탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

요약

핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.

초록

중앙 신경 조직에서 D1-알파 하위 수용 체 (Drd1α)은 가장 풍부한 도파민 (DA) 수용 체, 조절 신경 성장 및 개발에 중요 한 역할을. 그러나, Drd1α 수용 체 이상 행동 응답을 중재 하 고 변조 작업 메모리 기능을 기본 메커니즘을 아직 명확 하지 않다. 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 사용 하 여, 현재 연구 식별 도파민 Drd1α 수용 체와 티로신 hydroxylase (TH) RNA 식 핵 accumbens (NAc) 지역과 substantia nigra 지역 (SNR)에 다 관련 회로에서 각각. Drd1α 식은 NAc에 얼룩 패턴 "개별 점"을 보여줍니다. 분명 성 다름 Drd1α 식에서 관찰 되었다. 반면, 일 "클러스터 된" 얼룩 패턴을 보여 줍니다. 일 식에 관한 여성 쥐 남성 동물을 기준으로 셀 당 더 높은 신호 식 표시. 여기에 제시 된 방법을 중앙 신 경계 질환의 진행 하는 동안 변경 내용을 도파민 시스템 장애에서를 조사 소설 현장에서 교 잡 기술을 제공 합니다.

서론

부전 striatal 도파민 시스템의 여러 neurocognitive 질병에서 관찰 하는 임상 증상의 진행에 포함 된다. 도파민 D1 수용 체는 두뇌의 전 두 엽 피 질 (PFC) 지역과 striatal에 존재 하 고 무 겁 게 영향 인지 프로세스¹, 작동 메모리, 시간 처리, 및 기관차 동작^2,3 등 ^{, 4 , 5 , 6 , 7}. 이전 연구는 도파민 D1 수용 체의 변화 주의 적자 과다 장애 (ADHD)⁸, 정신 분열 증^9, 에 neurocognitive 증상의 진행과 관련 된 했다 해명 ¹⁰ , 스트레스 감수 성¹¹. 특히, 정신 분열 증, 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 연구 엽 외피가 있는 도파민 D1 수용 체의 바인딩을 능력 높은 인식 적자와 부정적인 증상¹¹의 존재에 관련 된 표시. 전 두 엽 피 질 도파민 D1 수용 체에 의해 통제에서 흥분 성의 뉴런의 수지상 성장 스트레스 민감성을 완화 한다. 또한, 내측 전 두 엽 피 질 (mPFC) 신경 수용 체 D1의 최저 사회 패배 스트레스로 사회적 회피¹²향상 시킬 수 있습니다.

여기, RNA 교 잡 제자리에서 신선한-냉동 조직 샘플 셀에 단일 RNA 분자를 시각화의 새로운 기술을 소개 합니다. 현재 기술은 현재 문학 내에서 존재 하는 방법에 비해 여러 장점이 있습니다. 첫째, 현재 프로시저는 조직의 공간 및 형태학 컨텍스트를 유지 하 고 신선한 요구 하는 다른 절차, 조직에 포함 되지 않은 현재 방법으로 결합 될 수 있습니다 있도록 신선한 냉동 조직 샘플에서 수행 되었다. 포 르 말린 고정 및 파라핀 끼워 넣어진 조직에 유사한 절차는 단일 전송 해상도는 RNA 제자리에서 교 잡 기술은¹³를 사용 하 여 달성 될 수 있다 설명 했다. 우수한 감도 낮은 복사 번호 식으로 다른 핵 산 탐지 방법으로 얻을 수 없는 개별 셀 수준에서 유전자 발현을 비교 하는 기회를 제공 하는 단일 전사 수준에서 RNA의 검출 같은 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기술. 현재 메서드의 단일 대상 RNA 사본에 때 교배 하 고 순차적으로 신호 증폭 분자 검출에의 묶인 매우 구체적인 RNA 프로브를 통해 높은 신호 대 잡음 비율을 사용 하 여 이미지를 유지 하는 또한, 시스템입니다. 마지막으로, 현재 기술 우리의 조사 시스템 관련 마커 단백질에 의해 감지와 같은 단 하나의 클래스를 제한 하는 것 보다는 그것의 특정 대상 독점 프로브, 여러 생물 학적 시스템을 평가 하는 기회 제공 immunohistochemistry 방법입니다.

