나노 입자와 그들의 항균 활동 및 세포 독성 속성의 평가 수정 다중 벽 탄소 나노튜브의 합성

요약

이 연구에서는 항균 나노 multiwalled 탄소 나노튜브의 산 성 산화 및은 나노 입자의 연속적인 감소 증 착에 의해 합성 되었다. 항균 성 활동 및 세포 독성 테스트 준비로 나노 수행 했다.

초록

본이 연구에서는 다중 벽 탄소 나노튜브 (MWCNTs) 산소 기반 기능 그룹을 형성 하는 수성 황산 솔루션으로 치료 했다. 실버 MWCNTs 실버 AgNO₃ 산화 MWCNTs의 수성 해결책에서의 감소 증 착에 의해 준비 되었다. CNTs의 독특한 색깔을 감안할 때, 그것은 최소 억제 농도 또는 때문에 그들은 방해는 분석 실험 독성 및 항균 속성을 평가 하는 미토 콘 드리 아 독성 분석 실험에 적용 가능 하지 않았다. 저해 영역과 Ag-MWCNTs에 대 한 최소 살 균 농도 측정 하 고 라이브/죽은 Trypan 블루 분석은 CNTs의 색을 방해 하지 않고 독성 및 항균 속성을 측정 하는 데 사용.

서론

이 연구의 궁극적인 목표는 그 양식을 biofilms 박테리아의 성장을 억제할 수 있는 친환경 항균 나노 재료를 만드는 것입니다. 이러한 항균 나노 일반적으로 사용 된 화학 제품 또는 항생제 화합물의 독성 및 항생제 저항 문제를 극복할 가능성이 있다. biofilm 수 화 된 세포 외 고분자 물질 (EPS) 다 당 류, 단백질, 핵 산, 지질^1,2의 구성 이다. Biofilms는 이물질의 침입을 방지 하 고^3,4적극적으로 성장 하는 박테리아를 도움이 됩니다. Biofilms 발생할 냄새 및 만성 전염병^5,6. Methylobacterium spp., 예를 들어 물 있으면 항상 또는 에어컨 열교환기, 샤워 룸, 의료 기기 등 지속적으로 세균 박멸을 보장 하기 어려운 장소에 준수에 의해 성장. 이러한 유형의 biofilms 발생할 냄새 및 만성 전염병^5,6.

일반적으로, 화학 제품 또는 항생제 화합물 biofilms를 형성 하는 박테리아의 성장을 억제 하는 데 사용 됩니다. Vivo에서 화학 물질의 안전에 대 한 우려 및 항생제 내성 박테리아의 출현 biofilms의 대형을 방지 하 고 박테리아의 성장을 억제 하는 새로운 재료를 개발 하는 필요를 몰고 있다.

이 연구에서는 항균 나노 항 생 저항 및 독성에서 무료로 합성 됩니다. 유명한 항균 물질 이며 nanoscience 및 나노기술의 최근 개발 활성 연구 금속 나노 입자^7,8의 항균 효과로 이어졌다. 최근 연구는 작은 크기와 높은 표면 볼륨 비율은 나노 입자의 항균 활동 증가^9,,1011에 결과 보고 있다.

여기에 소개 하는 나노 증가 항균 특성 및 높은 종횡비, 단위 부피 당 표면적을 증가 탄소 나노튜브 실버 나노 입자를 결합 합니다. 조작된 실버 나노 탄소 나노튜브 합성 상당한 항균 특성 및 인간과 동물 세포에 최소한의 독성을 전시 한다. 이전 연구에서 합성 프로세스 등 NaBH₄, formamide, dimethylformamide, 히드라 진 위험 감소 시키는 대리인을 사용합니다. 과정은, 위험, 복잡 하 고 시간이 많이 걸리는. 합성 과정 보고 여기 훨씬 덜 위험 감소 시키는 대리인으로 에탄올을 사용 하 여.

금지 영역 및 Ag-MWCNTs에 대 한 최소 살 균 농도 (MBC) 측정 되었다; 라이브/죽은 고 Trypan 블루 분석 실험 독성 및 항균 특성을 측정 하기 위해 사용 되었다. 최소 억제 농도 (MIC)와 미토 콘 드리 아 독성 (MTT) 분석 실험 이었다는 분석 방해는 것는 탄소 나노튜브의 특이 한 색상 때문에 수행 되지 않습니다. 마지막으로, 포유류 세포를 영향을 주지 않고 Methylobacterium 종 의 성장을 방지 하기 위해 최소 농도 결정 했다.

