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방법 논문

미네랄 hFOB 1.19에 의해 생산 및 Saos-2 세포를 사용 하 여 전송 전자 현미경 에너지 흩어진 엑스레이 Microanalysis와 분석

8.9K 조회수

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DOI:

10.3791/57423

⸱

2018년 6월 24일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Lipid Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences, 2Université de Lyon, 3Université Lyon 1, 4L'insitut National des Sciences Appliquées (INSA) de Lyon, 5Ecole Supérieure de Chimie Physique Electronique (CPE) Lyon, 6Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Unité Mixte de Recherche (UMR), L'institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (ICBMS)

이 논문에서

요약

선물이 두 인간의 뼈 세포 선으로 발표 하는 소포에 미네랄의 상태를 비교 하는 프로토콜: hFOB 1.19와 Saos-2. 그들의 강화 프로 파일에 의해 알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩, 자외선 (UV) 빛 시각화, 전송 전자 현미경 (TEM) 이미징 및 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis (EDX)을 분석 했다.

초록

이 비디오 전송 전자 현미경 검사 법의 사용 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis을 소포 두 인간의 뼈 세포 라인에 의해 발표에서 미네랄의 상태를 비교할 (가장 EDX) 선물: hFOB 1.19와 Saos-2. Ascorbic 산 (AA)와 β-glycerophosphate (β-GP), 치료 후 이러한 셀 라인 강화를 확산에서 완전 한 osteogenic transdifferentiation를 받아야 매트릭스 소포 (MVs)에서 인회석 nucleation 트리거하는 생산 하 고는 세포 외 매트릭스 (ECM)입니다.

알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩 및 미네랄 자외선 (UV)를 사용 하 여 세포 lysates 또는 소포 편 이미징 EDX 정량 및 이온 매핑을 사용 하 여 구성의 분석을 바탕으로, 우리가 그 다리를 유추할 수 Saos-2 그리고 osteoblastic hFOB 1.19 셀 별개 강화 프로필 공개. Saos-2 셀 hFOB 1.19 셀 보다 더 효율적으로 형성할 고 생산 자외선 아래 표시 되지 않습니다 하지만 비슷합니다 hydroxyapatite (HA) 들은 더 많은 Ca와 F 대체에 큰 무기물 예금.

이러한 기술을 사용 하 여 얻은 결과 수 결론 강화 작용 과정 세포 유형에 따라 다릅니다. 우리는, 세포 수준에서 기원과 vesicles의 속성 미리 미네랄의 종류를 제안 합니다.

서론

뼈는 두 부분으로 구성 된 결합 조직: 유기 (세포와 콜라겐 섬유)과 미네랄 (칼슘, 인산 화합물). 뼈에 주요 미네랄 구성 요소는 apatites1. 다른 종류의 강화 유능한 세포 뼈 (osteoblasts), 치아 (odontoblasts)와 연골 (chondrocytes) 규제 강화의 초기 단계는 세포 외 기질 (ECM)의 단백질을 생산 하 고 매트릭스를 발표 하 여 소포 (MVs) (그림 1). MVs는 100-300 nm 직경 소포 칼슘과 인회석 nucleation 촉진 인산 축적 하 고 그 후 콜라겐2,3를 바인딩할. 다음, MVs extracellular 매체에 apatites를 풀어 분해. apatites 계속 콜라겐 섬유 접촉 성장과 뼈 매트릭스를 형성 합니다. 강화 작용은 P나 및 캘리포니아2 + 세포 외 매체에서의 일정 한 공급에 의해 지속 됩니다. 최근 게시 된 데이터 지원 우리의 모델4,5. 부드러운 조직 생리 적인 조건 하에서 형성할 하지 않습니다. 그러나, 소성 석 회화는 혈관 석 회화3같은 병 적인 조건 하에서 발생할 수 있습니다. 혈관 세포 osteoblast 형 취득 apatites의 nucleation 유발 하 고 혈관 벽의 중간과 내 층에서 강화 작용을 시작 하는 MVs를 생성할 수 있습니다. 소성 석 회화부터 정상적인 endochondral 강화3, 뼈가 있는 세포의 강화 작용의 분자 메커니즘을 이해와 chondrocytes는 부드러운 조직의 소성 석 회화에 몇 가지 단서를 제공 한다 형성.

