RNA 방해의 실용적인 사용: Liposome 캐리어 바퀴벌레에 대 한 이중 가닥 RNA의 구두 납품

요약

이 원고는의 리에 이중 가닥 RNA의 구강 섭취를 통해 독일 바퀴벌레는 midgut에 유전자 발현의 고갈 보여 줍니다.

초록

RNA 간섭 (RNAi) 수많은 유전자의 생물 학적 기능을 잠복 근무에 대 한 광범위 하 게 적용 하 고 필수 유전자 발현의 중단에 의해 해충 제어 도구 운영으로 envisaged 되었습니다. 다른 메서드를 주입, 먹이, 및 몸을 담글, 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 배달에 대 한 보고 되었습니다, 비록 구두 전달의 dsRNA 통해 RNAi의 효율은 매우 다른 곤충 집단 변수. 이전에 게시 하는 많은 연구에 의해 표시 된 독일 바퀴벌레, Blattella germanica, dsRNA 주입에 매우 민감한입니다. 현재 연구는 dsRNA liposome 사업자와 캡슐화 midgut 주스 dsRNA의 저하를 지체 시키는 충분 한지 설명 하는 방법을 설명 합니다. 특히, dsRNA 리 크게 캡슐화의 지속적인 먹이 midgut tubulin 식 감소 하 고 바퀴벌레의 죽음에 지도. 결론적으로, 수립 및 활용 dsRNA nucleases에 대 한 보호, dsRNA lipoplexes 수 곤충 해충에 대 한 RNAi의 실제적인 사용을 미래에 있습니다.

서론

RNAi 많은 진핵생물¹dsRNA 분자에 의해 트리거되는 post-transcriptional 입을 통로의 메커니즘을 통해 최저의 유전자 발현을 효과적인 방법으로 입증 되었습니다. 연구의 지난 10 년간, RNAi 주사를 통해 특정 유전자의 표현이 없애고 또는 곤충^2,3의 다양 한 taxa에 dsRNA의 먹이로 동작을 개발에서 유전자의 기능 연구를 유용한 도구가 되고있다. 특이성 및 고갈 시키는 효과의 견고성, RNAi의 응용 프로그램은 현재 해충 제어 관리^4,5에 대 한 잠재적인 전략으로 간주 되고있다. 그러나, RNAi의 효율 대상 다른 유전자 전달 방법에 따라 곤충 종 사이 널리 다릅니다. 증거의 성장 몸은 ribonucleases에 의해 타락은 dsRNA의 불안정 RNAi^5,6의 제한 된 효능에 중요 한 요소는 나왔다. 예를 들어, Manduca sexta 에 낮은 RNAi 감도 사실 hemolymph 섞인 dsRNA 신속 하 게 저하 1 시간⁷에 의해 설명 되어 있다. 유사 하 게, 효율적으로 섭취 dsRNA 저하, midgut에서 알칼리 nucleases의 존재 다른 곤충 순서^8,,910낮은 RNAi 효율성과 강하게 상관 된다.

