방법 논문

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

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⸱

DOI:

10.3791/57463

⸱

2018년 5월 21일

 , 
1Department of Laboratory Medicine, University of Washington

이 논문에서

요약

형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

초록

Inflammasomes는 많은 병원 성 생물의 성공적인 제어에 필요한 하지만 또한 염증 촉진 하는 타고 난 면역 신호 플랫폼 autoinflammatory 질병. Inflammasomes 끄 덕 같은 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 cytosolic 패턴 인식 수용 체에 의해 활성화 됩니다. 이 수용 체는 미생물 또는 손상 관련 된 자극의 감지 시 oligomerize. 접합 기 단백질 ASC의 후속 모집 caspase-1 근접 유도 자동 활성화를 통해 활성화 현미경으로 보이는 inflammasome 복잡 한, 형성 한다. 활성화, 따라 caspase-1 프로-일리노이-1β 및 프로-일-18, 활성화 및 이러한 프로 염증 성 cytokines의 분 비를 앞. Caspase-1는 또한 염증 성 형태의 세포 죽음 pyroptosis, 기능 막 무결성 및 셀 세포의 손실이 되 나 중재. Caspase-1 gasdermin D, 원형질 막 숨 구멍을 형성 하는 N 맨끝 파편 공개 삼투성 세포로 이어지는 앞.

골 수 유래 세포 caspase-1 활동 프로브 팸-YVAD-FMK의 라벨 및 어댑터 단백질 ASC에 대 한 항 체와 함께 셀 라벨 시험관, caspase-1의 활성화를 확인할 수 있습니다. 이 기술은 inflammasome 형성 및 caspase-1 활성화 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개별 셀에 식별 수 있습니다. Pyroptotic 세포 죽음은 매체에 cytosolic 젖 산 효소의 릴리스를 측정 하 여 검색할 수 있습니다. 이 절차는 간단 하 고 비용 효과적인 심사에 대 한 적응을 허용 96 잘 접시 형태로 수행 합니다. 이 원고에서 우리 표시 nigericin, NLRP3 inflammasome의 활성화 어댑터 단백질 ASC 및 활성 caspase-1, 공동 현지화를 리드 pyroptosis로 이어지는.

서론

Inflammasome 중재 염증 병원 성 유기 체1에 대 한 방어의 중요 한 구성 요소 이지만, 또한 많은 질병2의 병 인 기초. 다양 한 감염에 염증 반응을 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs)의 cytosolic 탐지에 의해 트리거되는 또는 손상 관련 된 분자 패턴 (DAMPs). 패턴 인식 수용 체 (PRR), 끄 덕 임 같이 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 이러한 감지 시 oligomerize PAMPs 및 DAMPs. 이 다중 단백질 복잡 한 inflammasome, PRR, Apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 C 터미널 caspase 신규 모집 도메인 (카드) (ASC), 그리고 프로 형태의 포함 된 어댑터 단백질을 포함 하 되 나의 형성을 유발 caspase-13,4. 이 복잡 한 근접 유도 caspase-1의 자동 활성화 수 있습니다. 활성 caspase-1 다음 이벤트 염증 성 세포 죽음 통로 pyroptosis의 특성 집합을 리드. 이 이벤트에 포함 됩니다: 분열 그리고 염증 성 cytokines 일리노이-1β 및 세포 외 공간, 핵 응축 및 gasdermin D 분열에 lysosomal 내용의 출시와 함께 리소좀 exocytosis IL 18의 릴리스. Gasdermin D의 출시 된 N 맨끝 도메인 원형질 막 파열 및 병원 체 복제5, 에 대 한 보호 틈새를 데 려 하는 것 외에도 염증 성 내용의 자료를 일으키는 원인이 되는 숨 구멍을 형성 하는 원형질 막에 삽입 6 , 7.

여기, 우리는 잘 공부 NLRP3 inflammasome에 집중 한다. NLRP3 inflammasome의 활성화 2 단계 과정8통해 발생합니다. "프라이 밍"의 첫 번째 단계는 미생물 제품의 통행세 같이 수용 체 (TLR)에 의해 인식 통해 발생합니다. 이 LPS TLR4 자극을 사용 하 여 실험실에서 복제 됩니다. 이 자극 upregulates NLRP3 및 프로-일리노이-1β NF kB 신호를 통해 합니다. 또한 못쓰게 비 transcriptional 메커니즘을 통해 유도 deubiquitination9,10 및 인 산화 또는 특정 잔류물11,12dephosphorylation NLRP3 라이센스.

