이 프로토콜 레이블 및 라이브 염색체 mitotic 세포 Histone2B GFP BacMam 2.0 레이블 및 회전 디스크 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 시각화 하는 간단 하 고 편리한 방법을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
염색체 해야 안정적이 고 균일 하 게 분리 되어 딸 세포에 mitotic 세포 분열 동안. 염색체 분리의 충실도 스핀 들 어셈블리 검사점 (SAC)을 포함 하는 여러 메커니즘을 통해 제어 됩니다. SAC 모든 염색체 kinetochores microtubules 스핀 들에 첨부 하지 않으면 세포 유사 분열 진행의 예방에 대 한 책임은 복잡 한 피드백 시스템의 일부입니다. 염색체 지체 및 비정상적인 염색체 분리 역 기능 세포 주기 통제 검문소의 표시기 이며 셀 분할의 게놈 안정성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. SAC의 규제 완화는 염색체 분리 중 오류의 축적을 통해 악성 세포로 정상 세포의 변화에 발생할 수 있습니다. SAC의 구현 및 복잡 한 kinetochore의 형성 단단히 kinases와 단백질 인산 가수분해 효소 2A 등 인산 가수분해 효소 사이 상호 작용에 의해 규제 됩니다 (PP2A). 이 프로토콜 마우스 미 발달 섬유 아 세포 했다 PP2A B56γ 규제 소 단위의 녹아웃 쥐에서 고립에서 염색체를 후행의 라이브 셀 이미징을 설명 합니다. 이 방법은 다른 세포 주기 제어 이미징 기술 cytometry 또는 immunocytochemistry 같은 염색체의 동적 spatiotemporal 시각화 대신 셀 cytokinesis 상태 스냅숏을 제공의 단점을 극복 동안 유사 분열.
서론
다음 프로토콜에서 우리 염색체 분리 및 마우스 미 발달 섬유 아 세포 히스톤 2B-GFP, BacMam 2.0 라벨 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여에서 세포 주기 동안 mitotic 진행을 시각화 하는 편리한 방법을 설명 합니다.
세포 주기 통제 검문소 염색체 분리를 모니터링 하 고 셀 1,2,3의 유전 무결성의 유지 관리에 중요 한 역할. 미 분리 된 염색체의 이수성, 가장 단단한 종양 4의 특징은 발생할 수 있습니다. 따라서, 후행 염색체의 염색체 불안정성을 공부 하는 방법으로 사용할 수 있습니다.
붙일 표시 또는 라이브 염색체 분리를 시각화 하는 데 사용 하 고 mCherry 태그의 생성 하지만 후행 염색체 단백질 수 태그 H2B GFP 단백질 유전자 전달 및 분자 생물학 5의 상당한 지식이 필요 합니다. 여기는 CL-HB는 리 젠 트, 편의 위해이 전화 CellLight Histone2B GFP BacMam 2.0 시 약의 사용에 설명 합니다. 이 시는 즉시 사용할 수 있습니다 하 고 따라서 벡터 품질 및 무결성에 대 한 우려를 제거 합니다. 또한,이 시는 잠재적으로 유해한 치료 또는 지질 및 염료 선적 화학 물질의 사용을 필요 하지 않습니다. 기존의 형광 라벨, 달리 CL-HB 리 젠 트 기능에 독립적으로 얼룩 (즉., 막 잠재력). CL HB 리 젠 트를 단순히 셀에 추가 하 고 단백질 식 밤새 껏 알을 품 수 수 있습니다. CL HB 섭정 포유류 세포에서 복제 하지 않습니다 그리고 biosafety 수준 (BSL) 1 실험실 설정에서 사용할 수 있습니다. 또한, 가장 역동적인 세포 분석을 수행 하 후 최대 5 일까지 충분 한 시간 동안 야간 보육이 과도 transfection은 감지할 수 있습니다.