우리의 연구에서 우리 둘 다 남성과 여성 F344/N 쥐의 핵 accumbens (NAc)에 Drd1α 수용 체 식과 티로신 hydroxylase (TH) 식 substantia nigra (SNR)에서 평가를이 소설 RNA 제자리에서 교 잡 사용. 교 잡 제자리에서 혁신적인 RNA 우리 모두 다 통풍 관 및 다 출시 동시에 영향을 미치는, striatal 다 시스템의 복잡성에 대 한 우리의 이해를 향상 시키는 메커니즘을 조사를 활성화. 신선한 냉동 뇌 조각 및 다른 얼룩 패턴에 대 한 데이터 분석의 방법 제공 절차, 설명: "개별 점" 또는 "클러스터".

프로토콜

실험 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 사우스 캐롤라이나 대학에 의해 승인 되었다 (연방 보증 번호: A3049-01).

1입니다. 신선한 냉동된 뇌 섹션의 준비

1. F344/N 쥐 긴장을 사용 하 여: 각 성의 3 쥐 13 개월, 몸 무게 약 320 g.
2. 5% (sevoflurane의 과다) sevoflurane 농도 조정 합니다. 추가 분에 대 한 중지를 호흡 후 sevoflurane 노출을 계속 합니다.
3. 목을 벨 쥐 하 고 두뇌를 제거 합니다.
4. 15 액체 질소에 쥐 뇌 잠수함 s 조직 수확의 5 분 이내.
5. -20 ° c에서 1 h cryostat 뇌 equilibrate
6. 30 µ m 섹션을 잘라내어 슬라이드 ( 재료의 표참조)에 전송.
7. 핵 accumbens 지역 Bregma¹⁴앞쪽 2.28 m m 약 2.76 m m에서에서 섹션을 선택 하십시오.
8. 지속적으로 쥐의 stereotaxic 두뇌 구조에 따라 핵 accumbens 영역을 통해 후 각 전구에서 쥐 뇌를 슬라이스.
9. 샘플 슬라이드에 탑재 합니다. 건조 10 분 동안-20 ° C에서 섹션을 유지.
10. 즉시 미리 냉장된 4% paraformaldehyde 1 h 4 ° c.에 대 한 슬라이드를 담가
11. 실 온 (RT)에서 증가 에탄올 그라데이션에서 슬라이드 배치: 50% EtOH 5 분; 70% EtOH 5 분; 그리고 100% EtOH 5 분.
12. 신선한 100%와 반복 EtOH.
13. 흡수 성 종이에 슬라이드를 배치 하 고 건조 한 공기.
14. 장벽 펜으로 각 섹션 주위 방 벽을 그리기 ( 재료의 표참조). 1 분 동안 완전히 건조 하는 배리어를 하자.

2입니다. 뇌 섹션의 전처리

1. 오븐에 설정 하 고 설정 온도 40 ° c
2. 전처리 4 시 약 3 방울 (90 µ L)을 추가 ( 재료의 표참조) 각 뇌 섹션 (슬라이드 당 하나의 섹션)에.
3. 실시간에서 30 분에 대 한 섹션을 품 어
4. 신선한 1 x PBS와 실시간 반복에서 1 분 동안 1 x PBS에 슬라이드 잠수함
   참고: 슬라이드 1 x PBS 15 분 이상에 체류 하지 해야 합니다.