DsRNA의 구두 전달 특히 해충 제어 전략에 RNAi의 응용 프로그램에 대 한 흥미 롭 지만 midgut에 nucleases에 의해 dsRNA의 저하를 지체 하는 방법을 하지 아직 개발 되었습니다, 어떤 효과적인 보장을 했합니다 먹이 통해 RNAi입니다. 그러나, 구두 전달의 dsRNA에 RNAi의 응답 다량 dsRNA, 누에나방에 예를 들어 50 µ g의 먹이 또는 지속적으로 8 일 (총에서 8 µ g dsRNA) 메뚜기 종에서 먹이 보고 되었습니다. 독일 바퀴벌레, Blattella germinica, dsRNA^11,12,,1314의 주입에 의해 RNAi에 매우 민감 하지만 먹이 통해 dsRNA에 응답 하지 않습니다. 최근, 린 외. 그는 dsRNA liposome 사업자 결과 최저에 성공적인 RNAi에 α-tubulin 유전자 발현에에서 캡슐화 독일 바퀴벌레¹⁵midgut 및 트리거 상당한 사망률 (2017) 증명. DsRNA는 midgut에의 저하는 구두 RNAi에 대 한 제한 요소, liposome 사업자 저하, 쉽게 다른 곤충에 적용 가능한 용기에 강한 nuclease 활동에서 dsRNA를 보호 하기 위해 차량으로 서브. 메모, 특정 transfection 시 약을 선택 하기 위한 이유의 현재 프로토콜에서 liposome 캐리어는 그것 테스트 되었습니다 곤충 세포 선 transfection에 대 한 더 적은 독성으로 사용 ( 재료의 표참조)에 따라에 제조 업체의 지침입니다. Gharavi 외 에 다른 liposome transfection 시스템의 비교에 따르면 (2013) ¹⁶, transfecting 작은 간섭 RNA (siRNA)의 효율은 약이 고 다른 곤충^{17,18 dsRNA 전달 시스템에 사용 된 다른 상용 시스템 사이의 동일} . 또한, 우리의 먹이 방법은 충분히 신중 하 게 각 바퀴벌레에 의해 dsRNA의 적절 한 양을 섭취 하 고 결과 강력 하 고 확인 합니다. 요약 하자면, 현재 프로토콜 및 결과 dsRNA 안정성 향상 dsRNA lipoplexes를 사용 하 여 하는 해충에 대 한 유망한 접근 미래에 RNAi의 전략 구두 납품의 디자인에 문을 열어 보여줍니다.

프로토콜

1. 합성 및 dsRNA의 준비

1. 대상 유전자의 3' 되지 않은 지역에 dsRNA 대상 사이트를 식별 합니다. Α-tubulin (욕조) 유전자를 대상으로 사용 되는 dsTub (은행 승인 번호: KX228233), 그리고 dsEGFP의 순서에서 부정적인 dsRNA 제어 설계 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP; 은행 승인 번호: LC311024).
2. T7 발기인 순서를 포함 하는 유전자 특정 뇌관으로 dsRNA 템플릿 합성 표준 PCR 증폭을 수행 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). 린 외PCR 증폭 조건 및 사용 되는 뇌관 정보 그 보고 있습니다. (2017) ¹² ( 재료의 표참조).
3. DsRNA 준비 T7 전사를 사용 하 여 계속 키트 ( 재료의 표참조), 제조업체의 지침에 따라.
   참고: 높은 수량 dsRNA를, (총 40 µ L)에서 1 개의 관에 2 개의 반응을 혼합 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어.
4. 2 µ L DNase의 추가 ( 재료의 표참조) 다이제스트 DNA 템플릿에 37 ° C에서 15 분 동안 dsRNA 샘플으로.
5. 추가 200 µ L 추출 시 약 ( 재료의 표참조) 40 µ L 클로 프롬, 그리고 소용돌이.
6. 4 ° C에서 13000 x g에서 10 분 동안 centrifuge 다음 새로운 microcentrifuge 튜브에 상쾌한 (150 µ L)를 수집 합니다.
7. 150 µ L 소 프로 파 놀을 추가 하 고 얼음에 15 분 동안 잠복기 여 dsRNA를 침전.
8. 4 ° C에서 13000 x g에서 15 분 동안 centrifuge 다음 상쾌한을 제거 합니다.
9. DsRNA 펠 릿을 세척을 70% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기
10. 에탄올을 제거 하 고 에탄올 세척 단계를 반복 합니다.
11. 에탄올과 3 분 동안 원심 진공 집중 하 여 펠 렛 건조 dsRNA 다음 RNase 무료 물 dsRNA를 resuspend.
12. 마이크로 볼륨 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 순화 dsRNA의 수량을 결정 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라 고 원하는 농도 (예를 들면,의 준비를 위해 µ 0.25 µ g/L dsRNA lipoplexes)입니다.
13. 최대 3 개월 동안-20 ° C에서 dsRNA 샘플을 저장 합니다.