또는, 염색체 이상이 cytometry, immunohistochemistry 또는 형광 제자리 교 잡 (물고기) 6등 다양 한 기법에 의해 공부 될 수 있었다. Cytometry는 이수성, 측정 될 수 있는 DNA 콘텐츠 및 세포 주기 세포의 단계에 따라 공부를 사용할 수 있습니다. Cytometry 이수성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다, 하지만 그것은 염색체 미 분리에 정보를 제공 하지 않습니다. 물고기와 immunohistochemistry 기술 DNA 또는 염색체에 바인딩할 형광 프로브를 사용 합니다. 이러한 기술은 세포의 인구 상태 스냅숏을 제공, 그들은 라이브 셀 이미징 함으로써 특정 셀 시간의 기간 동안 다음에 cytokinesis spatiotemporal 시각화를 통해 얻은 정보를 누락을 허용 하지 않습니다.
이 프로토콜은 지체 염색체 또는 염색체 미 분리 취급 하는 nocodazole 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)에 PP2A-B56γ-마우스에서 분리 연구 하 사용 되었다. 응용 프로그램 위에 이외에,이 프로토콜 레이블 및 세포 주기 규칙을 공부 하는 데 사용할 수 있는 다양 한 셀 형식에 염색체 분리 또는 종양 세포의 염색체 불안정을 시각화 하는 간단한 도구를 제공 합니다. 또한, 그것은 또한 사용할 수 있습니다 다양 한 약물 치료에 의해 발생 하는 염색체 불안정을 공부 하거나 유전자 염색체 미 분리의 결과로 밖으로 노크의 효과 연구.
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프로토콜
이러한 연구에서 실시 한 모든 실험 프로토콜 식품 및 의약품 안전 청 (FDA) 연구 시설에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인에 따라 수행 했다.
1. 격리와 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)의 문화
- 표준 프로토콜 7,,89마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) PP2A-B56γ-마우스 긴장과 야생 타입 littermates에서를 격리 합니다.
- ExpandMEFs 3 구절에 대 한 동결 하 고 실험 8필요할 때까지 저장 합니다.
2. 2-잘 연 발된 커버 유리에 대 한 자란 Mefs 라이브 영상
- MEF 성장 미디어 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM/F12)를 포함 하는 10%의 500 mL를 준비 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 X 페니실린/스 항생제, L-글루타민 (200 m m) 및 비 본질적인 아미노산 (NEAA) 500 mL 미디어 병에서 X 1.
- 37 ° c.에 미리 데워 진된 물 욕조에 통로 3에서 야생 타입에서 냉동된 MEFs와 PP2A-B56γ-생쥐의 병 동
- 전송 15 mL 튜브에 MEFs를 해 동 하 고 천천히 10 mL 피 펫을 사용 하 여 15 mL 튜브에 DMEM/F12 미디어의 dropwise 20 mL를 추가 합니다.
- T75 플라스 크에서 DMEM/F12 성장 매체의 20 mL와 함께 MEFs를 전송 하 고 셀 70% 합칠 때까지 그들을 확장 합니다. Confluency 4 x 또는 10 x 배율에서 역 현미경을 사용 하 여 추정 된다.
- Aspirate 유리 방목 지를 사용 하 여 성장 매체 후드에 진공 시스템에 부착 된 플라스틱, 0.25 %trypsin / EDTA의 3 mL를 추가 하 고 반응을 중지 DMEM/F12 성장 매체의 5 분 추가 3 ml 37 ° C에서 품 어.
- 낮은 속도 (300 x g) 실 온에서 5 분 동안에 세포 원심 조심 스럽게는 상쾌한을 제거 하 고 다시 물 욕조에 37 ° C에 미리 데워 DMEM/F12 성장 매체의 1 mL에 셀 펠 릿을 중단.
- Trypan 블루 제외 방법 또는 다른 적절 한 셀 계산 방법 8을 사용 하 여 셀을 열거 합니다.
