여기는 설정 하 고 2 차원 단층을 3D organoids의 전송에 대 한 인간 및 마우스 파생 된 3 차원 (3D) 위 organoids, 그리고 방법을 경작 하는 프로토콜에 설명 합니다. 재생 연구에 대 한 분석 결과 처음 상처를 소설로 위 상피 단층의 사용은 또한 기술 된다.
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이 논문에서
요약
초록
위 상처 복구의 생체 외에서 연구는 일반적으로 세포질 확산 및 마이그레이션의 스크래치 상처 분석 결과에서 위 암 세포 라인의 사용을 포함 한다. 그러나 이러한 분석의 한 가지 중요 한 한계는, 그들의 균질 성 다양 한 세포 종류입니다. 복구는 여러 종류의 세포 상호 작용을 요구 하는 복잡 한 프로세스입니다. 따라서, 세포 하위, 없는 문화 공부를 우리가 복구 프로세스를 이해 하 고 있다면 극복 되어야 하는 관심사 이다. 위 organoid 모델에 의하여 세포 유형의 이기종 컬렉션 밀접 하 게 위 상피 또는 다른 기본 조직 비보의 반영이 문제를 완화 수 있습니다. 여기는 소설, 스크래치 상처 시험 생체 외에서 인간에서 파생 된 증명 또는 마우스 3 차원 organoids 다음으로 옮겨질 수 위 상피 단층 중 그대로 organoids 또는의 단일 세포 현 탁 액으로는 해리 organoids입니다. 프로토콜의 목적은 organoid 파생 된 위 상피 monolayers 위 재생 연구 소설 스크래치 상처 분석 결과 시스템에서 사용할 수 있는 설정입니다.
서론
처음 상처 분석 실험의 사용 수리 및 재생1,2,,34,,56공부에 대 한 인기 있는 방법입니다. 특별히 위 중생과 헬리코박터 파일로리 식민지 연구 제안 된 방법론을 사용할 수 있습니다. 과거에는, 위 암 세포 선 헬리코박터 파일로리 (헬리코박터) 감염1,2 를 공부 하는 수단으로 사용 되었습니다 했으며 최근 위 암까지 AGS 셀 등 셀 라인 선호1 ,2,,34. 위 암 세포 배양의 한계가 정리 위 상피의 세포 다양성에 그들의 실패 이다. 이 한계를 해결 하려고 하 시연 설립 및 기본 인간 및 마우스 파생 3 차원 fundic 위 organoids (FGOs)의 이동은 여기 먼저 수정 된 방법에 따라 상처 치유 분석 실험에 대 한 위 상피 단층을 Schlaermann 외에의해 설명. 7 위 상피 monolayers에서 파생 된 전단 3D 위 FGOs 또는 단일 셀 FGO 파생 된 유지 밀접 하 게 위 상피의 나타내는 편광된 세포 구성 시연 vivo에서. 위 암 셀 라인 팬 들은이 기술을 표시 셀 구성의 정보를 입증 하지 않습니다, 그는 현재 프로토콜 대체 스크래치 상처 분석 방법에 비해 장점이 있다. 이 방법론은 해리 organoids에서 단일 세포 현 탁 액 또는 전체 organoids에서 설립 하 고 지하실 멤브레인 매트릭스를 사용 하 여 도금 또는 콜라겐 코팅 monolayers 수 면 최적화 되었습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 organoid 파생 된 위 상피 단층 문화 소설 상처 치유 분석 결과 대 한 설정입니다.
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프로토콜
오염 방지, 살 균 조직 문화 후드 내에서 전체 프로토콜을 수행 합니다. 승인 된 신시내티 대학 IRB 프로토콜에 따라 소매 위절제술을 받은 환자에서 인간의 fundic 조직 수집 (IRB 프로토콜 번호: 2015-4869).
모든 마우스 연구는 신시내티 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC) 평가의 미국 협회 및 인증의 실험실 동물 배려 (AAALAC) 시설 유지 관리에 의해 승인 되었다.
1. 인간 파생 3D 위 Fundic Organoids 구축
참고:이 프로토콜은 이전이 랩8에 발표 된 연구에 근거한 다.