2입니다. dsRNA Lipoplexes의 준비

1. Transfection 시 약의 4 µ L를 희석 ( 재료의 표참조) 5% 포도 당 솔루션의 4 µ L을 추가 하 여. 5% 포도 당 솔루션의 4 µ L을 추가 하 여 (1 µ g) dsRNA의 4 µ L를 희석.
2. 추가 희석된 liposome 시 약 해결책 즉시 희석된 dsRNA 솔루션으로 한 번에. 짧게 그들을 혼합 하 25 ° c.에 15 분 동안 품 어 소용돌이
   참고: 역순으로 솔루션을 혼합 하지 마십시오.
3. DsRNA lipoplexes 사용 하기 위해 준비가 되었습니다. 준비, 1 시간 이내 사용 하 고 1 시간 후 삭제.
   참고: 제조업체의 지침에 따라 lipoplexes는 가능한 빨리 사용 되어야 한다.

3. Hemolymph Midgut 주스에서 세포 외 효소의 수집

1. 곤충 염 분 버퍼 (10 x 주식)
   1. 두 배 증류수 109.3 g NaCl, KCl 15.7 g, 6.3 g CaCl₂와 8.3 g MgCl₂·6H₂o. 900 mL를 혼합
   2. PH 6.8를 조정 하 고 최대 1000 mL를 채우기.
2. Hemolymph 컬렉션
   1. 그들은 3 분 동안 이동 하지 않습니다 때까지 얼음에 바퀴벌레를 anesthetize.
   2. 바퀴벌레 (엄지와 검지 손가락), 두 손가락으로 누른 바퀴벌레의 복 부 측을 올려.
   3. 해가 위를 사용 하 여 뒷 다리의 고관절의 끝을 잘라.
      참고: 고관절 및 trochanter 사이의 연결된 교차로 잘라. 고관절의 다른 부분의 절단 hemolymph를 수집 하는 비효율적 이었다.
   4. 부드럽게 가운데 손가락으로 복 부를 짜 내 고 10 µ L micropipette 절 개에서 출혈 하는 hemolymph를 수집 합니다.
   5. Microcentrifuge 튜브에 여러 바퀴벌레 (5 개인)에서 hemolymph를 풀.
      참고: Microcentrifuge 튜브 melanization를 방지 하기 위해 얼음에 계속. 남성 바퀴벌레에서 얻은 hemolymph의 평균 볼륨 2-3 µ L 이다.
   6. 10 대 벤치탑 분리기와 짧게는 hemolymph 아래로 회전 s.
   7. 원하는 볼륨 (즉, 10 µ L), hemolymph의 전송 및 1 x 곤충 염 분 버퍼의 50 µ L을 혼합.
   8. Hemocytes 아래로 회전 하 4 ° C에서 1000 x g에서 10 분 원심 분리기. 깨끗 한 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송.
   9. A280¹⁵를 측정 하 여 마이크로 볼륨 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 총 단백질 농도 계량.
   10. 동일한 단백질 농도 (6 mg / µ L의 총 단백질)을 각 샘플을 조정 합니다.
3. Midgut 주스 컬렉션
   1. 얼음에 바퀴벌레 anesthetize 바퀴벌레 복 부 측을 수정 해 부 접시에 찬 1 x 곤충 염 분 버퍼 곤충 핀을 사용 하 여 합니다.
   2. 고급 핀셋으로 복 부를 해 부. 전체 소화 관 (앞, 중간, 그리고 뒷 창 자 포함) 곤충 염 분 버퍼 x 1 신선한 요리를 제거 합니다.
   3. 전면 및 뒷 창 자 제거 하 고 신속 하 게 100 µ L 곤충 염 분 버퍼를 포함 하는 microcentrifuge 튜브는 midgut 전송.
   4. 수영장 6 바퀴벌레 같은 튜브 및 10에 대 한 소용돌이에서 midguts s.
   5. Hemocytes 및 창 자 조직 회전 하 4 ° C에서 1000 x g에서 10 분 원심 분리기. 깨끗 한 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송.
   6. A280¹⁵를 측정 하 여 마이크로 볼륨 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 총 단백질 농도 계량.
   7. 동일한 단백질 농도 (6 mg / µ L의 총 단백질)을 각 샘플을 조정 합니다.

