre 쥐 tdTomato의 드라이브 로컬 Cre 종속 식으로 AAV-플렉스-톰 (rAAV1.CAG.flex.tdTomato) 바이러스의 intraspinal 주입을 보여주는. AAV-플렉스-톰 바이러스 주입 RORβCre 쥐의 척수 부분에 (E) Immunostaining. RORβ-톰 신경 척수 등 쪽 뿔의 표면 하기에 현지 했다 및 tdTomato의 표현 했다 결 석에서 이다. (F) 비율의 RORβ-톰 셀 신경 마커 NeuN RORβCre;의 척추 부분에 표현 R26톰 마우스 그리고 RORβCre 쥐 AAV-플렉스-톰 바이러스 주입. (G-H) (G) RORβCre;의 척수 부분에 Immunostaining R26톰 마우스 및 RORβ 톰 신경 억제 마커 Pax2 나는 흥분 성의 마커 Lmx1b. (I) 비율의 RORβ-톰 사이 colocalization를 보여주는 AAV-플렉스-톰 바이러스 주입 (H) RORβCre 쥐 Lmx1b와 Pax2 RORβCre;에서 뉴런 R26톰 마우스 그리고 RORβCre 쥐 AAV 톰 바이러스 주입. 데이터는 평균 ± SEM. 데이터는 2-3 마우스와 마우스 당 1-3 섹션으로 표시 됩니다. 스케일 바는 100 µ m (B, E) 및 20 µ m (높은 확대 이미지, G 및 HC, E )를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: 끌어당기는 설정

저자는 공개 없다.