골격 조직 개발은 다양 한 효소, 성장 요인, 발기인 또는 강화 작용의 억제제에 의해 통제 된다. 반목 행동 조직-특이 현상 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (TNAP) (그림 1)와 ectonucleotide pyrophosphatase/포스의 난 (NPP1), 함께 ankyrin (ANK), 제어 (PPi) 무기 파이 인산 농도 6. PP나, 하 대형의 강력한 억제제 TNAP;에 의해 분해 되 NPP1 hydrolyzes 뉴클레오티드 PP나 ANK ECM에 PP나 를 셀에서 수출 하는 동안 형성 된. Pi/PPi 비율 인회석 형성7,8 병 적인 결과9를 조절할 수 있습니다.

MV 막 nucleation 프로세스 (그림 1) 중 칼슘과 인산 염 MVs 안쪽의 초기 강수량을 용이 하 게 이온 수송 단백질 농축입니다. 인산 염 운송업 자 1 (구 덩이) P나 MVs10,11perivesicular 공간에 생성을 통합 하는 데 도움이 됩니다. Annexins는 MV 루멘12,13강화 작용을 시작 하는 생물 과정에서 바인딩 및 캘리포니아2 + 의 전송에 관련 될 수 있습니다. 우리는 가설, 이전, ECM14,15에서 전파 하기 전에 뮤직 비디오 안에 인회석의 내부 nucleation의 intracytoplasmic 소포 내에서 강화에 대 한 제안 부탁. 생체 외에서 모델링 캘리포니아2 +/P나 단지 형성 PS 및 AnxA516에서 만든 proteoliposomes에서의 유도를 확인 했다. 이 그 축적을 나타낼 수 있습니다의 캘리포니아2 +, P나, microvilli 같은 membranesrepresent M대 Annexins와 TNAP는 인회석의 nucleation 코어 (NC)의 지질 뗏목에서 AnxA5 및 PS 단지 또한 콜라겐 바인딩 보유 강화는 ECM에서의 전파를 자극, 그리고 콜라겐 섬유를 따라 MVs에 도움이 될 수 있는 용량 Fetuin A와 osteopontin (OPN)17, collagenous 비 계에 강화 작용의 전파를 저하 시킬 수 있습니다 인회석 형성 억제제로 알려져 있습니다. Nucleation 및 전파는 고유한 이벤트, 후자, 앞 전 고 모두 병 적인 강화 작용의 과정에 대 한 관련성이 있을 수 있습니다.

어떻게 칼슘 인산 염 복합물의 화학 생리 강화 및 소성 석 회화 변경 될 수 있습니다 발견, 그것은 세포에 의해 생산 하는 광물을 식별 하는 데 필요한. Apatites 칼슘 및 인산 염 무기물 일반 크리스탈 단위 셀 수식 Ca10(PO4)6X2를 포함 하는 그룹, 어디 X = Cl, F, 오하이오. 그들은18를 다음과 같이 분류 된다: fluorapatite (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 , hydroxyapatite (HA) Ca10(포4 )6(OH)2.

광물의 형성을 유발 하 osteoblast 셀 라인의 선택은 각 셀 라인 강화 작용의 독특한 프로필을 전시 하기 때문에 중요 한. 이 보고서에서 우리는 강화 작용의 두 가지 선택 된 인간 세포 모델에 의해 미네랄의 nucleation 비교: osteoblastic hFOB 1.19 셀과 다리 Saos-2 셀. Osteosarcoma 파생 셀 osteoblastic 모형으로 상용 되 고 Saos-2 셀 가장 성숙한 osteoblastic 문자19 보존 undifferentiated 인간의 태아 hFOB 세포는 정상 osteoblastic 모델로 널리 사용 감 별 법20. 다른 방법으로 그들의 강화 프로 파일 분석 했다: 알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩, 자외선 (UV) 빛 시각화, 전송 전자 현미경 (TEM) 이미징, 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis (EDX) 정량, 및 이온 매핑. 이전 연구에서 사용 되는 대체 기술 가장 EDX의 이점을 준다는 것 이온 교체의 양적 및 질적 결과 인회석 결정4,,521입니다. 가장 EDX를 사용 하 여 전반적인 목표 이미징 및 강화 프로세스의 고유 단계 동안 다른 종류의 세포에서 다양 한 미네랄에서 Ca, F 및 Cl 이온의 분포의 정량화에 대 한 간단한 방법을 찾으려고 했다. 이 메서드는 성공적으로 사용 되었습니다, 예를 들어 공존 화학 물질과 아연 나노 입자 및 수생 생물22에 그들의 결합된 효과의 상호 작용을 모니터링. 또 다른 연구에서는 구리 촉매 용액에서 티타늄 소재에 광범위 하 게 유도 결합된 플라즈마 광 방출 분 광 분석 (ICP OES), N2 physisorption (내기)에 의해 특징 이었다 XRD, UV에 대 한 DRS FT-적외선, 라만 분광학, 편-EDX, 및 화학적 측정23. 우리의 목표는 근원 및 소포 및 미네랄 뼈가 있는 차별화 동안 강화 작용을 제어 하는 메커니즘을 이해 하 두 셀 라인의 속성을 비교 했다.