- 50 %Wnt 조절 하 고 20 %R-spondin 조절 미디어 구성 된 3D organoid 미디어를 준비 합니다.
- 단련 하는 Wnt 미디어 준비, Wnt 성장 매체에 L 셀 문화 (Dulbecco 독수리 매체 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 수정의 페니실린/스) 7 일, 수확, 매체 및 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링.
- R-spondin 조건 미디어를 준비 합니다. R-spondin 성장 매체에서 수정된 HEK 293T R-spondin 은닉 세포 라인을 성장 (Dulbecco 독수리 매체 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 수정의 페니실린/스). 2 시간 후 첨부 파일에 매체에서에서 변경 이러한 셀 OPTIMEM 성장 매체, 1% 페니실린/스. 7 일 동안 세포 문화. R-spondin 조절 미디어 수확 그리고 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 합니다.
참고:이 프로토콜 이전 게시 되었습니다 및 자세한 프로토콜 6,,78를 참조 하십시오.
- 성장 인자 감소, 페 놀 레드 무료 지하실 멤브레인 매트릭스 4 ° c.에 얼음에 16 h에 대 한 해 동 에는 얼음 차가운 캘리포니아2 +/Mg2 +조직 수집-큰 플라스틱 용기에 DBPS 무료. 시작 단계 1.4까지 얼음에 저장 합니다.
참고: 조직 소매 위절제술을 받은 환자에서 수집 됩니다. - 집게를 사용 하 여 세척 살 균 비 커 100ml Ca2 +/Mg2 +포함 하에서 적극적으로 조직-Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS) 무료. 세척 약 30 s 또는 파편과 혈액 제거 되었습니다 때까지. 다음, 멸 균 거 즈를 사용 하 여, 상피에서 점액 레이어를 멀리 닦으십시오.
- 조직의 힘과 근육 층을 파악, 멀리는 곡선된 hemostatic 포 셉을 사용 하 여 상피를 긁어 단단히 포 셉을 사용 하 여. 살 균, 폴리스 티 렌 페 트리 접시에 긁힌 것된 상피 파편을 수집 합니다.
- 상피 조직 조직 소화를 최적화 하기 위해 면도기를 사용 하 여 약 2.0 x 2.0 m m2 크기의 조각으로 말하다. 캘리포니아2 +/Mg2 + 조직 파편을 씻고-DBPS 항생제로 보충 무료 (캘리포니아2 +/Mg2 + -무료 DPBS, 1% 페니실린/스, 0.25 mg/mL 암포 B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL 대) 때까지 세척은 혈액의 무료입니다. 필요한 경우 여러 세척을 수행 합니다. 신중 하 게 폐기물 비 커에 씻어 멸 균 거 즈를 통해 필터링 하 여 세척을 삭제 합니다.
- 수집 25 m m 저 어 바와 미리 데워 부 화 미디어 플라스 크 하단 라운드 125 mL 유리에 파편을 씻어 (2 m L-글루타민, 1% 보충 기초 미디어 페니실린/스, 10 mM HEPES 버퍼, 1 mg/mL 콜라 타입 1, 2 mg/mL 세포 배양 학년 소 혈 청 알 부 민). 고무 격 막과 둥근 바닥 플라스 크를 밀봉 하십시오.
- septa에 20 G 척수 바늘을 삽입 하 고 고무 뿌리고와 산소 탱크에 연결. 어떤 오염 물질을 필터링 하려면 필터를 만드는 튜브에 휴지를 삽입 합니다. 낮은에 산소 유출 켭니다. 격 막의 파열을 피하기 위해 septa에 10-15 유출 바늘을 삽입 합니다.
- 클램프를 사용 하 여 링 스탠드에 최대 집합을 장악 하 고 37 ° c 30-45 분 동안 저 어 플레이트 보정 물 욕조에 배치. 후 조직 15 분 동안 배양 되어, 천연된 샘에 대 한 시각적으로 부 화 미디어의 50 µ L을 제거 합니다. 선 밀도 또는 하지 않은 경우 추가 5-10 분 동안 떠나 조직 으로부터 분리.
