여기는 설정 하 고 2 차원 단층을 3D organoids의 전송에 대 한 인간 및 마우스 파생 된 3 차원 (3D) 위 organoids, 그리고 방법을 경작 하는 프로토콜에 설명 합니다. 재생 연구에 대 한 분석 결과 처음 상처를 소설로 위 상피 단층의 사용은 또한 기술 된다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
위 상처 복구의 생체 외에서 연구는 일반적으로 세포질 확산 및 마이그레이션의 스크래치 상처 분석 결과에서 위 암 세포 라인의 사용을 포함 한다. 그러나 이러한 분석의 한 가지 중요 한 한계는, 그들의 균질 성 다양 한 세포 종류입니다. 복구는 여러 종류의 세포 상호 작용을 요구 하는 복잡 한 프로세스입니다. 따라서, 세포 하위, 없는 문화 공부를 우리가 복구 프로세스를 이해 하 고 있다면 극복 되어야 하는 관심사 이다. 위 organoid 모델에 의하여 세포 유형의 이기종 컬렉션 밀접 하 게 위 상피 또는 다른 기본 조직 비보의 반영이 문제를 완화 수 있습니다. 여기는 소설, 스크래치 상처 시험 생체 외에서 인간에서 파생 된 증명 또는 마우스 3 차원 organoids 다음으로 옮겨질 수 위 상피 단층 중 그대로 organoids 또는의 단일 세포 현 탁 액으로는 해리 organoids입니다. 프로토콜의 목적은 organoid 파생 된 위 상피 monolayers 위 재생 연구 소설 스크래치 상처 분석 결과 시스템에서 사용할 수 있는 설정입니다.
서론
처음 상처 분석 실험의 사용 수리 및 재생1,2,,34,,56공부에 대 한 인기 있는 방법입니다. 특별히 위 중생과 헬리코박터 파일로리 식민지 연구 제안 된 방법론을 사용할 수 있습니다. 과거에는, 위 암 세포 선 헬리코박터 파일로리 (헬리코박터) 감염1,2 를 공부 하는 수단으로 사용 되었습니다 했으며 최근 위 암까지 AGS 셀 등 셀 라인 선호1 ,2,,34. 위 암 세포 배양의 한계가 정리 위 상피의 세포 다양성에 그들의 실패 이다. 이 한계를 해결 하려고 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
오염 방지, 살 균 조직 문화 후드 내에서 전체 프로토콜을 수행 합니다. 승인 된 신시내티 대학 IRB 프로토콜에 따라 소매 위절제술을 받은 환자에서 인간의 fundic 조직 수집 (IRB 프로토콜 번호: 2015-4869).
모든 마우스 연구는 신시내티 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC) 평가의 미국 협회 및 인증의 실험실 동물 배려 (AAALAC) 시설 유지 관리에 의해 승인 되었다.
1. 인간 파생 3D 위 Fundic Organoids 구축
참고:이 프로토콜은 이전이 랩8에 발표 된 연구에 근거한 다.
- 50 %Wnt 조절 하 고 20 %R-spondin 조절 미디어 구성 된 3D organoid 미디어를 준비 합니다.
- 단련 하는 Wnt 미디어 준비, Wnt 성장 매체에 L 셀 문화 (Dulbecco 독수리 매체 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 수정의 페니실린/스) 7 일, 수확, 매체 및 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링.