figure-introduction-1
그림 1 . 뼈가 있는 세포 외 기질 (ECM) 단백질의 종합 및 막에서 매트릭스 소포 (MVs)의 출시에에서 강화의 초기 단계의 계획. MVs 칼슘 묶는 단백질, annexins 및 인산, 무기 인산 염 운송업 자 (구 덩이)의 행동을 통해 조직의 일반적인 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (TNAP), dephosphorylates는의 활동에 의해 다음의 행동을 통해 칼슘 축적 PP나 를 P나, 따라서 인회석 nucleation 촉진. 그런 다음, MVs 분해 하 고 extracellular 매체에 apatites를 출시. 강화 작용은 P나 및 캘리포니아2 + extracellular 매체4,5에서 일정 한 공급에 의해 지속 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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프로토콜

1. 세포 배양 및 치료

  1. 층 류 두건 아래 모든 필요한 자료를 넣고 아래 자외선 소독. 문화 미디어는: 1:1 혼합물 햄의 F12 및 DMEM 미디어 2.5 m L-글루타민 보충 100 U/mL 페니실린와 100 U/mL 스, 0.3 mg/mL G418 10% 소 태아 혈 청 (FBS) (v/v) 인간 태아 hFOB 1.19 SV40 큰 T 항 원 페에 대 한 osteoblasts, 그리고 맥 코이 5A 매체 1.5 m L-글루타민 보충과 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스 15 %FBS (v/v) 인간의 다리 Saos-2 셀.
  2. 5% CO2 의 분위기에서 34 ° C에서 hFOB 1.19 셀과 5%의 분위기 속에서 37 ° C에서 Saos-2 셀 문화 공동2. 층 류 두건에 인큐베이터에서 세포 배양, 어느 hFOB 1.19 또는 Saos-2 셀을 전송 하 고 매체 FBS와 신선한 문화 매체의 10 mL에 변경 합니다.
  3. 자극 (휴식 셀) 없이 셀을 품 어 또는 50 µ g/mL Ascorbic 산 (AA) 7.5 m m β-Glycerophosphate (β-GP), 초순 앞부분에서 준비와 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 필터링 된 다음 그들을 자극 합니다. 문화 매체의 표면에 플라스틱 microcentrifuge 관에서는 자극 제를 추가 합니다. 부드럽게 문화 요리를 저 어 하 고 7 일 동안 품 어.

2입니다. 칼슘 미네랄의 탐지

  1. 인산 염 버퍼 식 염 수와 세포 배양을 세척 (PBS: 125 mM NaCl, 5mm KCl, 10mm 나2HPO4, 1mm KH2포4, pH 7.0).
  2. 추가 2% (g:100 mL)의 5 mL PBS, pH 5.0에에서 아칸소-S 및 미네랄 얼룩을 30 분 동안 접시를 품 어.
  3. PBS로 3 회 세척. 신중 하 게, 접시 벽에 PBS를 추가 미네랄을 파괴 하지 않으려고.
  4. 칼슘 미네랄 거꾸로 가벼운 현미경을 관찰 하 고 이미지.

