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방법 논문

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

14.7K 조회수

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DOI:

10.3791/57443

⸱

2018년 4월 30일

 ,  ,  , 

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할 연구

초록

Decidua, 일컬어 임신 endometrium, 비판적으로 중요 한 생식 조직 이다. Decidualized stromal 세포와 면역 세포의 주로 구성 decidual 세포는 호르몬 및 염증 성 요소는 성공적인 blastocyst 주입, placental 개발에 대 한 중요 한 역할의 분 비에 대 한 책임은 용어 및 preterm 노동의 개시입니다. 많은 임신 합병증은 다른 세포 인구 decidua 구성의 정밀한 균형의 물결에서 발생할 수 있습니다. 특정 decidual 세포 유형의 비율 변경 수 있습니다 이러한 중요 한 프로세스를 방해 하 고 배아 이식 실패, 자궁내 성장 제한, 자간 전 증 임신의 심각한 합병증 개발의 위험을 증가 하 고 preterm 노동입니다. 여기에 설명 된 프로토콜 비용 및 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 효과적인 방법 용어 placentae의 태아 세포 막에서 수집 하는 시간을 보여 줍니다. 결합 하 여 효소 소화와 부드러운 기계적 장애 decidual 조직, 고수익 decidual 셀 chorion 오염 거의 없이 함께 얻은 것입니다. 중요 한 것은, 격리 decidual 셀 특징 이었다 (stromal 세포 (55-60%), 백혈구 (35%), trophoblast (0.01%) 세포 또는 상피 (1%)) 유지 높은 생존 능력 (80%)는 멀티 컬러 이미징 흐름 cytometry 분석 결과 의해 확인 되었다. 이 프로토콜에 decidua parietalis 이며 첫 번째 및 두 번째 임신 placentae을 적용할 수 있습니다. 절연, 일단 decidual 세포는 다양 한 임신 합병증에 다른 decidual 셀 부분 모집단의 역할을 이해 하는 것을 목표로 하는 실험적인 응용 프로그램에 대 한 사용할 수 있습니다.

서론

가장 적극적인 성인 여성 조직 중 하나 endometrium 난소 호르몬, 에스트로겐 (E2)과 황 체 호르몬 (P4)에 의해 자극에 대 한 응답에서 각 생리 주기를 개장 하는 극적인 겪 습. 일컬어 임신 endometrium decidua P4 기반 차별화 E2 지배 증식 단계 결과로 postovulatory 단계의 끝에 의해 형성 되는 매우 중요 한 생식 조직 이다. Decidual 셀 성공적인 blastocyst 이식 한 태아 이식 모성 관용을 유지 하기 위한 utero placental 인터페이스의 개발을 위한 호르몬 요인의 분 비에 대 한 책임이 있습니다.

Decidualization는 주입 및 후속 decidual 나선형 동맥의 리 모델링 필요 합니다. 자궁내 막 기질 세포 decidualization을, P4 및 캠프, 통제 생리 주기1의 후반 luteal 단계를 겪는 다. 이 프로세스는 주위 혈관 및 개장 하는 맥 관 구조에 규제를 밀매 하는 백혈구의 역할을 제안 하는 기질에 걸쳐 확산 시작 됩니다. 이 세포 변환 원형 형태, 증가 핵 크기 및 거친 바인딩과 그물 및 Golgi 기구2의 확장 특징 이다. Decidualized stromal 세....

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프로토콜

Placentae 선택 제왕 섹션을 겪고 노동 여성에 건강 한 용어에서 수집 됩니다. 수집, 처리, 그리고 인간의 샘플의 일회용 마운트 시 나이 병원 윤리 위원회의 지침을 준수 합니다. 서 면된 동의 각 환자에 게 서 얻어진 다. 이 연구는 마운트 시 나이 병원에서 연구 윤리 위원회에 의해 승인 됩니다.

1입니다. 준비

참고: 모든 단계 증기 두건에서 실시 되어야 하 고 모든 수술 장비 통해 압력솥 증기 두건에 배치 하기 전에 소독 해야 합니다. (병, 50 mL 튜브, 등) 다른 모든 자료는 70% 에탄올 용액으로 살 균 해야 합니다. 항상 착용 개인 보호 장비에 항상 유해 쓰레기 (연구실 코트, 장갑, 긴 머리를 다시 묶어, 등)와 함께 작업 하는 경우.

  1. 효소 소화 솔루션 (최종 솔루션: 200 mL)
    1. 플라스틱의 HBSS-180 mL / 500 mL 비 커에 살 균 감동적인 자석을 추가 하 고 플레이트 실 온에서 교 반에-.
    2. 밖으로 무게 추가 하 고 다음 HBSS/솔루션에 천천히 순차적으로: 20 mL FBS, 400 mg 콜라 2 ([최종] = 2 mg/mL), 20 m....

