Stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법

Summary

이 프로토콜 생리 및 다른 생물학 학문을 위한 유용한 풍부한 stomatal 가드 셀 준비의 방법을 설명 합니다.

Abstract

가드 셀의 연구의 식물의 전반적인 기능에이 세포 유형은 특정 기부금의 지식에 근본적 이다. 그러나, 그것은 종종 어려운 분리 하 고 도전을 제공 따라서 종종 그들을 공부.

이 연구는 stomatal 가드 세포 농축 방법을 설정합니다. 프로토콜 가드 세포를 분리 하 고 세포에서 단백질을 추출에 스카치 테이프를 사용 합니다. 이 방법은 무결성과 가드 셀의 수익률 격리 중 향상과 세포 신호 프로세스와 어떻게 그들이 stomatal 운동 고기 연관의 연구에 대 한 신뢰할 수 있는 샘플을 제공 합니다. 이 방법에서는, 식물 잎 테이프의 두 부분 사이 분할 되었고 abaxial 쪽 제거를 떨어져 벗 겨. 이 프로토콜은 가드 셀을 애기 잎 조직에 적용 되었다. Fluorescein diacetate 생존 능력을 결정 하는 (FDA)와 abscisic 산 (ABA) stomata 운동 ABA에 대 한 응답에서을 평가 하는 세포 치료 했다. 결론적으로,이 프로토콜 증명 농축된 stomatal 가드 셀을 준비 하 고 단백질을 분리 하는 데 유용 합니다. 세포와 단백질의 품질 얻을 여기 생리 및 다른 생물학 연구.

Introduction

Stomata 전반적인 생리학과 식물의 적합성에 중요 한 역할을 한다. 이 작은 식물 특정 구조 가드 셀으로 알려진 두 전문된 상피 세포에 의해 형성 되 고 잎의 abaxial 표면에 가장 풍부 하 게 발견 된다. Stomata가 식물 및 분위기,으로 물 증발을 통해 손실 컨트롤 사이 가스의 교환에 대 한 필요 합니다. 가드 셀 (예를 들어, 빛, 습도, 병원 체 접촉, 이산화탄소 수준) 다른 외부의 통합을 통해 stomata 조리개 조절 및 내부 (예., 내 생 호르몬) 자극^1,2. 지난 20 년 동안에이 세포 유형은 식물에서 프로세스 신호 공부 셀 모델 시스템 되고있다. 이러한 셀 리프; 총 셀의 작은 분수를 만들 따라서, 그들의 독특한 휴대 조사, 생 화 학적 및 분자 속성 단일 셀 방식으로, 그것은 다른 리프 셀 종류에서 그들을 격리 하는 데 필요한. 과거, 가드 셀 연구는 자주 참여 하고있다 가드 셀 protoplasts (GCP)^3,,45의 준비. 이 일반적으로 많은 양의 세포 벽....

Protocol

1. 성장 하는 식물

1. Potting 혼합물에 씨를 출 아 할. 식물 성장 성장 챔버에 140 µmol 광자 m^{−2의 − 1} 의 광도와 22 ° C 및 16 h 8 h 조명의 photoperiod 어두운 18 ° C에서 2 주 동안.
2. 4"직경 남 비는 토양을 포함으로 개별적으로 비슷한 크기의 묘를 이식 하 고 성장 단계 1.1에서에서 설명 하는 추가 동일한 조건에서 3 주.
   참고: 습 한 토양을 유지 하는 일주일에 두 번 수돗물 식물 물.

2입니다. 풍부한 Stomata의 준비

1. 메스와 개별 5 주 된 A. thaliana 식물의 잎을 제거 합니다.
2. 원피스 abaxial (아래) 쪽으로 준수와 준수는 잎의 adaxial (위) 쪽으로 다른 조각 각 잎 투명 스카치 테이프의 두 가지를 연결 합니다. 5 잎에 테이프를 두고 s.
3. 부드러운 껍질 떨어져 포장과 가드 세포 mesophyll 세포를 가진 adaxial 측 abaxial 측을 분리 각 손에 집게 손가락 및 엄지를 사용 하는 테이프의 두 가지.
4. 장소 여 stomata의 60 mL에 나뭇잎의 abaxial 측면에서 껍질....

Results

대표 이미지 전에 애기 가드 셀의 전후 mesophyll와 표 피 세포의 소화 그림 1에 표시 됩니다. 효소 활동 및 세포 막의 무결성 (그림 1B 및 1 D)를 측정 하는 FDA를 사용 하 여 mesophyll와 표 피 세포의 제거 전후 가드 세포 생존 능력을 관찰할 수 있습니다. 그림 2 는 stomatal 운동의 애기 ABA 치료에 대 한 응답에서을 보여 줍니다. Stomatal 조리개 ABA 치료의 30 분 후 50% 이상 감소합니다. 그림 2A stomata 운동의 시간 코스입니다. 다양 한 시간 점에서 사진 가벼운 현미경으로 찍은 사진. Stomatal 조리개 ImageJ로 측정 되었다 고 결과 80 조리개 측정 ± 표.......

Discussion

가드 셀 모델 시스템 식물에서 신호 전달 메커니즘 연구 이며 연구에 사용 하는 샘플의 준비는 생물학 질문에 가장 적합 한 보장 하는 것이 중요 하다. 식물 연구 지역 사회 내에서 가드 셀에 증가 관심에도 불구 하 고 보편적인 메서드는 stomatal 운동 및 생리학 있도록 stomatal 가드 셀을 준비 하는 방법에 대 한 공부 분자 변화 뿐만 아니라 시스템입니다. 그들을 도전 많은 부분에서 그들의 작은 크기, 낮은 풍요와 그것을 더 많거나 적은 전체 잎에서 그들을 제거 어렵게 만들 수 있는 독특한 구조를 지정할 수 있습니다.

이 프로토콜 개발된 테이프-껍질 메서드를 사용 하 여 그들을 분리 하는 이러한 장애물을 극복 하는 방법에 대 한 방법의 제공 한다. 이 프로토콜에 표시 하는 방법 그대로 stomatal 가드 세포, 생리 적으로 자극에 응답 상태를 유지 하기 위한 방법을 제공 합니다. 이 샘플의 준비는 탠덤 질량 태그 (TMT) 또는 대 한 Isobaric 태그를 이용 하 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
스테인레스 스틸 수술용 메	깃털
스카치 테이프 (3M)	ULINE	S-9781
페트리 디쉬	시그마-알드리치	BR455701
셀룰라아제 (Onozuka R-10)	공급자:Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.	21560003-3
Macerozyme R-10	야쿠르트 제약 산업 Co., Ltd.	21560003-4
DM6000B 현미경	Leica Microsystems
프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일	Thermo Fisher Scientific
Oak Ridge 고속 PPCO 원심분리기 튜브	Thermo Fisher Scientific	3119-0030
EZQ 단백질 정량 분석 키트	Thermo Fisher Scientific	R33200
플루오레세인 디아세테이트(FDA)	Thermo Fisher Scientific	F1303
앱시스산	Sigma-Aldrich	A4906
Metro Mix 500	BWI 회사	TX-500
Laemmli 샘플 버퍼	Bio-Rad	161-0737
Bio-Safe Comassie (G-250)	Bio-Rad	161-0786
마이크로 원심분리기 튜브 (2mL)	USA Scientific, Inc.	1620-2700
ImageJ 소프트웨어	국립 보건
핀셋	Sigma-Aldrich	F4017-1EA
12% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 젤	Bio-Rad	456-1043
현미경 슬라이드	Fisherbrand	12-550-A3