NLRP3 정품 인증에 대 한 두 번째 신호는 미토 콘 드 리아 요인, 반응성 산소 종, 칼륨 경과 및 신호, 칼슘을 포함 하는 NLRP3 활성화를 위한 통합 메커니즘 애매8남아 있지만 생각 된다. 활성화 된 NLRP3의 시 1 도메인 간의 상호 작용을 통해 oligomerizes 그리고 pyrin (PYD) 도메인13의 바인딩을 통해 ASC 신병. 각 셀에 이러한 고분자 단지 단일 현미경으로 보이는 초점을 형성 한다. ASC 22 KDa 단백질 인간의 백혈병 세포의 apoptosis 동안 "반점"를 형성 하 고 명명 된 apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 포함 된 카드14원래 확인 되었다. 그것은 나중에 ASC 프로-caspase-1 inflammasome15형성 프로-caspase-1의 카드와 함께 ASC의 카드의 상호 작용을 통해 신병 결정 되었다.

모든 NLRs는 caspase-1 활성화를 유도 하는 ASC의 존재를 필요로. 달리 NLRP3, NLRC4 및 NLRP1b 카드 도메인 있고 프로-caspase-1 카드-카드 상호 작용 caspase-1 활성화 유도를 통해 모집 직접 수 있습니다. ASC의 부재, 활성 caspase-1는 cytosol에 걸쳐 확산 유적과 단일 초점을 형성 하지 않습니다. 확산이 활성 caspase-1 pyroptotic 세포 죽음을 유도 하기에 충분 하지만 프로 일 1β13,16처리할 수 있습니다.

이 원고에서 우리 inflammasome 활성화를 평가 하기 위해 두 가지 방법을 설명 합니다. 첫 번째 사용 하 여 형광 활동 프로브, FAM-YVAD-FMK, 프로 테아 제 caspase-1 제품군을 바인딩합니다. 이 가족 caspase-1, 또한 마우스 caspase-11와 인간의 caspase-4 caspase-5 포함 되어 있습니다. 모든 실험에 caspase-1/11 결핍 쥐에서 세포를 사용 하 여이 프로브의 특이성을 해결 것입니다. 이 방법은 항 체 또한 설명 합니다 inflammasome 부품의 라벨 결합 될 수 있다. 현미경 시각화는 개별 셀을 포함 하는 활성 caspase-1와 oligomerized ASC의 식별에 대 한 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여, 연구원은 어디 inflammasome 형성 캐스케이드 호스트 셀 또는 연구에서 병원 성 유기 체 그들의 조작 효과가지고 결정할 수 됩니다. 예를 들어 하나의 주어진된 개입 복잡 한 NLRP3를 ASC의 채용을 방지 또는 후속 모집과 caspase-117의 활성화 여부를 구분할 수 있습니다. Caspase-1 활성화 IL 1β 분 비 등의 결과 검토 것 수 없습니다 이러한 두 가능성 사이 구별 하. 또한, IL 1β의 분 비는 caspase-1을 활성화 하 고 pyroptotic 세포 죽음16받을 수 셀을 변경 하지 않고 변경 될 수 있습니다.

두 번째 방법은 위에서 설명한 caspase-1 활성화 다음 pyroptotic 대 식 세포 세포의 용 해 도중 발생 하는 표면에 뜨는, 셀으로 젖 산 효소 (LDH)의 출시를 측정 합니다. 이 두 번째 방법은 전체에서 LDH의 릴리스 잘 측정은 인구에 기초를 둔 접근 이다.입니다. 이 간단한 접근 caspase 1 중재 하는 세포 죽음 인지 확인 하려면 샘플의 빠른 분석 (보육 시간 30 분)에 대 한 허용 하 고 96 잘 접시 형태로 수행할 수 있습니다.

이러한 메서드는 상호 보완적인, 각각 다른 장점, 그리고 둘 다 쉽게 수정 의무가 있습니다. 예를 들어 inflammasome 자극 이전 대상된 작은 분자량 화합물과 대 식 세포 치료 단백질에 선 동적인 응답을 제어 할 수 있습니다 특정 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 절차 승인 되었고 워싱턴 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침의 대학에서 실시.

