DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.
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방법 논문
단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
DNA 손상 응답 (DDR) 사용 하 여 단백질의 과다 검출, 신호, 및 DNA 장애 복구. 이 응답을 묘사 하는 것이 게놈 유지 관리 메커니즘을 이해 중요 합니다. 모집 및 병 변에서 단백질의 교류는 매우 동적, 이후 자신의 연구 신속 하 고 공간 구분 방식으로 DNA 손상을 생성 하는 기능을 필요 합니다. 여기, 우리는 로컬로 사용 하 여 일반적으로 사용 가능한 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 라인을 갖춘 인간 세포에 DNA 손상을 유도 하는 절차를 설명 합니다. 레이저 줄무늬에서 면역 형광 검사 (IF) 또는 실시간으로 평가 될 수 있다 게놈 정비의 축적 단백질 형광 기자와 태그를 사용 합니다. Phosphorylated 히스톤 H2A를 사용 하 여. (Γ-H2A.X) X 복제 단백질 A (RPA) 표식, 메서드를 인접 chromatin에서 확산에서 로컬로 보충 요인 차별을 충분 한 해상도 제공 합니다. 우리는 더 효율적으로 DNA에서 단백질 relocalization의 활동을 모니터링에 ImageJ 기반 스크립트 손상 사이트 제공 합니다. 이러한 상세는 크게 DDR 역학의 연구를 단순화합니다.
서론
세포는 DNA 손상의 그들의 게놈 무결성을 위협 하는 내 인 성 및 외 인 소스에 지속적으로 노출 됩니다. DDR 신호 경로 검색 하 고, 신호, DNA 게놈 안정성을 유지 하기 위해 장애 복구의 앙상블입니다. DNA 이중 가닥 틈 (DSBs), DDR 2 무료 플랫폼에서 주로 발생: γ-H2A.X 라는 chromatin와 일반적으로 ssDNA 묶는 복잡 한 RPA1,2코팅 절제 단일 가닥 DNA (ssDNA) 지역.
UV 레이저 마이크로-방사선 사전 티 미 딘 아날로그 5-브로 모-2' deoxyuridine (BrdU) 또는 bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA 염료 감 응 전지의 단일 가닥 나누기 (를 포함 하 여 DNA 변의 혼합물을 만듭니다. SSBs) 및 DSBs chromatin와 ssDNA 플랫폼3,4에 지역화 된 DDR 유도 하. 이전 작품 모집 게놈 DSB에서 이러한 두 가지 플랫폼을 유지 보수 요인의 고 에너지 자외선 레이저 (335-36....
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프로토콜
1입니다. 셀의 사전 민감성
- 마이크로-방사선 실험 전에 24 h 씨 1 x DMEM 포함 10% FBS 8 잘 문화에서 405 nm 레이저 빛와 우수한 이미징의 극대 투과율을 보장 하기 위해 170 µ m 두께 coverslip 모양의 유리/폴리머 바닥으로 슬라이드에 잘 당 40000 U2OS 셀 레이저 스캐닝과 더불어 confocal 현미경을 거꾸로. 8 잘 microslide를 사용 하는 경우 모든 후속 및 프로토콜의 세척 단계에 대 한 잘 당 미디어 솔루션의 500 µ L을 사용 합니다.
주: 그들의 평면 형태 때문 잘 준수, 그리고 큰 핵, U2OS 세포 촉진 단백질 모집 마이크로 반구 사이트에서의 검색 하지만 필요에 따라 다른 부착 셀 형식을 사용할 수 있습니다. 셀 이상적으로 이어야 한다 약 80%의 수를 늘리기 위해 마이크로 조사 시 confluency 반구 실험 당 세포. 매우 높은 합류 세포 주기9의 S와 G2 단계는 동종 재결합 등 특정 복구 경로 교란 할 수 있다 세포 주기 변경 될 수 있습니다. - 5% CO2, 37 ° C에서 하룻밤 셀을 품 어 그리고 다음 사전 (1.3 단계) 세포를 민감하게 BrdU 또는 (단계 1.4) BBET (Hoechst 33342).