프로토콜

1. MWCNT 산화

1. 50 mL 유리병으로 MWCNT의 30-50 밀리 그램을 측정 합니다. 천천히 그래서 H₂의 8 mL을 추가₄: 피 펫 1 mL 피 펫 팁으로 HNO₃ 솔루션 (90% 초기 농도, 3:1 vol/vol).
   주의: 화학 증기 두건이이 준비를 실시 해야 합니다.
   1. 발열 반응 완료에 대 일 분을 허용 합니다.
2. MWCNT 유리병의 바닥에 침전 될 때까지 60-80 ° C와 160 W 1 h에서 솔루션을 sonicate.
   주의: 수 위는 sonicator 해야 유리병의 상단 보다 낮은 그래서 물을 유리병에 도입 되지 것입니다.
3. 원심 분리기 튜브에 솔루션을 전송.
   1. micropipette 추가할 증류수의 30 mL dropwise MWCNT-COOH 솔루션.
      주의: 강한 발열 반응 증류수의 추가 발생합니다. 증류수를 천천히 추가 하 고 냉각을 위한 시간을 허용 합니다.
4. 12000 x g와 15 분 동안 실 온에서 MWCNT-COOH 솔루션 원심
   주의: 원심 분리기를 작동 하는 경우는 원심 분리기 샘플 튜브 반대 같은 무게로 튜브를 배치 하 여 균형 유지 확인 하십시오.
5. 상쾌한 피 펫 및 1 mL 피 펫 팁을 제거 합니다. 피 펫 및 1 mL 피 펫 팁 에탄올 5 mL를 추가 합니다. 추가적인 pipetted 에탄올과 유리병의 벽을 씻어. 12000 x g와 15 분 동안 실내 온도에 솔루션 원심
   1. PH 종이 상쾌한의 pH를 결정 합니다. 세척 및 centrifuging 표면에 뜨는 pH 중립 될 때까지 반복 합니다.
6. 모든 상쾌한을 제거 합니다. 침전 하 고 솔루션에서 MWCNT-COOH를 균등 하 게 분산을 증류수 1 mL를 추가 합니다. 건조까지 진공에서-60 ° C에서 솔루션을 freeze-dry.

2. 실버 나노 입자 증 착 MWCNTs에

1. 50 mL 원뿔 튜브에서 MWCNT-COOH의 10 mg을 놓고 30 mL의 증류수로 희석 합니다. 60 ° C와 160 W 1 h 솔루션 sonicate
2. 0.1 N AgNO₃ 의 6 mL 50 mL 원뿔 튜브에 배치 하 고 18 mL의 증류수로 희석. 60 ° C와 160 W 1 h 솔루션 sonicate
   주의: Ag의 총 질량은 20%를 초과 하지 않는 그런 MWCNTs의 총 질량에 비례하여 AgNO₃ 를 추가 합니다.
3. 어 그 노₃ 솔루션 dropwise를 추가 피 펫 및 1 mL 피 펫 팁 MWCNTs 솔루션 sonicating 60 ° C와 160 AgNO₃을 추가한 후 1 시간에 대 한 계속 sonicating W.에 혼합 하는 동안 합니다.
4. 12000 x g와 15 분 동안 실내 온도에서 용액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 원심 솔루션 및 제거는 상쾌한 두 추가 시간.
5. Ag-MWCNTs 혼합물을 1 mL의 증류수를 추가 하 고 솔루션에 균등 하 게 침전을 분산. 에탄올의 5 mL을 추가 하 고 허용 1 시간 실 온에서 진행 하는 반응.
6. 12000 x g와 15 분 동안 실내 온도에서 용액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
7. PH 종이 상쾌한의 pH를 결정 합니다. 세척 및 centrifuging 표면에 뜨는 pH 중립 될 때까지 반복 합니다.
8. Ag-MWCNTs를 1 mL의 증류수를 추가 하 고 솔루션에서 균등 하 게 분산. 24 h에 대 한 진공에서-70 ° C에서 솔루션 freeze-dry