3입니다. UV 빛에서 프로브의 시각화

  1. 세포 lysates 콜라 소화 프로토콜24에 따르면 셀 문화, 휴식 또는 7 일에 대 한 자극을 처리 합니다.
  2. 세포 배양에서 매체를 수집 하 고 PBS로 세포 세척.
  3. 0.25 M 자당, 0.12 M NaCl, 0.01 M KCl, 그리고 0.02 M Tris HCl 버퍼, pH 7.45, 3 h 37 ° C에서의 솔루션에 500 U/mL 콜라의 3 mL로 세포를 소화.
  4. 기계적으로 긁어 셀, 플라스틱 microcentrifuge 튜브에 그들을 전송 고 통과 그들 10 번 1 mL 40 U 주사기 0.5 × 16 바늘.
  5. 5 분 동안 500 × g에서 샘플 원심
  6. 삭제는 상쾌한 고 합성 연골 림프 (SCL, 100 m m NaCl, 12.7 m m KCl, 0.57 m m MgCl2, 1.83 m m NaHCO3, 0.57 m m NaH2포4, 5.5 m m D-포도 당, 자당 63mm, 16.5 mM Hepes, pH 7.4)의 500 µ L에 셀 펠 릿을 중단.
  7. 주걱으로 UV transilluminator에 병에서 hydroxyapatite (HA), fluorapatite (FA) 및 chlorapatite (CA) 분말을 전송 및 컨트롤 사용.
  8. 플라스틱 팁 플라스틱 튜브에서 세포 lysates 전송 하 고 신중 하 게 UV transilluminator에 놓습니다.
  9. 받아 아래 보이는 이미지 자외선 빛.

4. 가장 EDX에 대 한 조사 준비

  1. 미네랄의 부정적인 얼룩이 지기에 대 한 준비
    1. 이온된 수의 500 µ L에서 합성으로 생성된 하, CA 및 FA 미네랄25 의 2.5 mg을 일시 중단 하 고 1 시간에 5% CO2 의 분위기 속에서 37 ° C에서 품 어.
    2. 가지고 Formvar/탄소 300 그물눈 니켈 격자 상자에서 정전기 방지 겸 도자기 다 잘 접시에 놓고 10 µ L HA, CA 및 FA 정지의 격자에 드롭.
    3. 건조 실 온에서 30 분에 대 한 샘플.
  2. 휴식의 준비 26 포함을 위한 세포를 자극 하 고
    1. 세포 배양에서 매체를 수집 하 고 생리 둔감 (PD) 매체 (125 m m NaCl, KCL, 10mm NaHCO35mm, 1mm KH2포4, 10 m m 포도 당, 20 mM HEPES, pH 7.4)와 셀을 세척.
    2. 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL)도 100 m m 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.2, 연기 후드 실 온에서 1 h의 혼합물의 5 mL와 함께 셀을 수정 합니다.
    3. 100mm 나트륨 인산 염 버퍼의 5 mL로 세포 세척 하 고 부드럽게 세척 후 버퍼를 제거.
    4. 어두운 방에서 100 m m 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.2, 연기 후드 실 온에서 20 분에에서 1% (g:100 mL) 오스뮴 tetroxide의 2 mL과 샘플을 후 위.
    5. 오스뮴 tetroxide를 제거 하 고 그것을 활용.
    6. 100mm 나트륨 인산 염 버퍼의 5 mL로 세포 세척.
    7. 그런 다음 실 온에서 등급된 에탄올 솔루션 시리즈의 5 mL aliquots에서 샘플을 탈수: 90% (vol.) 20 분, 75% (vol.) 15 분, 50% (vol.) 10 분, 25% (vol.) 5 분. 마지막으로 두 번 절대 에탄올을 사용 하 고 30 분 및 12 h 품 어.
    8. 기계적으로 플라스틱 문화 접시에서 세포를 긁어, 플라스틱 microcentrifuge 튜브에 수집 하 고 1 분 130 x g에서 샘플 원심.
    9. supernatants 제거 하 고 셀 LR 화이트 수 지와 볼륨 비율 1: 2의 절대 에탄올의 혼합물의 1 mL에 중단.
    10. 사용 하기 전에 유리 튜브의 내용을 잘 혼합 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.
    11. 샘플 1 분 130 x g에서 원심
    12. supernatants를 제거 하 고 LR 화이트 수 지와 절대 에탄올의 1:1 혼합물의 1 mL를 사용 하 여 이전 단계를 반복 합니다.
    13. 잘 혼합 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.
    14. 샘플 1 분 130 x g에서 원심
    15. supernatants 제거 합니다.
    16. 마지막으로, 샘플에 순수한 LR 화이트 수 지의 1 mL를 두 번 추가 하 고 플라스틱 튜브에 실 온에서 1 h에 품 어.
    17. 500 µ L 각 샘플의 젤라틴 캡슐에 넣으십시오.
      참고: 샘플 수 지 라벨을 파괴 하지 않는다 그래야 종이 연필의 작은 시트를 사용 하 여 레이블이 지정 됩니다.
    18. 젤라틴 캡슐, microcentrifuge 플라스틱 튜브에 넣어 닫고 스윙 아웃으로 터에서 1 분 130 x g에서 원심.
    19. 진공 펌프를 사용 하 여 플라스틱 튜브에서 캡슐을 제거 합니다.
    20. 오븐에 샘플을 이동 하 고 48 h 56 ° C에서 유해.
    21. 홀더에 장착 하 고 피라미드를 트리밍 하 여 블록을 준비 합니다.
    22. 소유자는 ultramicrotome, 다이아몬드 울트라 45 ° 칼 첨부 고 이온된 수; 그것을 채울합니다 부수적 기포에서 잎을 청소 하는 기억.
    23. 다음 섹션 (700 Å) 이온된 물 목욕에 다이아몬드 칼을 사용 하 여 잘라.
    24. Ni 그리드 소 속눈썹 및 장소 Formvar/탄소 300의 반짝이 면에 메쉬를 사용 하 여 스크랩을 설정 하 고 그들을 건조.
    25. 증기 두건 아래 어둠 속에서 절대 에탄올에 2.5% (vol.) 의해 uranyl 아세테이트를 준비 합니다. Uranyl 아세테이트 리드 컨테이너에 유지 하 고는 토사를 데리 러 하지 않는 것을 기억.
    26. 어두운 방에서 합성 apatites 및 에탄올 증기 두건에서 실 온에서 20 분에 2.5% (vol.) 의해 uranyl 아세테이트와 셀 샘플 격자를 counterstain.
    27. 다음 이온된 수에서 50% 에탄올에 격자 (vol.)에 의해 세척 하 고 24 시간 실 온에서 건조. 마지막으로, 상자에 격자를 넣어.