1입니다. 골의 수확

  1. Aseptically는 마우스에서 대 퇴 골과 경골을 제거 하 고 불 임 악기를 사용 하 여 뼈를 청소. Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-글루타민 + 0.05 m m 2-mercaptoethanol + 50 mg/mL gentamicin 황산 + 10000 U/mL 페니실린/스 + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS, DMEM-10 완전 한) 청소 뼈를 놓고 알을 품는 15 분 동안 얼음에 튜브.
  2. 가 위를 사용 하 여 인접 및 원심 볼 관절을 제거 합니다. 중간 뼈의 구 렁에 가득 10 mL 주사기에 부착 된 25g 바늘을 삽입 합니다. DMEM-완전 한 10를 사용 하 여 골 수 밖으로 플러시. 어떤 덩어리를 pipetting 매체를 위아래로 부드럽게 하 여 resuspend.
  3. 셀 300 x g에서 10 분 원심 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산. 이 시점에서, 90 %FBS + 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 사용 하 여 셀을 고정 하거나 접시 15cm L929 단련 중간 (단계 2.1)를 사용 하 여 세포 분화를 페 트리 접시에에서 셀.

2. 골 수 유래 세포의 분화

  1. 미리 데워 진된 차별화 매체 (DMEM-10 완전 한의 21 mL 및 L929 세포 조절 매체 스완 손 외 에 설명 된 대로의 9 mL를 사용 하 여 18) 15 cm에서 골 수 세포를 넣어 조직 문화 취급 페 트리 접시 (1.2-1.5 x 107 셀). 7 일 동안 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어. 하루 3 또는 4에 접시를 차별화 매체의 추가적인 30 mL를 추가 합니다.
    참고: 그것은 중요 하다를 취급 하는 조직 문화 접시를 사용 하지 대 식 세포를 분리 하 고 수확 하기 어려울 것입니다.
  2. 대 식 세포를 수집 하려면 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 접시를 세척 하 고 차가운 PBS + 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 20 mL를 추가 합니다. 셀 위에 PBS + EDTA를 pipetting으로 셀 10 분 수확에 대 한 4 ° C에서 접시를 품 어 하 고 PBS의 10 mL와 함께 접시를 씻어. 두 개의 15 mL 원뿔 튜브에 두 세척을 결합 한다.
  3. 10 분에 대 한 300 x g에서 세포를 원심 및 페 놀 레드 무료 DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-글루타민 + 0.05 m m 2-mercaptoethanol, 5%의 10 mL에 셀 resuspend FBS (DMEM-5)는 hemocytometer 또는 Coulter 카운터 중 하나를 사용 하 여 셀을 카운트. 계산 하는 동안 얼음에 셀을 계속.
  4. 2 x 105 셀/mL에 코팅 하는 조직 문화 접시에 있는 대 식 세포 씨앗 현미경 실험, coverslips 24 잘 플레이트에 셀의 1 mL 씨. LDH 방출 분석 실험, 96 잘 접시에 셀의 100 µ L 씨. LDH 분석 결과 대 한 9 웰 스 (3 웰 스 치료, 100% 세포 제어 3 우물과 실험 자극에 대 한 3 웰 스) 씨.
  5. 특정 셀에 게 300 x g에 5 분 동안 원심 분리기는 96 잘 접시는 동등 하 게 잘 분산.
  6. 못쓰게 프로세스를 시작 하기 전에 하룻밤에서 37 ° C + 5% CO2 접시를 품 어.

3입니다. 애 벌 칠

  1. 100 ng/mL LPS 잘 접시 24에 대 한 500 μ (잘 접시는 96에 대 한 50 μ) 포함 된 신선한 매체 (DMEM-5)와 매체를 교체 합니다.
    참고: 다양 한 LPS TLR4 중재 못쓰게19를 자극 하는 능력에 영향을 미치는 구조 변화 있다. 살 모 넬 라 미네소타 R595에서 LPS (Re) 여러 공급 업체에서 제공 하 고 것이 좋습니다.
  2. 37 ° C, 5% CO23 h에 대 한 접시를 품 어.