3. 존의 저해 시험

1. 18.12 g R2A 한 천 1 L 플라스 크에 증류수의 믹스. 15 분 동안 121 ° C에 압력솥에 혼합 소독.
2. 실내 온도에 냉각 젤을 허용 합니다. 단단한 매체를 준비 하는 경화 전에 접시에 젤의 10 mL를 배치 합니다.
3. 단단한 매체에 박테리아의 장소 100 µ L. 스프레더를 사용 하 여 단단한 매체에 박테리아를 확산.
   주의:이 절차는 알코올 램프로 조명 화학 증기 두건에서 실시 해야 합니다.
4. 48 h 30 ° C에서 요리를 품 어.
5. 3.12 g R2A 국물의 1 L 플라스 크에 증류수의 믹스. 15 분 동안 121 ° C에 압력솥에 혼합 소독.
6. 루프와 바늘을 사용 하 여 액체 매체에 성장된 식민지를 전송 하 고 180 rpm와 30 ° C에 인큐베이터에서 품 어
7. 600에서 UV 분 광 광도 법에 의해 OD (광학 밀도) 값을 기록 세균성 성장을 측정을 시간 단위로 nm.
   참고: R2A 한 천 R2A Methylobacterium 종 의 성장 위한 선호 한 때문에 표준 뮬러-힌 튼 천 보다는이 테스트에 사용 된
8. 하단 agar를 준비 하는 페 트리 접시에 준비 된 R2A 한 천의 장소 10 mL.
   1. 3.12 g R2A 국물과 한 천의 8 g 1 L 증류수의 믹스. 하단 agar에이 젤의 15 분 장소 10 ml 121 ° C에서 압력솥에 혼합 소독.
9. 50 µ L는 micropipette 살 균 종이 디스크에 Ag MWCNTs 솔루션의 로드.
   1. 건조 하 고 30 분 동안 자외선에서 진공 챔버에 Ag MWCNTs 샘플을 소독.
10. Agar에 장소 Ag-MWCNTs 샘플입니다.
11. 48 h 30 ° C에서 한 천 배지를 품 어.
12. 저해¹²의 측정 영역입니다.
    참고: 사용 하는 소프트웨어에 대 한 지침 참조에 포함 되어 있습니다.

4. 항균 테스트

1. 반복 단계 3.1을 3.7 세균성 문화를 준비 합니다.
2. 최대 OD에서 피 펫과 100 µ L 마이크로 피 펫 팁 신선한 액체 매체의 3 mL에 박테리아의 100 µ L를 접종.
3. 5 준비 15 mL 원뿔 튜브에 제어 솔루션의 50 µ L 샘플. 각 관을 다음을 추가: 1) 메탄올; 2) 1000 µ g/mL MWCNT-COOH; MWCNTs-3) 50 µ g/mL Ag; MWMWCNTs-4) 40 µ g/mL Ag; MWCNTs-5) 30 µ g/mL Ag.
4. 컨트롤은 위에서 설명한 대로 UV 분 광 광도 법에 따라 극대로 활성화 될 때까지 180 rpm와 30 ° C에서 품 어.
5. 각 샘플의 OD 값을 측정 하 고 마이크 농도 계산. OD 값은 샘플 국물에 세균성 세포의 수와 직접적인 관련이 있습니다.
6. 스프레더와 고체 매체에 교양된 박테리아 확산.
7. 48 h 30 ° C에서 접시를 품 어.
8. 세균성 식민지 및 측정 CFU 값 항균 활동¹²을 계산 합니다.
   참고: 사용 하는 소프트웨어에 대 한 지침 참조에 포함 되어 있습니다.

5. 생존 분석 결과

1. 인큐베이터에서 배양 세포를 제거한 후 매체를 흡입 하 고 PBS의 5 mL의 dropwise 워시로 세 번 세척.
2. 1 분 후 씻어 셀 및 흡입에 PBS에 트립 신-EDTA의 1 mL 추가 합니다.
   1. 붙어 세포를 제거 하 고 접시를 누릅니다.
3. DMEM (Dulbecco의 수정이 글의 중간)의 5 mL을 추가 하 고 셀을 제거 합니다. 3 분 x 200g에 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
   1. DPBS와 섞어 1 mL를 추가 합니다.
   2. 자동 셀 카운팅 기계 솔루션의 10 µ L에서 세포를 계산.
      참고: 셀 계산 기계 사용에 대 한 지침 참조¹³에 포함 됩니다.
4. 장소 1 × 10⁵ DMEM 솔루션을 포함 하는 6-잘 접시에 잘 당 AML12 세포의. 매체에는 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 살 균 항생제 포함 되어 있습니다.
5. 5% CO₂/95% 공기 환경에서 37 ° C에서 8 ~ 12 h에 대해 품 어.
6. 흡입 한 흡 인기와 우물에서 상쾌한.
   1. 제어, NMS DMSO (디 메 틸 sulfoxide) 및 30-40 µ g/mL Ag MWCNT DMEM 1 mL의 구성 하는 각 샘플을 추가 합니다.
   2. 8 h 5% CO₂/95% 공기 환경에서 37 ° C에서 품 어.
7. 5 mL의 PBS로 세척 하 고 표면에 뜨는 샘플을 제거 합니다.
8. 셀에 dropwise 준비 라이브/죽은 키트 (µ 2 mM EthD-1 20 L의 PBS의 10 mL에 DMSO에 4 m m calcein 오전 5 µ L)의 1 mL를 추가 합니다.
9. 100 X 300 X에서 표준 형광 현미경으로 room temperature 30-45 분 또는 10 분 측정 형광에 대 한 37 ° C에서 품 어.