4입니다. dsRNA 저하 분석 결과

1. 갓 벗은 dsRNA의 dsRNA lipoplexes (1 µ g) 4 µ L를 준비 합니다.
2. 믹스 hemolymph, 또는 midgut dsRNA 솔루션 곤충 염 분 버퍼 (제어)의 10 µ L 추출 효소 주스.
3. EGTA (20mm) 또는 RNase 무료 물 효소 활동의 저해에 대 한 컨트롤 샘플을 2 µ L를 추가 합니다.
4. 1 시간 또는 더 많은 (6, 12, 또는 24 시간) 25 ° c.에 품 어
5. 200 µ L 추출 시 약 및 40 µ L 클로 프롬, 소용돌이 다음을 추가 합니다.
6. 4 ° C에서 13000 x g에서 10 분 동안 centrifuge 다음 새로운 microcentrifuge 튜브에 상쾌한 (150 µ L)를 수집 합니다.
7. 150 µ L 소 프로 파 놀을 추가 하 고 얼음에 15 분 동안 잠복기 여 dsRNA를 침전.
8. 4 ° C에서 13000 x g에서 15 분 동안 centrifuge 다음 상쾌한을 제거 합니다.
9. DsRNA 펠 릿을 세척을 70% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기
10. 에탄올을 제거 하 고 에탄올 세척 단계를 반복 합니다.
11. 에탄올과 10 µ L RNase 무료 물으로 3 분 Resuspend dsRNA에 대 한 원심 진공 집중 하 여 펠 렛 건조 dsRNA 제거 합니다.
12. 1.5 %agarose 젤에 젤 전기 이동 법을 통해 치료 dsRNA의 무결성을 확인 하십시오.

5. 구강 관리 dsRNA의

1. 건조 식품 (차 개)의 광고 libitum 다이어트 바퀴벌레를 유지 합니다. 바퀴벌레에서 물 공급을 하루 dsRNA 섭취 실험 전에 박탈.
2. 유연한 집게 (그림 1, 5 단계)와 함께 그것의 날개를 잡아 하 여 바퀴벌레를 잡아.
   참고: 바퀴벌레의 신체 부위를 잡아 하지 마십시오.
3. 준비는 dsRNA lipoplexes, 뿐만 아니라 벌 거 벗은 dsRNA, 먹이, 단원 2에서에서 설명한 대로.
   참고: DsRNA lipoplexes 먹이 기 전에 갓 준비 되어야 한다.
4. DsRNA lipoplexes 또는 벌 거 벗은 dsRNA의 4 µ L를 피드 (250 ng)는 micropipette와.
5. 천천히 피펫으로 dsRNA 솔루션의 방울, 바퀴벌레의 mouthparts에 가까운 고 바퀴벌레는 물방울을 완전히 섭취.
6. 8 일 또는 16 일 지속적으로 섭취 실험을 하루에 두 번 (1 시간 후에 빛 고을 조명 하기 전에 1 시간)을 수행 합니다.
   참고: 모든 바퀴벌레는 물만 섭취 실험 동안 dsRNA 해결책 또는 제어 시 약 (예를 들어, nuclease 무료 물, 포도 당 솔루션 및 liposome 시 약)와 수동 먹이 통해 인수.
7. DsRNA 실험의 섭취의 16 일 후 바퀴벌레에 물병을 제공 합니다.

6. 최저 평가

1. 선택한 시간에 포인트 (2, 9, 17 일 dsRNA 섭취 분석 결과 후), dsEGFP 및 dsTub 처리 곤충을 수집 하 고 (예를 들어, midgut) 선택한 조직 해 부.
2. 실시간 양이 많은 PCR (qRT-PCR)을 수행 합니다. QRT-PCR 증폭 조건 및 뇌관 정보 린 외에서 보고. (2017) ¹².
3. 평가 dsRNA 치료 곤충 매일 사망률을 확인 하 고는 더 이상 바퀴벌레를 제거 하 고 제어 합니다.

결과

DsRNA의 구두 전달 프로토콜의 단순화 된 구조는 그림 1, dsRNA lipoplexes의 준비에 대 한 주요 단계 표시 됩니다에 표시 됩니다.