5. 가장 EDX 분석

  1. 전송 전자 현미경 (TEM)에 의해 가장 이미징 갖춘 전체 범위 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis (EDX) 시스템 11 메가 픽셀 카메라
    1. 미네랄과 세포의 관찰에 대 한 베릴륨 홀더를 준비 합니다. 정전기 방지 도구를 사용 합니다.
    2. 나사의 쌍을 제거 하 고 베릴륨 플레이트 들어올린 보유자의 나머지에서 베릴륨 세탁기.
    3. 그리드, 반짝이 면을, 소유자에 탑재 합니다.
    4. 조심 스럽게 베릴륨 세탁기와 베릴륨 접시 놓고 단단히 죔 나사를 나사.
    5. 진공 챔버에 홀더를 넣고 진공 펌프를 켭니다.
    6. 진공 달성 되 면 부드럽게 이미징 챔버에 홀더를 삽입 하 고 광선을 켭니다.
    7. 형광 모니터에는 현미경의 조리개 매개 변수를 설정 합니다. 이미지 난시 교정; 설정 확대/축소, 초점, 및 프레임; 50, 배율 TEM 이미지를 하는 고 000 X.
  2. 이미징 및 x 선 스펙트럼 및 구성 분석을 위한 microanalysis 줄기
    1. 스캐닝 전송 전자 현미경 (줄기) 이미징 챔버에 에너지 흩어진 엑스레이 (EDX) 검출기를 삽입 합니다.
    2. 초점 모드에서 이미지의 선명도 조정 합니다.
    3. 15, 확대 줄기 이미지를 000 X.
    4. X 선 microanalysis에 대 한 샘플에서 점을 선택 하 고 스펙트럼을 수집 합니다.
    5. 모든 원자 량 (100%)로 샘플에서 주기율표의 모든 요소에 대 한 요약 및 선택 된 요소의 콘텐츠를 나타내는 데이터를 가져옵니다: Ca, F, Cl, 및 (원자 %)으로 P. 그런 다음, 각 샘플에 대 한 Ca, F 또는 Cl p의 비율을 계산 합니다.
  3. 이온 매핑
    1. 칼슘, 불 소, 염소, 이온 매핑을 만들고 샘플에서 선택 된 요소의 EDX 지도 수행 인 등의 요소를 선택 합니다.
    2. 분석 된 요소의 지역화를 지정 하 여 데이터를 가져올: Ca, F, Cl, 및 P (원자 %)로 계산 하는 각 샘플에 대 한 Ca, F 또는 P와 Cl의 (%)에서 공동 지역화 하 고.