6. Trypan 블루 분석 결과

1. 5.6.2 위의 통해 5.1 단계에 따라 샘플을 준비 합니다.
2. 상쾌한을 제거 합니다.
3. 1 x DPBS의 1 mL 접시 세척 하 고 가만히 따르다.
4. 접시 및 문화에서 셀 분리에 3 분 동안 품 어 trypsin의 1 mL를 추가 합니다. 세포 배양 매체를 사용 하 여 접시를 세척 하 고 세포를 수집. 15 mL 튜브에 수집 된 셀 놓습니다.
5. 튜브 200 g x 3 분 동안 4 ° C에서 원심
6. 상쾌한을 삭제 합니다. 1 mL 신선한 매체의 셀 펠 릿을 추가 하 고 셀을 다시 해산.
7. 분산 된 세포의 10 µ L trypan 블루의 10 µ L을 추가 하 고 자동 셀 카운팅 기계 셀을 카운트.
   참고: 셀 계산 기계 사용에 대 한 지침 참조에 포함 되어 있습니다.

결과

전송 전자 현미경 (TEM) 이미지 Ag-MWCNTs (그림 1A 및 1B)의 형성을 확인합니다. 그들의 성공적인 합성 표면에 변화에 의해 확인 되었다. MWCNTs에 Ag 입자의 크기 계산 (그림 1C). 평균 입자 크기는 약 3.83 nm. Ag-MWCNTs로 합성의 XRD 패턴 그림 1D에 표시 됩니다. MWCNT;에 해당 하는 피크에 20-30 ° 나머지 봉우리 Ag에 해당합니다. 항균 성 활동 데이터는 그림 2에 표시 됩니다. 세균성 식민지 인구 Methylobacterium 컨트롤 (그림 2A);에 의해 확인 되었다 메탄올의 추가 감소 인구 10

토론

여기, 우리는 예금 된 Ag 나노 입자와 MWCNTs의 준비에 대 한 간단한 방법을 보고합니다. 이 포함 하는 실버 접한 상당한 항균 활동 및 본문에은 나노 입자의 통제 흡수에 대 한 최소한의 가능성을 보여 줍니다. 우리는 입증 합성된 Ag-MWCNTs의 30 µ g/mL는 포유류 간 세포를 무시할 수 세포 독성 Methylobacterium 종 에 대 한 항균 활동의 효과적인 수준. 상업 분야에 확장 하기 전에 추가 개선 및 biosafety 평가 Ag-MWCNTs에 대 한 요구는 환경 친화적이 고 저렴 한 Ag-MWCNTs를 생산 도울 수를 환 원제로 서 에탄올을 사용 하 여.

다음 포인트는 설명 했다. 다양 한 유형의 개발된 나노 재료와 박테리아를 파괴 하는 것이 가능 하다. 나노 입자 예금 될 수 있는 나노튜브 표면에 여러 사이트를 가능 하다. 항균 속성 크기와 표면에 예금 된은 나노 입자의 수를 제어 하 여 맞출 수 있습니다. 개발 된 나노 세균 세포에 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.1 N 질산은	SIGMA-ALDRICH	1090811000
탄소 나노 튜브, 다중 벽	도쿄 화학 공업 주식 회사	308068-56-6
R2A 한천	MBcell	MB-R1129
R2A 국물	MBcell	MB-R2230
Methylobacterium spp.	KCTC	12618	from Korea Collection for Type Cultures 대전 한국 12618, 대전, 한국
LIVE/DEAD Cell imaging Kit	ThermoFisher SCIENTIFIC	R37601
AML12			from Chungnam University, Dajeon, Korea
human PBMC	ATCC	PCS-800-011
TEM	JEOL	JEM-2100F
XRD,	RIGAKU	D/MAX 2500	Cu K 광자 소스 (40kV, 100mA)
JuLI Br	NanoEnTek	JULI-BRSC