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결과

효율성과 격리 된 셀의 유효성을 검사, 그들은 두 가지 방법으로 특징 했다: cytometry와 immunocytochemistry (ICC). 4 세포 인구를 표적으로 했다; 팬 백혈구 마커 CD45 decidual 면역 세포를 식별 하는 데 사용 되었다, cytokeratin 상피/내 피 세포를 감지 하는 데 사용 했다 및 cytokeratin 7 어떤 감지 하는 데 사용 되었다 마지막으로, decidualized stromal 세포 안티 vimentin 항 체에 의해 발견 된 잠재적인 trophoblast (chorion 또는 placental) 오염.

멀티 컬러 이미징 cytometry에 의해 특성화에 대 한 갓 격리 decidual 세포는 세포 생존 능력을 결정 하는 고칠 수 염료와 스테인드 했다. 셀 permeabilized 및 고정, vimentin .......

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토론

여기에 설명 된 프로토콜은 비용은 매우 간단 하 기본 decidual 세포를 고립 시키기를 위한 효과적인 방법 전체 인간의 용어 placentae의 태아 세포 막에서 수집 하는 시간을 보여 줍니다. 이 프로토콜의 성공은 두 가지 중요 한 요소, (1) 태아 막 및 (2) 치료는 decidual 세포 프로토콜 통해 처리의 chorion 계층에서 근 근이 살아가고 decidual의 효율에 따라 달라 집니다. 그것은 중요 한 chorion 조직 오염 보장 하 여 아무도 실수로 포함 decidual 된다고 하는 동안 및 식별 하 고 제거 하는 세척 단계 (decidua 및 chorion 형태학에 차이 중 어떤 오염 든 지에 의해 제어 됩니다. 수 수는 decidua와 실수로 수집 될 수 있습니다 있는 chorion의 쉬운 제거를 위한). Decidual 셀은 깨지기 따라서 빠르고 빈번한 pipetting 감소 가능성에 발생할 수 있습니다. 좋습니다, 그럼, 피 펫 배출 속도 설정을 느린 유지 한다 고 최소 pipetting 셀 때 사용.......

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공개 사항

저자 공개할 게 없다

감사의 글

저자는이 연구에 사용 된 인간의 표본에 대 한 기증자, RCWIH BioBank 마운트 시 나이 병원/UHN 산부인과 부서 및 산부인과 감사 하 고 싶습니다. 우리는 잿 물 실험실, 특히 그녀의 방법 개발에 대 한 박사 캐롤라인 덩크의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 버로우즈 환영 기금 (부여 #1013759)에 의해 지원 됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
행크' 칼슘과 마그네슘이 함유된 균형 잡힌 소금 용액시설에서 준비(LTRI)
Hank' 칼슘과 마그네슘이 없는 균형 잡힌 소금 용액시설에서 준비 (LTRI)
기저귀 패드Sigma-AldrichD9542
대형 수술 용 가위AL Medical2018-12-20.
대형 수술 겸자Fine Science Tools11000-18
플라스틱 일회용 셀 스크레이퍼(25cm)Sarstedt83.183
250mm(크기 60메쉬) 금속 체Sigma-AldrichS1020-5EA
플라스틱 손잡이가 있는 일회용 메스(#21)Fisher Scientific08-927-5D
멸균 플라스틱 페트리 접시(직경 10cm)Sarstedt82.1473.001
멸균 검체 용기 (소변 컵, 4.5 oz)VWR25384-146
나일론 필터 (70 mm)VWR/Corning21008-952
적혈구 용해 완충액Qiagen79217
Trypan blue, 0.4% 용액Lonza17-942E
ParafilmFisher Scientific13-374-10
HemocytometerReichert1490
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배양 매체Invitrogen11835-055
Fetal bovine serumWisent080-150
Normocin (50mg/mL)Invivogenant-nr-1
Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL)MilliporeSCGPT05RE
콜라겐 분해 효소 2, 동결 건조 분말Sigma-AldrichC6885
대두 트립신 억제제, 분말Sigma-AldrichT9003-250mg
DNase 분말Roche10104159001
소 혈청 알부민 (BSA 분말)Fisher ScientificBP1600-100
스피닝 디스크 컨포칼 현미경 - Leica DMI 6000BLeica
이미징 유세포 분석기 - Image Stream MK2Amnis
IDEA 소프트웨어Millipore Sigma
APC 복합 Vimentin 항체R& D SystemsIC2105A
APC H7-conjugated CD45 항체BD641399
FITC-conjugated Cytokeratin 항체MACS Miltenyi Biotec130-080-101
PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibodyNovusNBP2-47941PCP
eFluor450 Fixable Viability dyeThermo Fisher Scientific65-0863-14
Vimentin 1차 항체Santa Cruzsc-7558
CD45 1차 항체DakoM0701
사이토케라틴 1차 항체DakoM0821
사이토케라틴 7 1차 항체DakoM7018
마우스 IgGSanta Cruzsc-2025
염소 IgGSanta Cruzsc-2028
Alexa Fluor 546 2차 항체InvitrogenA10036
Alexa Fluor 594 2차 항체Fisher ScientificA-11058
DAPISigma-AldrichD9542

참고문헌

  1. Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
  2. Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. Decidual....

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