3. RNA 제자리에서 교 잡 형광 다중 분석 결과

1. 따뜻한 물 욕조에 40 ° C에서 10 분 동안 대상 조사와 다음 실시간에 멋진
2. RNA 시 장소 (예를 들어, 앰프 1-4 층)에서 실시간
3. 슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).
4. 샘플 조각에 Drd1α 프로브 (C1)의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 2 h 40 ° c.에 대 한 품 어
5. 워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.
6. 슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).
7. 앰프 1-샘플 조각에 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에 30 분 동안 품 어
8. 슬라이드 1 워시 버퍼 실시간 반복에서 2 분에 대 한 신선한 1wash 버퍼와 잠수함
9. 슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).
10. 샘플 조각에 앰프 2 층의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에서 15 분 동안 품 어
11. 워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.
12. 슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).
13. 앰프 3-샘플 조각에 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에 30 분 동안 품 어
14. 워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드 잠수함
15. 슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).
16. 앰프 4-플로리다-Alt A 샘플 조각에의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에서 15 분 동안 품 어
17. 워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.
18. 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 하 고 즉시 장착 시 약의 2 방울의 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 각 섹션에.
19. 22 m m 22 m m coverslip 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 각 뇌 섹션.
20. 건조까지 2-8 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장 합니다.
21. Confocal 현미경 켜고 60 X 목표 전환.
22. Confocal 현미경으로 Z-스택 이미지를 얻을. 공초점 이미지의 세부 절차에 대 한 보충 비디오를 참조 하십시오.
23. 핵 accumbens 영역에서 셀을 표시 하는 Drd1α의 이미지 (여기: 488 nm; 방출: 515/30 nm).
    참고: 섹션 인큐베이션 단계 사이 밖으로 건조 하는 두뇌를 게 하지 마십시오.

4. 데이터 분석

1. 반 정량적 얼룩 패턴 분석: "개별 점".
   1. 이미지에서 개별 셀을 지정 하려면 DAPI 얼룩 핵 표식으로 수행 합니다. 그러나, 그것은 여전히 핵 세포의 불규칙 한 모양으로 여러 종류의 세포는 뇌 조직의 특정 부분을 분석 어렵다. 여기, 두 경험이 풍부한 연구자 별도로 각 셀 셀 영역을 정의 하는 이미지에서 할당 합니다.
   2. 시각적으로 특정 조건 (그림 1B)를 사용 하 여 셀 당 도트 수에 따라 대표 confocal 이미지 내의 각 셀 점수.
   3. 각 카테고리에 총 셀 수를 결정 하 고 모든 조직 단면도 (그림 2A)와 남성 및 여성에 대 한 각 범주 내에서 세포의 백분율 주파수를 표시 하는 상대 주파수 그래프를 만들 총 셀 수 x100로 나누면 별도로 (그림 2E).
   4. 모든 이전 범주 내에서 셀의 합계를 별도로 셀과 남성과 여성에 대 한 모든 조직 단면도 (그림 2B)에 대 한 누적 횟수를 확인 하려면 총 셀 수 x100 나누어 (그림 2F).
2. 통계적으로 분석 하는 "개별 점" 얼룩 패턴 (선택 사항).
   1. 여 지 없이 변수 (즉, 낮은 셀 식 (1)에서 가장 높은 셀 식 (9) 각 순위 범주에가 셀 수) 자연에 서 수를 제공 하는 셀 당 도트 수 검사 추가 통계 분석에 대 한.
   2. 검사 후 기술 통계의, 세 가지 주요 방법을 사용 하 여: 벽난로-Haenszel 통계, 맨-휘트니 U 테스트 및 Kruskal-월리스 테스트. 비록 정확한 통계 접근에 의존 될 것입니다 관심, 통계 의사 결정 트리 (그림 4)의 실험 설계 및 연구 질문의 분석 방법에 관한 결정에 도움이 수 있습니다.
3. 얼룩 패턴에 대 한 관심 (ROI)의 신호 강도 계량: "클러스터".
   1. 다음 수식을 사용 하 여 각 이미지의 신호 강도 계산.
      신호 강도 = 투자 수익 이미지-(평균 배경 강도 × 총 이미지 영역)의 총 강도
   2. 셀 당 대략적인 신호 식 계산 ROI 이미지 내의 셀의 총 수를 계산 합니다. 신호 강도/이미지 셀/이미지의 수에 있는 그룹 차이 신호 식/셀에서 본 그룹 차이에 기여할 수 있는 메커니즘을 고려 하는 관심 있을 수 있습니다 (그림 3B-3D).
4. "클러스터" (선택 사항) 패턴을 얼룩이 지는 통계적으로 분석 합니다.
   1. 신호 식/추가 통계 분석에 대 한 연속 변수를 제공 하기 위해 셀을 검사 합니다. 독립 샘플 t-테스트 및 분산 분석 (ANOVA), 과목 사이의 요인의 수에 따라 두 가지 방법, 디자인에 포함 된 사용 합니다. 통계적 의사 결정 트리 (그림 4)는 가장 적절 한 통계적 접근에 관한 결정에 도움이 수 있습니다.

