유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

요약

이 프로토콜 레이블 및 라이브 염색체 mitotic 세포 Histone2B GFP BacMam 2.0 레이블 및 회전 디스크 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 시각화 하는 간단 하 고 편리한 방법을 설명 합니다.

초록

염색체 해야 안정적이 고 균일 하 게 분리 되어 딸 세포에 mitotic 세포 분열 동안. 염색체 분리의 충실도 스핀 들 어셈블리 검사점 (SAC)을 포함 하는 여러 메커니즘을 통해 제어 됩니다. SAC 모든 염색체 kinetochores microtubules 스핀 들에 첨부 하지 않으면 세포 유사 분열 진행의 예방에 대 한 책임은 복잡 한 피드백 시스템의 일부입니다. 염색체 지체 및 비정상적인 염색체 분리 역 기능 세포 주기 통제 검문소의 표시기 이며 셀 분할의 게놈 안정성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. SAC의 규제 완화는 염색체 분리 중 오류의 축적을 통해 악성 세포로 정상 세포의 변화에 발생할 수 있습니다. SAC의 구현 및 복잡 한 kinetochore의 형성 단단히 kinases와 단백질 인산 가수분해 효소 2A 등 인산 가수분해 효소 사이 상호 작용에 의해 규제 됩니다 (PP2A). 이 프로토콜 마우스 미 발달 섬유 아 세포 했다 PP2A B56γ 규제 소 단위의 녹아웃 쥐에서 고립에서 염색체를 후행의 라이브 셀 이미징을 설명 합니다. 이 방법은 다른 세포 주기 제어 이미징 기술 cytometry 또는 immunocytochemistry 같은 염색체의 동적 spatiotemporal 시각화 대신 셀 cytokinesis 상태 스냅숏을 제공의 단점을 극복 동안 유사 분열.

서론

다음 프로토콜에서 우리 염색체 분리 및 마우스 미 발달 섬유 아 세포 히스톤 2B-GFP, BacMam 2.0 라벨 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여에서 세포 주기 동안 mitotic 진행을 시각화 하는 편리한 방법을 설명 합니다.

세포 주기 통제 검문소 염색체 분리를 모니터링 하 고 셀 ^1,2,3의 유전 무결성의 유지 관리에 중요 한 역할. 미 분리 된 염색체의 이수성, 가장 단단한 종양 ⁴의 특징은 발생할 수 있습니다. 따라서, 후행 염색체의 염색체 불안정성을 공부 하는 방법으로 사용할 수 있습니다.

붙일 표시 또는 라이브 염색체 분리를 시각화 하는 데 사용 하 고 mCherry 태그의 생성 하지만 후행 염색체 단백질 수 태그 H2B GFP 단백질 유전자 전달 및 분자 생물학 ⁵의 상당한 지식이 필요 합니다. 여기는 CL-HB는 리 젠 트, 편의 위해이 전화 CellLight Histone2B GFP BacMam 2.0 시 약의 사용에 설명....

프로토콜

이러한 연구에서 실시 한 모든 실험 프로토콜 식품 및 의약품 안전 청 (FDA) 연구 시설에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인에 따라 수행 했다.

1. 격리와 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)의 문화

1. 표준 프로토콜 ^7,,89마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) PP2A-B56γ-마우스 긴장과 야생 타입 littermates에서를 격리 합니다.
2. ExpandMEFs 3 구절에 대 한 동결 하 고 실험 ⁸필요할 때까지 저장 합니다.

2. 2-잘 연 발된 커버 유리에 대 한 자란 Mefs 라이브 영상

1. MEF 성장 미디어 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM/F12)를 포함 하는 10%의 500 mL를 준비 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 X 페니실린/스 항생제, L-글루타민 (200 m m) 및 비 본질적인 아미노산 (NEAA) 500 mL 미디어 병에서 X 1.
2. 37 ° c....

결과

야생 유형 및 PP2A-B56γ-마우스에서 MEFs 2-잘 챔버 커버 유리에 시드 되었고 첨부할 수 있습니다. 하루에 2, MEFs는 0.1%를 사용 하 여 동기화 했다 FBS 24 h에 대 한. 하루 3, MEFs 미디어에서 200 ng/mL에 nocodazole 및 30 PPC CL-HB regentwere 37에서 18 h incubated^{° C, 5 %CO}₂. 하루에 4, 셀은 회전 디스크 confocal 현미경 시스템 (그림 1)를 사용 하 여 몇 군데 있었다. 라이브 세포 이미징 그들은 유사 분열 (그림 2)를 통해 NEBD에서 진행으로 개별 셀의 운명을 시각화 하는 데 사용 되었다. Nocodazole는 G2M 단계에 microtubule 형성 방해 하 여 체포 하는 야생 타입 셀으로 알려져 있습니다. 세포 분열 .......

토론

정확한 염색체 분리를 보장 하는 세포 주기 통제 검문소 방지 이수성 및 셀 변환 ^1,2,3. 현재 연구에서 우리는 PP2A B56γ의 그 비활성화 발견 약화 스핀 들 어셈블리 검사점 귀착되 었 다. 라이브 셀 이미징을 사용 하 여 nocodazole ⁹PP2A B56γ MEFs 유사 분열 동안 염색체 미 분리 처리를 관찰할 수 있었습니다.

이 프로토콜 Histone2B GFP 라벨 라이브 셀 이미징에 대 한 레이블 염색체 BacMam 2.0 기술에 의해 생성 된 사용 합니다. 라벨에 중요 한 단계 중 하나는 셀 라벨 충분 한 달성 하기 위해 (PPC) 당 입자의 권리 금액을 계산 하 고 있습니다. 그것은 10-50 PPC 적합 적정을 통해 발견 되었다. 이 시 약; 세포에.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12	Gibco	11320082
L-글루타민	Gibco	25030081
MEM 비필수 아미노산 용액 (100X)	Gibco	11140050
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수	Gibco	14190144
Trypsin-EDTA	Gibco	25300054
소 태아 혈청	Atlanta Biologicals	S11150
DMSO	EMD Millipore	MX 1458-6
극저온 바이알 보관 상자	Fisherbrand	10-500-28
극저온 바이알	Corning/costar	431416
T75 플라스크	Cellstar	658175
2 웰 챔버 커버 유리	Nunc	155380PK
셀로미터 비전 셀 프로파일러	Nexcelom Bioscience LLC	셀로미터 비전 트리오
노코다졸	시그마	M1404
CellLight 히스톤 2B-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher Scientific Inc.	C10594
Zeiss Cell Observer 회전 디스크 컨포칼 현미경 시스템	Carl Zeiss	현미경 Zeiss Cell Observer SD
수조	Thermoscientific	280 시리즈
인큐베이터	Sanyo 상용 솔루션	MCO-18AIC (UV)
클래스 II 생물 안전 캐비닛	The Baker Company	SterilGard
Axiovision 소프트웨어	Zeiss	Ver.4.8.2
ImageJ 소프트웨어	National Institute of Health	Ver. 1.51r