이 원고는의 리에 이중 가닥 RNA의 구강 섭취를 통해 독일 바퀴벌레는 midgut에 유전자 발현의 고갈 보여 줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
RNA 간섭 (RNAi) 수많은 유전자의 생물 학적 기능을 잠복 근무에 대 한 광범위 하 게 적용 하 고 필수 유전자 발현의 중단에 의해 해충 제어 도구 운영으로 envisaged 되었습니다. 다른 메서드를 주입, 먹이, 및 몸을 담글, 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 배달에 대 한 보고 되었습니다, 비록 구두 전달의 dsRNA 통해 RNAi의 효율은 매우 다른 곤충 집단 변수. 이전에 게시 하는 많은 연구에 의해 표시 된 독일 바퀴벌레, Blattella germanica, dsRNA 주입에 매우 민감한입니다. 현재 연구는 dsRNA liposome 사업자와 캡슐화 midgut 주스 dsRNA의 저하를 지체 시키는 충분 한지 설명 하는 방법을 설명 합니다. 특히, dsRNA 리 크게 캡슐화의 지속적인 먹이 midgut tubulin 식 감소 하 고 바퀴벌레의 죽음에 지도. 결론적으로, 수립 및 활용 dsRNA nucleases에 대 한 보호, dsRNA lipoplexes 수 곤충 해충에 대 한 RNAi의 실제적인 사용을 미래에 있습니다.
서론
RNAi 많은 진핵생물1dsRNA 분자에 의해 트리거되는 post-transcriptional 입을 통로의 메커니즘을 통해 최저의 유전자 발현을 효과적인 방법으로 입증 되었습니다. 연구의 지난 10 년간, RNAi 주사를 통해 특정 유전자의 표현이 없애고 또는 곤충2,3의 다양 한 taxa에 dsRNA의 먹이로 동작을 개발에서 유전자의 기능 연구를 유용한 도구가 되고있다. 특이성 및 고갈 시키는 효과의 견고성, RNAi의 응용 프로그램은 현재 해충 제어 관리4,5에 대 한 잠재적인 전략으로 간주 되고있다. 그러나, RNAi의 효율 대상 다른 유전자 전달 방법에 따라 곤충 종 사이 널리 다릅니다. 증거의 성장 몸은 ribonucleases에 의해 타락은 dsRNA의 불안정 RNAi5,6의 제한 된 효능에 중요 한 요소는 나왔다. 예를 들어, Manduca sexta 에 낮은 RNAi 감도 사실 hemolymph 섞인 dsRN....
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프로토콜
1. 합성 및 dsRNA의 준비
- 대상 유전자의 3' 되지 않은 지역에 dsRNA 대상 사이트를 식별 합니다. Α-tubulin (욕조) 유전자를 대상으로 사용 되는 dsTub (은행 승인 번호: KX228233), 그리고 dsEGFP의 순서에서 부정적인 dsRNA 제어 설계 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP; 은행 승인 번호: LC311024).
- T7 발기인 순서를 포함 하는 유전자 특정 뇌관으로 dsRNA 템플릿 합성 표준 PCR 증폭을 수행 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). 린 외PCR 증폭 조건 및 사용 되는 뇌관 정보 그 보고 있습니다. (2017) 12 ( 재료의 표참조).
- DsRNA 준비 T7 전사를 사용 하 여 계속 키트 ( 재료의 표참조), 제조업체의 지침에 따라.
참고: 높은 수량 dsRNA를, (총 40 µ L)에서 1 개의 관에 2 개의 반응을 혼합 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어. - 2 µ L DNase의 추가 ( 재료의 표참조) 다이제스트 DNA 템플릿에 37 ° C에서 15 분 동안 dsR....
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결과
DsRNA의 구두 전달 프로토콜의 단순화 된 구조는 그림 1, dsRNA lipoplexes의 준비에 대 한 주요 단계 표시 됩니다에 표시 됩니다.
B. germanica, 비보 전 분석 결과 dsTub lipoplexes midgut 주스 incubated 했다 실시 됐다는 dsRNA의 무결성의 midgut 주스에서 dsRNA 저하 시 liposome 사업자에 의해 주어진 보호를 조사 하기 위하여 이후에 1.5 %agarose 젤에 분석 했다. 그림 2 는 반면 liposome 사업자 비보 전 에서 1 시간 이상 저하에 대 한 dsRNA를 보호 하기 위해 수 있었다 강한 RNA nuclease 활동 midgut 주스의.......
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토론
이 프로토콜은 독일 바퀴벌레의 midgut 주스에서 ribonuclease 소화에 대 한 보호를 포함 하는 dsRNA lipoplexes의 구두 배달을 통해 효과적인 RNAi에는 메서드를 제공 합니다. 다양 한 곤충 종에 다른 연구에서와 같이, 구두 전달의 dsRNA 통해 가난한 RNAi 효과 대부분 차지 dsRNA8,,910의 저하에 의해. 이 프로토콜은 구두 전달의 dsRNA에에서 저하에 대 한 보호 차량으로 봉사 하는 리를 생성 합니다. 또한, dsRNA lipoplexes의 준비는 간단 하 고 쉽게 구강 RNAi로 적용 특히 곤충에에서 강한 ribonuclease 활동에 대 한.
다른 곤충10,,
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 연구는 대만 (사역의 과학 및 기술, 가장 100-2923-B-002-002-MY3 하 고 H.J.L.를 106-2313-B-002-011-MY3)에서 교부 금에 의해 지원 되었다 체코 공화국 (부여 기관 남쪽 보 헤 미아 대학 GAJU 부여 065/2017/P Y.H.L), 및 스페인 ( 스페인 경제와 경쟁력, CGL2012-36251 및 CGL2015-64727-P X.B., 그리고 카탈루냐어 정부에 부여 부여 2014 SGR 619 X.B.); 그것은 또한 경제 및 지역 개발 (X.B. 페더 자금)에 대 한 유럽 기금에서의 재정 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection 시약 | SignaGen | SL100499 | 리포플렉스 준비를 위한 |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | PCR |
| Fast SYBR 그린 마스터 믹스 | ABI | qPCR FirstChoice | |
| RLM-RACE 키트 | Invitrogen | AM1700 | 3' UTR 식별을 위한 4385612 |
| MEGAscript T7 전사 키트 | Invitrogen | AMB13345 | dsRNA 합성을 위한 |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | dsRNA 또는 총 RNA 추출을 위한 |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | 총 RNA에서 DNA 템플릿을 제거합니다. |
| 클로로포름 | dsRNA 또는 총 RNA 추출 | Sigma-Aldrich | C2432 |
| dsRNA 또는 총 RNA 추출 | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 탄올 | Sigma-Aldrich | 24102 | dsRNA 또는 총 RNA 추출용 |
| 디에틸 피로카보네이트, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | RNase 자유 정제 |
| 포도당 용액 | Sigma-Aldrich | 리포플렉스 제제용 | |
| 염화나트륨, NaCl | 시그마-알드리치 | S7653 | 곤충 식염수 완충제 공식 |
| 염화칼륨, KCl | 시그마-알드리치 | P9333 | 곤충 식염수 완충제 공식 |
| 염화칼슘, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | 곤충 식염수 완충제 공식 |
| 마그네슘 클로라이드 육수화물, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | 곤충 식염수 버퍼 공식 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 효소 억제제 |
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| ef1 qPCR리버스 프리머 | 트라이-I 생명공학 | CCT GCA GAG GAA GAA GAA |
참고문헌
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010). ....
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