4. Nigericin와 NLRP3 Inflammasome 및 팸-YVAD-FMK로의 활성화

  1. 매체를 제거 하 고 290 μ DMEM-5 5 μ M nigericin 및 5mm 글리신의 바꿉니다. 글리신은 caspase-1 활성화5하는 동안 발생 하는 세포 세포의 양을 줄이기 위해 추가 됩니다. 37 ° C, 5% CO260 분 동안 품 어. 야생 유형 및 caspase-1 부족 한 대 식 세포를 사용 하 여 관찰된 변하면 caspase-1에 대 한 특정 되도록.
  2. 마지막 45 분 동안 추가 30 10 μ x 팸-YVAD-FMK, 제조업체의 지침에 따라 준비.
  3. 60 분 후에 매체를 제거 하 고 씻어 3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 함께 차가운 PBS의 셀.
  4. 각 음을 2 %paraformaldehyde 250 μ를 추가 하 고 30 분 동안 알루미늄 호 일로 덮여 얼음에 품 어.
  5. 마지막 5 분 동안 4 μ의 핵을 0.2 m m 빨강 형광 핵 산 얼룩을 추가 합니다. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 다른 염료 상표 DNA 사용할 수 있습니다.
  6. 세 번 차가운 PBS의 1 mL로 세포 세척 하 고 7 μ 방지 페이드 설치 매체를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslips를 탑재. 장착 매체 매니큐어를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslip 밀봉 하기 전에 밤에 강화 하자.
  7. Confocal 현미경 검사 법에 의해 대 식 세포를 이미지. 예 스 / 팸-YVAD-FMK에 대 한 Em 492/520nm 642/661 빨강 형광 핵 산 얼룩에 대 한. 현미경 치료 셀 488 채널에 얼룩 어떤 배경 표시 안 되도록 설정 되었는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 배경 식구 들-YVAD-FMK 얼룩 감지 하 고 실제 활성 caspase-1 될 것입니다.
    참고: 현미경 설정 섹션 6에서에서 설명 되어 있습니다.

5. 항 체 얼룩이 지기

참고: ASC를 검출 하기 위하여 항 체와 함께 셀 라벨, 씨앗, 프라임 고 노출 셀 nigericin 이전 섹션에 동일 하. 처리 후는 다음과 같습니다:

  1. 3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 함께 차가운 PBS의 세포를 씻어. 고정 및 permeabilization 솔루션의 250 μ를 추가 합니다. 얼음에 셀을 품 어 그리고 30 분 동안.
  2. 3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 워시 버퍼의 대 식 세포를 씻어.
  3. ASC에 대 한 1 차적인 항 체의 250 μ 희석 1: 500 워시 버퍼에 추가 하 고 얼음에 1 시간에 품 어. 포함 한 coverslip 어떤 1 차 항 체에 영향을 받지 않는 하지만 보조를 받을 것 이다. 이 coverslip 올바른 오프셋을 설정 하는 현미경 설치 하는 동안 사용 됩니다.
  4. 셀 5 분 각 1 mL 워시 버퍼에 대 한 세 번 씻는 다.
  5. 이차 항 체 (형광 색소 활용 된 염소-안티-마우스)의 250 μ 워시 버퍼에서 1: 500을 희석 하 고 얼음에 1 시간에 대 한 품 어를 추가 합니다. 레이블 핵에 0.2 m m 빨강 형광 핵 산 얼룩이이 외피의 마지막 5 분의 4 μ를 추가 합니다.
  6. 3 세포를 씻어 감기 워시 버퍼 및 현미경에 coverslips 7 μ 방지 페이드 설치 매체를 사용 하 여 슬라이드 마운트의 1 mL x. 장착 매체 투명 매니큐어를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslip 밀봉 하기 전에 밤에 강화 하자.
  7. Confocal 현미경 검사 법에 의해 이미지 세포입니다. 전 이차 항 체에 대 한 Em은 555/580 / nm와 642/661 빨강 형광 핵 산에 대 한 얼룩 (아래와 같이).
    참고: FAM-YVAD-FMK와 항 체 라벨로 표시 활성 caspase-1 및 ASC 공동 현지화를 결합 수 있습니다. 이 위해 식구 들-YVAD-FMK 라벨에 대 한 조건에 따라 하 고 추가 처리를 위해 프로토콜 라벨 항 체로 전환.

6. Confocal 현미경 검사 법에 의해 레이블이 세포 이미징

참고: 후에 coverslips 하룻밤 치료와 매니큐어와 현미경 슬라이드에 밀폐 되어 허용 된 스테인드 세포를 볼 수 있습니다. 여기, 이미징 confocal 현미경을 사용 하 여 설명 합니다. 세포는 또한 표준 형광 현미경으로 볼 수 있습니다.