....
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결과
마이크로-방사선, 다음 세포 게놈 정비 단백질1,12의 특성에 따라 특정 기간 동안 복구할 수 있습니다. DSBs는 RPA 및 다른 게놈 유지 보수 요인9급속 하 게 코팅 되어 있는 ssDNA의 제한 된 영역을 만드는 세포 주기의 S와 G2 단계 nucleases에 의해 가장 광대 하 게 처리 됩니다. SsDNA 지역이 광범위 하 게 모집 및 다른 DDR 요인13의 교환에 DDR 동안 수정 되는 염색 질으로 둘러싸여 있습니다. 마이크로 반구 지역에 단백질 모집 경우 모니터링할 수 있습니다 (그림 1A). 일반적으로, 염색 질 관련 요인 (예, γ-H2A.X, 53BP1, 등)는 이전 (1-5 분)에.......
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토론
위에서 설명한 방법을 사용 하 여, 405 nm 레이저 마이크로-방사선 사전 BBET 또는 BrdU 응 셀의는 DSBs를 포함 하 여 부착 인간 세포의 핵 내 DNA 변의 지역화 된 세대 수 있습니다. 이러한 DSBs에서 DDR의 활동은 진 핵 세포9,,1819에 다른 방법으로 생성 된 비슷합니다. 마이크로 반구 사이트에서 DSB 절제 리드 ssDNA 세대 RPA32를 대상으로 항 체 또는 RPA32 GFP 융합을 사용 하 여 다음 수 있습니다. Chromatin 관련 요인, 다른 한편으로, 있을 수 있습니다 참고로 γ-H2A.X를 사용 하 여. 일부 염색 질 관련 요인 만큼 γ-H2A.X 초기 DSB에서 확산 되지 않을 수 있습니다 고 punctate foci ssDNA 의무적인 단백질 foci에서 있을 수 있습니다로 표시 됩니다.
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 캐나다의 [검색 부여 5026 오전]와 암 연구 학회 [오전에 21531]에서 과학자 장학금의 다음 세대에 의해 지원 되었다. 장-프랑수아 Lucier는 통계 분석에 피지 파이썬 스크립트 및 조언의 우수한 품질 관리를 제공 하는 감사 합니다. 우리는 경우 고정 솔루션 제조 법에 대 한 박사 스테파니 A. Yazinski 감사합니다. 우리는 레이저 전력 측정에 대 한 폴 뤼도 Karsenti를 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Olympus FLUOVIEW FV3000 공진 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | Olympus | ||
| FluoView FV3000 소프트웨어(버전 2.1) | Olympus | ||
| 405nm 레이저 | 코히런트 | 방사선 소스 | |
| 현미경 인큐베이터 AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 대물렌즈 | 올림푸스 | 오일 침수 목표 | |
| 8-웰 배양 슬라이드가 커버글라스 (X-웰)에 표시됩니다. | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS 골육종 인간 세포주 | ATCC | HTB-96 | 안정 세포주 |
| 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) | ThermoFisher | D1306 | 주의 독성 |
| 5-브로모-2&프라임;-데옥시우리딘 ( BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | 주의 독성 |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| 트윈-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| 설탕 | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME 트랜스펙션 시약 | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong 다이아몬드 안티페이드 마운턴트와 DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + 페놀 레드 | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, - 페놀 레드 | Wisent | 319-051-CL | |
| 소 태아 세럼 (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| 마우스 anti-RPA32 항체 | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A. X 항체 | 세포 신호 | 9718S | 1:500 IF |
| Rabbit Anti-53BP1 항체 | 세포 신호 | 4937S | 1:500 IF |
| Rabbit Anti-PRP19 항체 | Abcam | ab27692 | 1:500 IF |
| 염소 anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | 세포 신호전달 | 4414S | 1:250 IF |
| 염소 안티 마우스 IgG 알렉사 플루어 488 | 세포 신호 | 4408S | 1:250 IF |
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| 1918-K 파워 미터 918D-SL-0D3 센서 포함 | Newport |
참고문헌
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in respo....
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