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결과

가장 EDX 체 외에 이미징 매트릭스 소포 (MVs) 셀 mineralizing 발표와 M대 강화 작용의 과정을 다르게 진행할 수 있습니다이 기술을 사용 하 여 얻은 결과 입증 하 여 생산 하는 미네랄의 수 에 셀의 다양 한 종류. 두 셀 라인 같은 osteoblastic transdifferentiation 치료를 받은 아직 자극된 Saos-2 셀 mineralized hFOB 보다 더 효율적으로 1.19 osteoblasts 아칸소-S에 의해 입증으로 얼룩 (그림 2). 이 hFOB 1.19 셀20에 비해 Saos-2 셀19 의 더 성숙한 osteoblast 형 때문일 수도 있습니다. 만든 UV transilluminator를 사용 하 여 샘플의 시각화 그것 취소만 fluorapatites UV 빛...

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토론

현재 신문에서 우리에 대 한 아칸소-얼룩, fluorapatite의 UV 빛 식별 프로토콜을 설명 하 고 가장 EDX 체 외에 이미징 MVs 셀 mineralizing 발표와 미네랄의 MVs. 에 의해 생산 그것은 몇 가지 일반적인 문제 해결 단계에 따라 위에서 언급 한 모든 메서드를 해결 수 있습니다. 최적의 결과 얻으려면 몇 가지 중요 한 단계는 신중 하 게 수행 되어야 한다. 첫째, 그것은 AA (산 성) 인 β-GP (알칼리 성) 인 문화 매체의 pH 7.4를 유지 하기 위해 다음 추가 좋습니다. 둘째, 아칸소-S 얼룩, 후 얼룩진된 칼슘 예금은 매우 깨지기 쉬운 고 셀 PBS 추가 시 결정의 파괴를 방지 하기 위해 매우 세 심하게 세척 되어야 한다. 셋째, 항상 리드 컨테이너에서 uranyl 아세테이트를 유지 하 고 희석된 일부만 고정 사용 해야 하기 때문에 앙금을 선택 하지 마십시오. 넷째, AA와 uranyl 아세테이트는 빛에 민감한 및 어두운 방에 처리 한다 기억 하십시오. 다섯째,...

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공개 사항

저자 들은 전혀 상충 선언 합니다.

감사의 글

MK 및 요청 수동 작업을 수행 하는 파운드 그림을 준비 하 고 만든 영화. ASK 쓴 원고, 파운드 쓴 스크립트와 MK 준비 테이블. SM, RB 및 SP는 비판적으로 테이블, 스크립트 및 원고 읽기. 저자 ultramicrotomy와 그녀의 훌륭한 지원에 대 한 한 나 Chomontowska로 Szymon Suski와 헨리크 Bilski 가장 EDX 분석 그들의 훌륭한 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 저자는 전문 영어 교정 패트릭 나무와 지시를 기록 하기 위한 바바라 Sobiak 박사 감사 하 고 싶습니다.