- 50 mL을 추가, 부 화 직후 살 균 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 부 화 미디어 또는 외피 혼합물에 직접 붓는 의해 미리 DMEM/F12를가 열.
- 4 50 mL 원뿔 튜브로 멸 균 거 즈를 통해 선 혼합물을 필터링 합니다. 추출 된 땀 샘 원뿔 튜브의 하단에 정착 수 있도록 15 분 동안 얼음에 여과 액을 유지 합니다. 수 정착된 동맥 방해, 제거 하 고 상단 표면에 뜨는 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 40 mL을 삭제 하지 않도록 주의 하십시오. 항생제로 보충 하는 DPBS의 10 mL에 나머지 10 mL를 resuspend.
- 5 mL 셀 문화 시험관으로 혼합물을 균등 하 게 배포 합니다. 4 ° C에서 65 x g에 5 분 동안 centrifuge 고 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 제거 합니다. 피 펫 또는 200 µ L 넓은 피 펫 팁을 사용 하 여 해 동된 지하실 멤브레인 매트릭스에 선 펠 릿 resuspend 동 질 때까지 섞는다.
참고: 얼음에이 단계를 수행 하 고 혼합 하는 동안 지하실 멤브레인 행렬의 합을 피하기 위하여 결정적 이다. 또한, 그것은 시각적으로 선 밀도 50 µ L에 대 한 샘플링 검사 하는 것이 중요입니다. 최적의 밀도 ~ 70 %confluency입니다. - 다음으로, 지하실 멤브레인 매트릭스 넓은 스쳐 피 펫을 사용 하 여 50 µ L에 선 접시. 도금 하는 동안 모든 거품을 생성 하지 마십시오.
- 37 ° c.에 10-15 분 동안 품 어 유해를 지하실 멤브레인 매트릭스를 허용 하려면 12 잘 문화 접시에 도금 하는 경우 추가 hFGO 미디어의 1 mL (고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 0.25 mg/mL 암포 B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL 대, 10 mM HEPES 버퍼, 1 m m n-Acteylcystine, 1 x N2, B27, Wnt 조절 매체 50%, 20% R spondin 조절 매체 100 ng/mL으로 보충 1 뼈 morphogenetic 단백질 억제제, 1 nM gastrin, 50 ng/mL 표 피 성장 인자, 200 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 10, 10 니코틴, 및 10 µ M Y-27632 바위 억제제) 잘 당. 그렇지 않으면 12-잘 문화 접시를 사용 하 여 추가 지하실 멤브레인 매트릭스 거품 잠수함 충분 한 미디어.
- 5% CO2 습도 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 문화. 모든 4-5 일 미디어를 변경 합니다.
2. 마우스 파생 3D 위 Fundic Organoids 구축
참고:이 프로토콜은 이전에 게시 6되었습니다. 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스를 해 동 하 고 시작 하기 전에 모든 시 약 준비.
- 연구 수행 되 고 있는 연구 기관에 의해 승인 메서드를 사용 하는 쥐를 희생. 마우스에서 위를 제거 하 고 이전에 게시 프로토콜 6따라 해 부. 20 mL 얼음 차가운 캘리포니아2 +/Mg2 +세척-DBPS 무료.
참고: C57BL/6 마우스, 세 8-10 주 fundic 위 organoid 문화에 대 한 사용 됩니다. 쥐 위 제거 하기 전에 수동 경부 전위 뒤 이산화탄소의 흡입에 의해 안락사 되었다. - 위장에서 근육 층을 제거 하 고 모든 보이는 혈관 이전 6출판.
- 동굴에서 살 균 면도날을 사용 하 여 forestomach는 저를 구분 합니다. 작은 수술가 위를 사용 하 여 파편 약 2.0 x 2.0 m m. 집게를 사용 하 여에 컷된 저 EDTA 인큐베이션 버퍼를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 파편을 수집 (캘리포니아2 +/Mg2 +-무료 DPBS, 5 mM EDTA)와 함께 2 h 4 ° C에서 품 어 부드러운 동요입니다.