B. germanica, 비보 전 분석 결과 dsTub lipoplexes midgut 주스 incubated 했다 실시 됐다는 dsRNA의 무결성의 midgut 주스에서 dsRNA 저하 시 liposome 사업자에 의해 주어진 보호를 조사 하기 위하여 이후에 1.5 %agarose 젤에 분석 했다. 그림 2 는 반면 liposome 사업자 비보 전 에서 1 시간 이상 저하에 대 한 dsRNA를 보호 하기 위해 수 있었다 강한 RNA nuclease 활동 midgut 주스의...

토론

이 프로토콜은 독일 바퀴벌레의 midgut 주스에서 ribonuclease 소화에 대 한 보호를 포함 하는 dsRNA lipoplexes의 구두 배달을 통해 효과적인 RNAi에는 메서드를 제공 합니다. 다양 한 곤충 종에 다른 연구에서와 같이, 구두 전달의 dsRNA 통해 가난한 RNAi 효과 대부분 차지 dsRNA^8,,910의 저하에 의해. 이 프로토콜은 구두 전달의 dsRNA에에서 저하에 대 한 보호 차량으로 봉사 하는 리를 생성 합니다. 또한, dsRNA lipoplexes의 준비는 간단 하 고 쉽게 구강 RNAi로 적용 특히 곤충에에서 강한 ribonuclease 활동에 대 한.

다른 곤충^10,,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
GenJe Plus DNA in vitro Transfection 시약	SignaGen	SL100499	리포플렉스 준비를 위한
Blend Taq plus	TOYOBO	BTQ-201	PCR
Fast SYBR 그린 마스터 믹스	ABI		qPCR FirstChoice
RLM-RACE 키트	Invitrogen	AM1700	3' UTR 식별을 위한 4385612
MEGAscript T7 전사 키트	Invitrogen	AMB13345	dsRNA 합성을 위한
TURBO DNase	Invitrogen	AM2239	dsRNA
TRIzol	Invitrogen	15596018	dsRNA 또는 총 RNA 추출을 위한
RQ1 RNase-Free Dnase	Promega	M6101	총 RNA에서 DNA 템플릿을 제거합니다.
클로로포름	dsRNA 또는 총 RNA 추출	Sigma-Aldrich	C2432
	dsRNA 또는 총 RNA 추출	Sigma-Aldrich	I9516
탄올	Sigma-Aldrich	24102	dsRNA 또는 총 RNA 추출용
디에틸 피로카보네이트, DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	RNase 자유 정제
포도당 용액	Sigma-Aldrich		리포플렉스 제제용
염화나트륨, NaCl	시그마-알드리치	S7653	곤충 식염수 완충제 공식
염화칼륨, KCl	시그마-알드리치	P9333	곤충 식염수 완충제 공식
염화칼슘, CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016	곤충 식염수 완충제 공식
마그네슘 클로라이드 육수화물, MgCl2.6H2O	Sigma-Aldrich	M2670	곤충 식염수 버퍼 공식
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	효소 억제제
해부 가위	F.S.T.		바퀴벌레 해부
미세 핀셋	F.S.T.		바퀴벌레 해부
유연한 핀셋	F.S.T.		바퀴벌레 홀딩
피펫맨	RAININ	P10	샘플 준비
마이크로 원심분리기 튜브	Axygen	MCT175C, PCR02C	샘플 준비
피펫 팁	Axygen		샘플 준비
vortexter	Digisystem	vm1000	샘플 준비
Minispin 원심분리기	The Gruffin Group	GMC 206	액체 스핀 다운
원심분리기	ALC	PK121R	시료 전처리
pH 측정기	JENCO	6071	pH 조정
마이크로 볼륨 분광광도계	Quawell	Q3000	핵산 정량
PCR 열 순환기	ABI	2720	주형 PCR 또는  dsRNA 합성 배양
정량적 real-time PCR	ABI	StepOne plus	유전자 발현 정량적
원심 진공 농축기	eppendorf	5301	dsRNA 또는 총 RNA 추출용
멀티펫	Real-Time PCR 시료 로딩을 위한	Eppendorf	xStream
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