- 2-잘 연 발된 커버 유리에 MEFs/잘 씨 약 20000. 200 µ L/잘 DMEM/F12 성장 매체를 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 그들을 하룻밤 배양 하 여 연결할 셀을 허용.
3입니다. 동기화
- DMEM/F12 성장 미디어 0.1%를 포함 하는 세포를 배양 하 여 G0/G1 단계에서 MEFs를 동기화 G0/G1 단계에서 최대 셀 수를 24 h, FBS.
참고: 지금까지 혈 청 기아는 기본 설정의 방법으로 사용 되었다, 비록에 다양 한 다른 방법 mitotic 무대 체포 10을 셀 필요에 따라 사용할 수 있습니다.
4. 라벨
- 1.5 m g/mL DMSO에 nocodazole의 재고 솔루션을 준비 합니다. Nocodazole는 microtubule 형성 10을 억제 하 여 G2/M 단계에서 셀을 체포.
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결과
야생 유형 및 PP2A-B56γ-마우스에서 MEFs 2-잘 챔버 커버 유리에 시드 되었고 첨부할 수 있습니다. 하루에 2, MEFs는 0.1%를 사용 하 여 동기화 했다 FBS 24 h에 대 한. 하루 3, MEFs 미디어에서 200 ng/mL에 nocodazole 및 30 PPC CL-HB regentwere 37에서 18 h incubated° C, 5 %CO2. 하루에 4, 셀은 회전 디스크 confocal 현미경 시스템 (그림 1)를 사용 하 여 몇 군데 있었다. 라이브 세포 이미징 그들은 유사 분열 (그림 2)를 통해 NEBD에서 진행으로 개별 셀의 운명을 시각화 하는 데 사용 되었다. Nocodazole는 G2M 단계에 microtubule 형성 방해 하 여 체포 하는 야생 타입 셀으로 알려져 있습니다. 세포 분열 ...
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토론
정확한 염색체 분리를 보장 하는 세포 주기 통제 검문소 방지 이수성 및 셀 변환 1,2,3. 현재 연구에서 우리는 PP2A B56γ의 그 비활성화 발견 약화 스핀 들 어셈블리 검사점 귀착되 었 다. 라이브 셀 이미징을 사용 하 여 nocodazole 9PP2A B56γ MEFs 유사 분열 동안 염색체 미 분리 처리를 관찰할 수 있었습니다.
이 프로토콜 Histone2B GFP 라벨 라이브 셀 이미징에 대 한 레이블 염색체 BacMam 2.0 기술에 의해 생성 된 사용 합니다. 라벨에 중요 한 단계 중 하나는 셀 라벨 충분 한 달성 하기 위해 (PPC) 당 입자의 권리 금액을 계산 하 고 있습니다. 그것은 10-50 PPC 적합 적정을 통해 발견 되었다. 이 시 약; 세포에...
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
우리는 박사 Guo Chiuan 웅와 박사 Bharatkumar 조시 원고를 개선 하는 소중한 의견에 감사 하 고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-글루타민 | Gibco | 25030081 | |
| MEM 비필수 아미노산 용액 (100X) | Gibco | 11140050 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 소 태아 혈청 | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| 극저온 바이알 보관 상자 | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| 극저온 바이알 | Corning/costar | 431416 | |
| T75 플라스크 | Cellstar | 658175 | |
| 2 웰 챔버 커버 유리 | Nunc | 155380PK | |
| 셀로미터 비전 셀 프로파일러 | Nexcelom Bioscience LLC | 셀로미터 비전 트리오 | |
| 노코다졸 | 시그마 | M1404 | |
| CellLight 히스톤 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer 회전 디스크 컨포칼 현미경 시스템 | Carl Zeiss | 현미경 Zeiss Cell Observer SD | |
| 수조 | Thermoscientific | 280 시리즈 | |
| 인큐베이터 | Sanyo 상용 솔루션 | MCO-18AIC (UV) | |
| 클래스 II 생물 안전 캐비닛 | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision 소프트웨어 | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ 소프트웨어 | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
참고문헌
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