  1. 현미경 단계에 치료 제어 셀과 슬라이드를 놓고 셀에 현미경을 집중 합니다.
  2. 치료 되지 않는 셀에 긍정적인 팸-YVAD-FMK 얼룩이 지는 그런 현미경 볼을 테이블 (LUT) 설정을 사용 하 여, 오프셋을 조정 합니다. 이 과정 또한 caspase-1 부족 한 세포를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
    참고: 오프셋, 실험에 사용 되는 각 채널에 대 한 조정 해야 하지만 올바른 오프셋을 설정 하는 것이 식구 들-YVAD-FMK 채널 및 형광 항 체 채널에 대 한 가장 중요 한. DNA 채널에 대 한 오프셋은 덜 중요 합니다. 오프셋을 설정 실험의 나머지 부분에 대 한이 설정을 조정 하지 않습니다.
  3. 취급 하는 nigericin 샘플 슬라이드를 전환 합니다. 긍정적이 고 식구 들-YVAD-FMK 얼룩에 대 한 부정적인 두 셀을 포함 하는 필드를 찾아. 긍정적인 얼룩이 지기의 가장 높은 강도 가진 비행기로 팸-YVAD-FMK 채널의 영상 평면을 조정 합니다. 이것은 일반적으로 비행기 inflammasome 초점의 센터 몇 군데 됩니다.
  4. 그런 foci 응축된 핵이 있는 셀에 표시 되는 이득을 조정 합니다. 이득 및 오프셋을 설정한 후 이미징 세션의 나머지 부분에 대 한 이러한 설정을 둡니다.
    참고: 셀 pyroptotic 인지 확인 하는 쉬운 편도 핵 형태를 보고는. 활성 caspase-1 셀 둥근 이며 응축된 핵, nucleoli caspase-1 활성화 및 핵 형태학 없이 세포에서 볼 수 있습니다 하는 동안 치료 세포의 것과 유사 합니다.
  5. 총 배율 X 100에 5 무작위로 선택 된 필드의 이미지를 수집 합니다. 이 이미지 당 약 40 셀 일반적으로 발생 합니다. 각 샘플에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.
  6. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 이미지에는 셀의 수를 계산 합니다. 다음 긍정적인 팸-YVAD-FMK 얼룩이 있는 셀의 개수를 계산 합니다. 팸-YVAD-FMK 긍정적인 세포의 백분율로 caspase-1 활성화의 수준을 나타냅니다.

7. LDH 자료 분석 결과

참고: LDH 자료 분석 결과 대 한 씨앗과 프라임 셀 이전 섹션에 설명 된 대로 제외 하 고 사용 하 여 96 잘 접시. 못쓰게 후 매체를 제거 하지 마십시오.

  1. DMEM-5 실험 웰 스에 10 μ M nigericin 및 50 μ의 50 μ 추가 자연과 100% 세포 제어 웰 스 DMEM-5. 때문에 목표 셀 세포를 측정 하는이 실험에서 글리신을 추가 하지 마십시오. 37 ° C, 5% CO260 분 동안 품 어.
  2. 30 분 후 100% 세포 제어 웰 스에 10 x 세포의 용 해 버퍼의 10 μ를 추가 하 고 다른 우물에 DMEM 5 10 μ를 추가 합니다. 이 부 화 하는 동안 냉장고에서 기판 믹스 (동결된 기판의 1.5 mL)의 1 유리병과 분석 결과 버퍼 (~ 12 mL) 1 약 수를 제거 하 고 실내 온도에 빛에서 보호 해 동 그들.
    참고: 기판 믹스 빨간색 formazan 제품으로 변환 되는 tetrazolium 소금 (iodonitro tetrazolium 바이올렛), 포함 합니다.
  3. 60 분 총 부 화 후 10 ° c.에 x 500g에 5 분 동안 접시를 원심 분명 평면 하단 플레이트에는 상쾌한의 50 μ를 전송 합니다. 이 시간 동안 기판 믹스의 유리병에 분석 결과 버퍼의 12 mL을 추가 하 고 사용 하기 전에 5 분 동안 실 온에서 품 어.
  4. 50 μ 기판의 각 음을 추가 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 품 어. 중간만 웰 스 빈 값을 포함 합니다. 신호 플레이트 리더의 검출 한계를 초과 하지 것입니다 되도록 15 분 후 접시를 확인 합니다.
  5. 30 분 후 정지 솔루션 (1 M 초 산)의 50 μ를 추가 하 고 OD490 플레이트 리더를 사용 하 여 측정 합니다.
  6. 다음 수식을 사용 하 여 세포 세포의 용 해의 비율을 계산:
    %Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (최대-자발적인)) × 100
    실험: 취급 하는 nigericin 세포; 자연: 치료 세포; 최대: 세포 세포의 용 해 버퍼에 노출