이 일 파운드 및 2016/23/N/NZ1/02449 MK, EU FP7 프로젝트 BIOIMAGINE에 국립 과학 센터, 폴란드 2016/23/N/NZ4/03313에서 교부 금에 의해 물어, 과학 및 고 등 교육의 폴란드어 사역에서 N N401 140639 그랜트에 의해 지원 되었다 : 바이오 이미징 연구 혁신 및 교육, 조지아 No. 264173, 그리고 법정 자금의 Nencki 연구소의 실험 생물학, 아카데미 과학의 폴란드어.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강한>시약
햄' s DMEM/F12 배지 혼합물PAAE15-8131:1, 인간 태아 hFOB 1.19 SV40 대형 T 항원 형질주입 조골세포(ATCC CRL-11372)
McCoy' s 5A 매체PAAE82312-0025인간 골육종 Saos-2 세포(ATCC, HTB-85),
항생제 혼합물(페니실린/스트렙토마이신),시그마P0781-100ML각 100 U/mL
G-418시그마681680.3 mg/mL
FBSGibco10270hFOB 1.19의 경우 10% 및 Saos-2
AA시그마A-5960 50&마이크로의 경우 15%; g/mL
ß-GPSigmaG9422-100G7.5 mM
Bio-GelHTP Gel Bio-Rad130-0420for HA
FAus
CA
CA Sodium phosphate 완충제 Na2HPO4/NaH2PO4 혼합물SigmaS7907/S82820.1 M, pH 7.2
PBSpH 7.0,
PBS SigmaA5533-25G0.5 g/100 mL, pH 5.0
콜라겐 분해효소 유형 IASigmaC2674500 U/mL
SCL 완충액제조
한탈이온화 웨이퍼
탄올POChBA6480111절대 99.8 % 및 용액 25, 50, 75, 90
% 우라닐 아세테이트 50 % 에탄올Polysciences Inc.21447-250.25 g/10 mL
PD 매체pH 7.4, 당사 준비
고정 혼합물(파라포름알데히드/글루타르알데히드)Sigma158127/G-62573%:1%
Post-fixation OsO4Sigma756331%
LR 에탄올Polysciences Inc.17411-MUNC 500g1:2, 1:1, 100%
아세톤CHEMPUR111024800순수
<강력한>도구
극저온 바이알Corning Inc.4304871.2 mL
플라스틱 페트리 배양 접시Falcon353003100 mm
플라스틱 튜브, Falcon352096 및 35207015 및 50 mL
혈청학 피펫,Falcon 및 VWR357521 및 612-37001 및 10 mL
플라스틱 마이크로 원심분리기 튜브, SigmaZ688312 및 Z6280341.5 mL 검정색 및 2 mL
투명 플라스틱 팁VWR613-0364, 613-0239 및 613-10500.1-10 &마이크로; L 자연, 1-200 &마이크로; L 노란색 및 200-1000 µ L 파란색
플라스틱 랙Light LabsA-7055-Z, A-7053-C튜브용 녹색, 마이크로 튜브용 주황색, TEM 프로브용 파란색
Laminar Hera SaveThermo Scientific Co.KS12HEPA 필터(DIN EN 1822에 따른 H14)
인큐베이터 Hera CellThermo Scientific Co.15034°C; hFOB 1.19 및 37°의 경우 C; C, Saos-2
흄 후드POLONWCS-2, TEM 염색,
유리병SIMAX1632414501050 및 163241450110050 및 100 mL
석영 유리관SIMAX638422010100Ø 10 mm, L 100
mm 펌프, IBS Integra BiosciencesVACUSAFE 진공 오븐용
MemmertUNE 40056&데그; C
도자기 멀티 웰 플레이트Rosenthal technik229/1212 웰
유리 비커SIMAX63241701002525 mL
유리병PocordDIN2210 mL
플라스틱 상자Agar Scientific Ltd.어둠을 위해
스냅 핏 젤라틴 캡슐Agar Scientific Ltd.G3741크기 1
Formvar/Carbon 300 메쉬 Ni 그리드 상자Agar Scientific Ltd.S162N3필름, 광택 면,
실리콘 셀 스크레이퍼SigmaSIAL0010-100EA크기: 1.8/25cm
주사기(바늘 포함BogMark007사기, 1mL, 40U, 바늘: 0.5 x 16
사기: ChiranaCH005L, 5mL
원심분리기MPW, 의료기기, MPW-350R,130xg, 500xg,
자외선 투과기UVP가시광선 및 자외선용
초박절개LKBNOVA700Å 섹션
블록 홀더LKBE6711원형
다이아몬드 나이프DiATOMEUltra 45°사이즈 3
속눈썹 홀더소, 미국
집게ROTH2855.1그리드 용 정전기 방지
주걱 세트ROTHE286.1정전기 방지 파우더
용 < 강력>이미징 < / 강력 >
반전 광 현미경Zeiss with CanonAxioObserver Z1 PowerShot G9위상차, 투과광, 20 x 대물렌즈, RGB 필터
투과전자현미경TEM, Oxford Instruments 및 SiS-OlympusJEM-1400 TEM, 전 범위 INCA 에너지 분산형 X선 미세분석(EDX) 시스템 및 11메가픽셀 MORADA G2 카메라배율, TEM용 50,000X 및 STEM 및 EDX용 15,000X
카메라 본체 및 렌즈니콘Nikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D 		동영상 녹음용
마이크MXL 마이크템포
, , , , , , , by 합성 미국 우리가 에의 흰색 수지, , , , 편안함 , ), , 주, 주, , , M-20, , ,

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