결과

현재의 연구는 관찰 F344/N 쥐 (그림 1A)에서 NAc의 도파민 D1-알파 수용 체 (Drd1α)에서 RNA 식에 대 한 패턴을 얼룩이 지기 "개별 점". 개별 형광 신호 쉽게 확인 하 고 각 셀 내에 단일 RNA 사본을 나타내는 단일 "점"으로 볼 수 있습니다. "이산 점 들" 얼룩 패턴을 표시 하는 NAc에서 이미지에 대 한 우리 반 정량 분석 (그림 1A, 그림 2A및 2B)를 사용 하 여 식의 동적 범위를 평가 합니다. 각 셀은 "0-9에서" 셀 당 도트 수에 따라 득점 했다. 이 "교배 신호"-점수 (H 점수) 방법 따라서 평가할 수 범위와 변화 Drd1α 식에 대 한 개별 셀에 걸쳐.

토론

이 프로토콜에 우리가 현장에서 교 잡 신선한 냉동 두뇌 분할 영역 핵 accumbens (NAc)에 Drd1α 수용 체 식과 티로신 hydroxylase (TH) 식 substantia nigra (SNR) 지역에서 평가 하의 소설 기법을 설명 합니다. 우리는 또한 다른 얼룩 패턴에 대 한 데이터 분석의 방법 제공: "개별 점" 또는 "클러스터".

교 잡 시험 현장에서 성공적인 멀티플렉스 형광 RNA에 대 한 중요 한 단계가 포함 되어 있습니다. 일단 목이 쥐 그리고 두뇌 제거 액체 질소 5 분 이내에 뇌 동결 4 %paraformaldehyde 고정까지-20 ° C에서 뇌 섹션을 유지. 전처리 4의 외피의 30 분 후 슬라이드 15 분 이상 1 x PBS에 체류 하지 해야 합니다. 뇌를 섹션 증폭 단계 사이 밖으로 건조 하지 마십시오. Confocal 영상 보여주는 명확한 얼룩 신호 조직 샘플에서 높은 품질의 이미지를 제공 하는 매우 도움이 됩니...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HybEZ 오븐 시스템	고급 세포 진단	310010
RNAscope 프로브 - Rn-Drd1a	고급 세포 진단	317031	색상 채널 1, 녹색
RNAscope 프로브 - Rn-Th-C2	고급 세포 진단	314651-C2	컬러 채널 2, 오렌지
RNAscope 형광 멀티플렉스 시약 키트	고급 세포 진단	320850
ImmEdge 소수성 장벽 펜	벡터 연구소	H-4000
SuperFrost Plus 슬라이드	Fisher Scientific	12-550-154%
4% 파라포름알데히드	Sigma-Aldrich	158127-500G
Sevoflurane	Merritt 수의학 공급	347075
Tissue-Tek 수직 24 슬라이드 랙	Fisher Scientific	NC9837976
Tissue-Tek 염색 접시	Fisher Scientific	NC0731403
정밀 범용 수조	ThermoFisher Scientific	TSGP28
전처리 4	고급 세포 진단	320850	키트의 부품
ProLong Gold 안티-페이드 시약	Life Technologies	P36930
Amp 1-FL	Advanced Cell Diagnostics	320850	키트
부품 Amp 2-FL	Advanced Cell Diagnostics	320850	키트 부품
Amp 3-FL	Advanced Cell Diagnostics	320850	키트 부품
Amp 4-FL-Alt	A 고급 셀 진단	320850	키트의 부품
EZ-C1 소프트웨어 패키지	Nikon Instruments		버전 3.81b
SAS/STAT 소프트웨어	SAS Institute, Inc.,		버전 9.4