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결과

검출 하기 caspase-1 활성화 nigericin에 노출 다음, 세포 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 처리 했다. 우리 식구 들-YVAD-FMK와 ASC 항 체는 ASC 및 활성 caspase-1 공동 지역화 NLRP3이 중재 inflammasome 활성화 다음 보여 라벨 결합. 그림 1A 5 μ M nigericin에 노출 하는 야생 타입 세포 perinuclear 지역에서 ASC 초점의 형성을가지고 있음을 보여준다. 이 포커스 식구 들-YVAD-FMK와 ASC의 공동 지역화 보는 활성 caspase-1 포함. 활성 caspase-1 긍정적인 세포 핵 응축 보여주는 이러한 셀 pyroptosis 겪고 있다. 그림 1B 는 caspase-1/11 결핍 쥐의 세포는 ASC 초점의 형성을가, 그들은 필요가 없습니다 어떤 활성 caspase-연결 된 1이이 포커스 식구...

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토론

이 원고에서 우리 inflammasome 활성화 및 caspase-1 활성화 murine 골 수 유래 세포에서 NLRP3 자극을 다음의 결과 검사 하는 두 가지 방법을 제시 했습니다. 첫 번째 기술은 형광 기자 팸-YVAD-FMK를 사용 하 여 셀룰러 기준 caspase-1 활성화의 수준을 결정 하는 연구원을 수 있습니다. 이 기자는 caspase-1/11 결핍 세포에 얼룩의 부재에 의해 본 바인딩 효소, caspase-1 가족에 대 한 매우 구체적인. 특이성은 또한 LaRock 외에의해 표시 됩니다. 그들의 원고에서 caspase-1 활성화에 페스트 단백질 YopM의 역할을 설명 하. 그들의 원고에서 그들은 FAM-YVAD-FMK foci caspase-117에 대하여 지시 하는 항 체와 함께 표시 했다 foci와 겹치는 보여줍니다.

어떤 실험으로 거짓 긍정적인 결과 제거 하기 위해 따라야 하는 몇 가지...

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공개 사항

저자는 공개 충돌의 관심을가지고

감사의 글

모든 현미경 W. M. 켁 현미경 센터 다니엘 피터 스의 지원 및 NIH 포상 S10OD016240의 지원으로 이루어졌다. S.L.F.는 NIH K08AI119142와 R21AI130281에 의해 지원 됩니다. 우리는 박사 리처드 Flavell 및 caspase-1/11 결핍 마우스, 박사 브래드 쿡 박사 브래드 쿡 실험실 시설 및 장비를 공유 하기 위한 감사 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
E-MEMATCC30-2003L929 세포 성장용
NCRC 클론 929 (L929)ATCCCCL-1
고정/투과화 키트BD Biosciences554714고정 및 투과화 용액 및 세척 완충액을 포함합니다. 독점 제형. 4.2% 포름알데히드
글리신Biorad161-0718
Cytotox96 비방사성 세포 독성 분석포함 Fisher ScientificPR-G1780기질 혼합 및 분석 완충액 포함; 독점 제형. 정지 용액은 1M 아세트산
FAM-YVAD-FMKImmunocytochemistry Technologies98
DMEM, 고포도당, 글루타민 없음인비트로겐11960044
DMEM, 고당당, 글루타민 없음, 페놀 레드없음 인비트로겐31053028
Dulbecco의 PBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음인비트로겐14190144
소 태아 혈청, 자격을 갖춘 미국 원산지Invitrogen26140079Heat는 55°C에서 비활성화되었습니다. C 50분
동안 GentamicinInvitrogen15750060
ProLong Gold Mounting MediumInvitrogenp36934독점 제형. 경화 장착 매체. 1.46
염소 안티 마우스 ALEXA555InvitrogenA-21422
HEPES (Ultra Pure)Invitrogen11344041
L-GlutamineInvitrogen21051024
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140122
TO-PRO-3Invitrogen InvitrogenT3605far-red fluorescent의 내화율로 경화 핵산 염색
C57BL/6J 마우스Jackson Laboratoy000664
caspase-1/11-/- 마우스Jackson Laboratory016621
Leica SP8X 컨포칼 현미경Leica
Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re)List Biologicals434
anti-ASC clone 2EI-7Millipore-Sigma04-417
beta-mercapto-ethanolMillipore-SigmaM6250-10ML
DMSOMillipore-SigmaD2650-5X10ML
EDTAMillipore-SigmaE5391
Spectramax M3 플레이트 리더분자 장치5000414

참고문헌

  1. Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
  2. Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
  3. Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
  4. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
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