- 살 균 후드, 원뿔 관 두고 그대로 조각 가능한 많은 외피 버퍼를 제거 하는 피 펫을 사용 하는 약 5 분에 대 한 얼음 조각. 추가 버퍼를 떨고 5 mL (1 g D-솔 비 톨, 100 ml Ca2 +/Mg2 +1.47 g 자당-DPBS 무료) 2 분 허용 정착 하 고 서둘러, 1000 p 피 펫을 사용 하 여 제거 아직 정착 해야 작은 조각 큰 조각 힘으로 손으로 흔들어 상위 계층.
- 65 x g에서 4 ° C에서 5 분 동안 제거 조각 회전.
- 공기 거품을 피하 면 서,는 상쾌한을 제거 하 고 지하실 멤브레인 매트릭스에 resuspend 때까지 균질 성 혼합.
- 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 잘 당 50 µ L에서 지하실 멤브레인 매트릭스 접시와 다음 20 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 충분 한 mFGO 성장 매체 추가 (고급 Dulbecco의 수정이 글 매체/F12 매체 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 10mm 보충 HEPES 버퍼, 1 m m n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50 %Wnt 조절 매체, 20% R spondin 조절 매체와 100 ng/mL 뼈 morphogenetic 단백질 억제제, 10 nM gastrin, 50ng/mL 표 피 성장 인자, 10 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 10, 10 µ M Y-27632 바위 억제제 보충) 거품 잠수함.
- 37 ° C, 5% CO2 습도 셀 문화 인큐베이터에서 세포 문화. 모든 4-5 일 미디어를 변경 합니다.
3. 콜라겐 코팅 2D 전송
참고: 별도로 지정 하지 않는 한 무 균 조직 문화 후드에 모든 절차를 수행 합니다. 콜라겐은 단층을 3D organoids를 전송 하기 전에 24 시간 코팅을 시작 합니다. 얼음에 쥐 꼬리 콜라겐을 유지 하 고 빛 으로부터 차폐 된. 콜라겐 코팅 접시는 최대 2 주에 대 한 좋은. 코팅된 접시를 즉시 사용 하지, 경우 랩 parafilm 및 필요한 때까지 4 ° C에서 저장소 접시.
- 쥐 꼬리 콜라겐 20 m m 초 산을 사용 하 여 50 µ g/mL로 희석.
- 충분히 희석된 콜라겐과 우물의 표면 커버. 표준 12-잘 접시에 한 잘, 콜라겐의 약 1 mL와 함께 코트. 살 균 후드에 실 온에서 하룻밤 둡니다.
- 캘리포니아2 +/Mg2 +1 mL로 두 번 세척-DPBS 잘 당 고 떠나 살 균 후드에 실 온에서 2 h에 대 한 발견.
4. 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 2D 전송
참고: 별도로 지정 하지 않는 한 무 균 조직 문화 후드에 모든 절차를 수행 합니다. 지하실 막 매트릭스 2 h는 단층을 3D organoids를 전송 하기 전에 코팅을 시작 합니다. 얼음에 지하실 멤브레인 매트릭스를 유지. 코팅된 판 즉시 사용할 수 있으며 시간의 오랜된 기간 동안 저장할 수 없습니다.
- 지하실 막 매트릭스 셀 문화 학년 물 15 mL 원뿔 튜브에 1:10 희석 비율. 얼음에 희석.
- 표준 12-잘 접시의 각 잘 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스의 100 µ L를 추가할는 피 펫을 사용 하 여. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 균등 하 게도 코트 잘 걸쳐 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스를 배포 합니다.
- 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
- 피 펫을 사용 하 여 잔여 물을 제거 하 고 3D organoids를 전송 하기 전에 1 시간 실 온에서 건조.
5. 2D 위 상피 세포 Monolayers 3D m/hFGOs의 전송
- 후 3D 마우스-또는 인간-파생 된 FGOs에 6-7 일에 대 한 교양 있다, 2D 단층을 3D organoids의 전송을 시작 합니다.
참고: 필요한 단층의 각 잘이 좋습니다 300 그대로 organoids 또는 300 organoids에서 파생 된 단일 셀을 사용 하 여. 강력한 문화에서 그것 약 150 organoid/잘 12 잘 문화 배지 내의 얻을 예정 이다. - 접시는 전송 하기 전에 코팅 해야 합니다.