- R-spondin 조건 미디어를 준비 합니다. R-spondin 성장 매체에서 수정된 HEK 293T R-spond....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
Organoids는 인간의 코 퍼스/본문 또는 마우스 위 조직 (그림 1A)의 저에서 파생 되었다. 콜라 또는 인간 또는 마우스 파생 된 위장 조직의 EDTA 소화 후 각각 샘 지하실 멤브레인 매트릭스에 포함 되며 6-7 일 (그림 1A)에 대 한 교양. 그림 1B 인간 파생 위 organoids (huFGOs) 다음 위 상피 단층 (huGEM)로 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 챔버 슬라이드에 전송 되었습니다의 형성을 보여 줍니다. 4 일 후 문화, confluent huGEMs 스크래치 상처 분석 실험 (그림 1B)에 사용 되었다. 이미지는 24 시간 (그림 2)의 기간 동안 문화 안에 상처 폐쇄를 보여준.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
현재 프로토콜 세부 인간 및 마우스 파생 된 위 상피 monolayers 스크래치 상처 분석 실험을 위해 사용 될 수 있는 설립. 프로토콜 주민 줄기 세포 주 인간 (또는 마우스)에서 절연 조직의 개념에 의존 하 고는 수정 된 프로토콜 처음 발행 Schlaermann 외7. 특히, 우리는 합칠 확립 여기 프로토콜을 최적화 하 고 어떤 표현 주요 세포 계보 vivo에서위 상피 내에서 찾을 수 있는 위 상피 단층 편광. 위계 양 수리 조직 재 epithelialization, 재생, 및 확산9,,1011를 포함 하는 복잡 한 프로세스입니다. 특히, 우리 연구소는 위 상피의 재생 재생 위 샘 내 궤 양 여백에 spasmolytic polypeptide/개미 자리의.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 NIH (NIDDK) 5에 의해 지원 되었다 R01 DK083402-07 부여 (YZ).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES 버퍼 | 시그마 Aldrich | H0887 | |
| n-아세틸시스틴 | 시그마 Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP 억제제(Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| 니코틴아미드 | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK 억제제 | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β 억제제 | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µ M 필터 | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 ° C 수조 | |||
| 콜라겐 분해 효소 유형 1 | Worthington | ||
| 소 혈청 알부민 | 시그마 알드리치 | A9418 | |
| Kimwipes (티슈 페이퍼) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL 둥근 바닥 플라스크 | |||
| 1 in (25 mm) 교반 막대 | |||
| 고무 격막 | |||
| 멸균 거즈 | |||
| 교반 플레이트 | |||
| 링 스탠드 | |||
| 링 스탠드 클램프 | |||
| 멸균 페트리 접시 | |||
| 1.5인치 길이의 바늘 18G | Thermo Fisher | 305196 | |
| 3.5인치 길이의 척추 바늘 20G | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12웰 세포 배양 처리 플레이트 | 미드웨스트 사이언티픽 | 92012 | |
| 성장 인자 감소, 페놀 레드-프리 MatrigelTM (기저막 매트릭스) | Fisher | CB-40230C | |
| 멸균 면도날 | |||
| 와이드-팁 핀셋 | |||
| 곡선형 헤모스태틱 펜치 | |||
| 200 &마이크로; L 와이드 피펫 팁 | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL 세포 배양 시험관 | Fisher | 14-956-3C | |
| 고무 호스 | |||
| 1 g D-소르비톨 | |||
| 수크로오스 | Fisher | SS-500 | |
| 해부 현미경 | |||
| 해부 트레이 | |||
| 흔들 테이블 | |||
| 쥐 꼬리 콜라겐 유형 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| 세포 배양 등급 빙초 Fisher | A38-212 | ||
| 세포 배양 등급 물 | Corning | 25-055-CV | |
| 2웰 챔버 슬라이드 | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-웰 Transwell (폴리에스테르 멤브레인 인서트) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | Wnt3a 생산 세포주인 L 세포는 Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, 네덜란드)로부터 선물로 받았습니다. | N/A | |
| HEK-293T Rspondin 분비 세포 | 변형된 HEK-293T R-스폰딘 분비 세포주는 Jeff Whitsett 박사(미국 신시내티 소재 신시내티 의과대학 신생아학, 주산기 및 폐 생물학 섹션)로부터 획득되었습니다. | N/A | |
| HK-ATPase 1차 항체 | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary 항체 (Donkey anti-mouse 488 secondary 항체) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
참고문헌
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