그러나 참고: 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 접시 반투명 젤 레이어,, 콜라겐 코팅 판 코팅의 어떤 명백한 표시 없는 것입니다. - 직접 pipetting 1 mL 균 캘리포니아2 +/Mg2 +여 접시에서 3D 지하실 멤브레인 매트릭스 거품을 꺼내-거품의 중심에 DBPS 무료.
- 피 펫을 사용 하 여, 셀 문화 테스트 튜브로 지하실 멤브레인 매트릭스, organoid 혼합물을 수집 합니다. 튜브 당 2 지하실 멤브레인 매트릭스 거품의 비율로 수집 합니다. 40 x g와 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기
- 진공 시스템을 사용 하 여 제거는 상쾌한 그리고 최대한 많은 지하실 멤브레인 매트릭스. 캘리포니아2 +/Mg2 +4 ml에서 resuspend-무료 DBPS, 상쾌한를 제거 하 고 2-3 회 반복. 전체 organoid 전송 프로토콜에 대 한 5.10 단계로 진행 합니다. 5.7 단일 셀 서 스 펜 션 프로토콜에 대 한 단계를 계속 합니다.
- 37 ° C에 세포 분리 솔루션을 미리 따뜻한 고 각 시험관에 1 mL를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 반전 하거나 한 피 펫으로 아래로 pipetting으로 혼합. 37 ° c.에서 10 분 동안 품 어
- 캘리포니아2 +/Mg2 +의 2 개 mL를 추가-각 테스트 튜브에 직접 DBPS 무료.
- 26 G 바늘을 사용 하 고 주사기는 혼합 2-3 번. 시각적으로 하나의 셀에 대 한 확인 합니다. Organoids 또는 셀의 클러스터는 여전히 1-2 번 더 주사기.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 40 x g에서 원심 분리기 2D FGO 미디어에 펠 릿을 resuspend (2D 마우스 FGO 성장 매체: 고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 m L-글루타민, 10mm 페니실린/스, 10% 태아 종 아리 혈 청, 10 mM HEPES 버퍼, 1 x N2, 1 x B27, 10 nM gastrin, 50 ng/mL 표 피 성장 인자, 1 µ M TGF-β 억제제와 10 µ M Y-27632 바위 억제제 보충. 2D 인간의 FGO 성장 매체: 고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 10 mM HEPES 버퍼, 10% 태아 종 아리 혈 청, 10mm 니코틴, 1 x N2, 1 x B27, 50 mg/mL 대, 50 ng/mL 상피 성장으로 보충 요인, 그리고 10 µ M Y-27632 바위 억제제, 1 µ M TGF-β 억제제).
- 코팅된 판에 물의 resuspension 플레이트입니다. 37 ° c.에 번호판을 품 어 교체 미디어 매 4 일 또는 이전 미디어 노란색. 단층 형태로 약 4 일이 필요합니다.
6. 스크래치 상처 분석 결과 2D 위 상피 세포 Monolayers를 사용 하 여
- 문화에는 100 %confluency 도달 했습니다 때 면도날을 사용 하는 단층 스크래치.
- 실 온에서 15 분 동안 3.7% 포름알데히드를 사용 하 여 monolayers를 수정 합니다. 실 온에서 20 분 동안 0.5% 비 이온 세제/PBS와 permeabilize.
- 다음 실 온에서 1 h에 대 한 혈 청 2% 당나귀와 monolayers를 차단 하 고 H+, K+의 1:1000 희석을 품 어-ATPase 1 차적인 항 체 하룻밤 4 ° C에서 0.1% 비 이온 세제/PBS로 세척 및 당나귀의 1: 100 희석으로 품 어 반대로 마우스 488 이차 항 체 및 10μg/mL Hoechst 세포 핵의 실 온에서 1 시간을 위한 얼룩.
- 2D 인간 파생 위 단층 문화에 표면 점액 핏 셀을 확인 하려면 셀 20 μ g /mL Ulex europaeus (UEAI) FITC 켤레의 얼룩. 이미지는 confocal 현미경에 monolayers.
- 상처 마다 몇 h. 스크래치 것입니다 다시는 단층의 품질에 따라 24-48 h와 환자 사이 사이 epithelialize의 이미지를 가져가 라.
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결과
Organoids는 인간의 코 퍼스/본문 또는 마우스 위 조직 (그림 1A)의 저에서 파생 되었다. 콜라 또는 인간 또는 마우스 파생 된 위장 조직의 EDTA 소화 후 각각 샘 지하실 멤브레인 매트릭스에 포함 되며 6-7 일 (그림 1A)에 대 한 교양. 그림 1B 인간 파생 위 organoids (huFGOs) 다음 위 상피 단층 (huGEM)로 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 챔버 슬라이드에 전송 되었습니다의 형성을 보여 줍니다. 4 일 후 문화, confluent huGEMs 스크래치 상처 분석 실험 (그림 1B)에 사용 되었다. 이미지는 24 시간 (그림 2)의 기간 동안 문화 안에 상처 폐쇄를 보여준...
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토론
현재 프로토콜 세부 인간 및 마우스 파생 된 위 상피 monolayers 스크래치 상처 분석 실험을 위해 사용 될 수 있는 설립. 프로토콜 주민 줄기 세포 주 인간 (또는 마우스)에서 절연 조직의 개념에 의존 하 고는 수정 된 프로토콜 처음 발행 Schlaermann 외7. 특히, 우리는 합칠 확립 여기 프로토콜을 최적화 하 고 어떤 표현 주요 세포 계보 vivo에서위 상피 내에서 찾을 수 있는 위 상피 단층 편광. 위계 양 수리 조직 재 epithelialization, 재생, 및 확산9,,1011를 포함 하는 복잡 한 프로세스입니다. 특히, 우리 연구소는 위 상피의 재생 재생 위 샘 내 궤 양 여백에 spasmolytic polypeptide/개미 자리의...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 NIH (NIDDK) 5에 의해 지원 되었다 R01 DK083402-07 부여 (YZ).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES 버퍼 | 시그마 Aldrich | H0887 | |
| n-아세틸시스틴 | 시그마 Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP 억제제(Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| 니코틴아미드 | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK 억제제 | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β 억제제 | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µ M 필터 | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 ° C 수조 | |||
| 콜라겐 분해 효소 유형 1 | Worthington | ||
| 소 혈청 알부민 | 시그마 알드리치 | A9418 | |
| Kimwipes (티슈 페이퍼) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL 둥근 바닥 플라스크 | |||
| 1 in (25 mm) 교반 막대 | |||
| 고무 격막 | |||
| 멸균 거즈 | |||
| 교반 플레이트 | |||
| 링 스탠드 | |||
| 링 스탠드 클램프 | |||
| 멸균 페트리 접시 | |||
| 1.5인치 길이의 바늘 18G | Thermo Fisher | 305196 | |
| 3.5인치 길이의 척추 바늘 20G | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12웰 세포 배양 처리 플레이트 | 미드웨스트 사이언티픽 | 92012 | |
| 성장 인자 감소, 페놀 레드-프리 MatrigelTM (기저막 매트릭스) | Fisher | CB-40230C | |
| 멸균 면도날 | |||
| 와이드-팁 핀셋 | |||
| 곡선형 헤모스태틱 펜치 | |||
| 200 &마이크로; L 와이드 피펫 팁 | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL 세포 배양 시험관 | Fisher | 14-956-3C | |
| 고무 호스 | |||
| 1 g D-소르비톨 | |||
| 수크로오스 | Fisher | SS-500 | |
| 해부 현미경 | |||
| 해부 트레이 | |||
| 흔들 테이블 | |||
| 쥐 꼬리 콜라겐 유형 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| 세포 배양 등급 빙초 Fisher | A38-212 | ||
| 세포 배양 등급 물 | Corning | 25-055-CV | |
| 2웰 챔버 슬라이드 | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-웰 Transwell (폴리에스테르 멤브레인 인서트) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
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| HK-ATPase 1차 항체 | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary 항체 (Donkey anti-mouse 488 secondary 항체) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
참고문헌
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