형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.
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방법 논문
Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출
이 논문에서
요약
초록
Inflammasomes는 많은 병원 성 생물의 성공적인 제어에 필요한 하지만 또한 염증 촉진 하는 타고 난 면역 신호 플랫폼 autoinflammatory 질병. Inflammasomes 끄 덕 같은 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 cytosolic 패턴 인식 수용 체에 의해 활성화 됩니다. 이 수용 체는 미생물 또는 손상 관련 된 자극의 감지 시 oligomerize. 접합 기 단백질 ASC의 후속 모집 caspase-1 근접 유도 자동 활성화를 통해 활성화 현미경으로 보이는 inflammasome 복잡 한, 형성 한다. 활성화, 따라 caspase-1 프로-일리노이-1β 및 프로-일-18, 활성화 및 이러한 프로 염증 성 cytokines의 분 비를 앞. Caspase-1는 또한 염증 성 형태의 세포 죽음 pyroptosis, 기능 막 무결성 및 셀 세포의 손실이 되 나 중재. Caspase-1 gasdermin D, 원형질 막 숨 구멍을 형성 하는 N 맨끝 파편 공개 삼투성 세포로 이어지는 앞.
골 수 유래 세포 caspase-1 활동 프로브 팸-YVAD-FMK의 라벨 및 어댑터 단백질 ASC에 대 한 항 체와 함께 셀 라벨 시험관, caspase-1의 활성화를 확인할 수 있습니다. 이 기술은 inflammasome 형성 및 caspase-1 활성화 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개별 셀에 식별 수 있습니다. Pyroptotic 세포 죽음은 매체에 cytosolic 젖 산 효소의 릴리스를 측정 하 여 검색할 수 있습니다. 이 절차는 간단 하 고 비용 효과적인 심사에 대 한 적응을 허용 96 잘 접시 형태로 수행 합니다. 이 원고에서 우리 표시 nigericin, NLRP3 inflammasome의 활성화 어댑터 단백질 ASC 및 활성 caspase-1, 공동 현지화를 리드 pyroptosis로 이어지는.
서론
Inflammasome 중재 염증 병원 성 유기 체1에 대 한 방어의 중요 한 구성 요소 이지만, 또한 많은 질병2의 병 인 기초. 다양 한 감염에 염증 반응을 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs)의 cytosolic 탐지에 의해 트리거되는 또는 손상 관련 된 분자 패턴 (DAMPs). 패턴 인식 수용 체 (PRR), 끄 덕 임 같이 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 이러한 감지 시 oligomerize PAMPs 및 DAMPs. 이 다중 단백질 복잡 한 inflammasome, PRR, Apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 C 터미널 caspase 신규 모집 도메인 (카드) (ASC), 그리고 프로 형태의 포함 된 어댑터 단백질을 포함 하 되 나의 형성을 유발 caspase-13,4. 이 복잡 한 근접 유도 caspase-1의 자동 활성화 수 있습니다. 활성 caspase-1 다음 이벤트 염증 성 세포 죽음 통로 pyroptosis의 특성 집합을 리드. 이 이벤트에 포함 됩니다: 분열 그리고 염증 성 cytokines 일리노이-1β 및 세포 외 공간, 핵 응축 및 gasdermin....
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프로토콜
모든 동물 절차 승인 되었고 워싱턴 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침의 대학에서 실시.
1입니다. 골의 수확
- Aseptically는 마우스에서 대 퇴 골과 경골을 제거 하 고 불 임 악기를 사용 하 여 뼈를 청소. Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-글루타민 + 0.05 m m 2-mercaptoethanol + 50 mg/mL gentamicin 황산 + 10000 U/mL 페니실린/스 + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS, DMEM-10 완전 한) 청소 뼈를 놓고 알을 품는 15 분 동안 얼음에 튜브.
- 가 위를 사용 하 여 인접 및 원심 볼 관절을 제거 합니다. 중간 뼈의 구 렁에 가득 10 mL 주사기에 부착 된 25g 바늘을 삽입 합니다. DMEM-완전 한 10를 사용 하 여 골 수 밖으로 플러시. 어떤 덩어리를 pipetting 매체를 위아래로 부드럽게 하 여 resuspend.
- 셀 300 x g에서 10 분 원심 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산. 이 시점에서, 90 %FBS + 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 사용 하 여 셀을 고정 하거나 접시 15cm L929 단련 ....
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결과
검출 하기 caspase-1 활성화 nigericin에 노출 다음, 세포 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 처리 했다. 우리 식구 들-YVAD-FMK와 ASC 항 체는 ASC 및 활성 caspase-1 공동 지역화 NLRP3이 중재 inflammasome 활성화 다음 보여 라벨 결합. 그림 1A 5 μ M nigericin에 노출 하는 야생 타입 세포 perinuclear 지역에서 ASC 초점의 형성을가지고 있음을 보여준다. 이 포커스 식구 들-YVAD-FMK와 ASC의 공동 지역화 보는 활성 caspase-1 포함. 활성 caspase-1 긍정적인 세포 핵 응축 보여주는 이러한 셀 pyroptosis 겪고 있다. 그림 1B 는 caspase-1/11 결핍 쥐의 세포는 ASC 초점의 형성을가, 그들은 필요가 없습니다 어떤 활성 caspase-연결 된 1이이 포커스 식구.......
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토론
이 원고에서 우리 inflammasome 활성화 및 caspase-1 활성화 murine 골 수 유래 세포에서 NLRP3 자극을 다음의 결과 검사 하는 두 가지 방법을 제시 했습니다. 첫 번째 기술은 형광 기자 팸-YVAD-FMK를 사용 하 여 셀룰러 기준 caspase-1 활성화의 수준을 결정 하는 연구원을 수 있습니다. 이 기자는 caspase-1/11 결핍 세포에 얼룩의 부재에 의해 본 바인딩 효소, caspase-1 가족에 대 한 매우 구체적인. 특이성은 또한 LaRock 외에의해 표시 됩니다. 그들의 원고에서 caspase-1 활성화에 페스트 단백질 YopM의 역할을 설명 하. 그들의 원고에서 그들은 FAM-YVAD-FMK foci caspase-117에 대하여 지시 하는 항 체와 함께 표시 했다 foci와 겹치는 보여줍니다.
어떤 실험으로 거짓 긍정적인 결과 제거 하기 위해 따라야 하는 몇 가지.......
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공개 사항
저자는 공개 충돌의 관심을가지고
감사의 글
모든 현미경 W. M. 켁 현미경 센터 다니엘 피터 스의 지원 및 NIH 포상 S10OD016240의 지원으로 이루어졌다. S.L.F.는 NIH K08AI119142와 R21AI130281에 의해 지원 됩니다. 우리는 박사 리처드 Flavell 및 caspase-1/11 결핍 마우스, 박사 브래드 쿡 박사 브래드 쿡 실험실 시설 및 장비를 공유 하기 위한 감사 합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | L929 세포 성장용 |
| NCRC 클론 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| 고정/투과화 키트 | BD Biosciences | 554714 | 고정 및 투과화 용액 및 세척 완충액을 포함합니다. 독점 제형. 4.2% 포름알데히드 |
| 글리신 | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 비방사성 세포 독성 분석 | 포함 Fisher Scientific | PR-G1780 | 기질 혼합 및 분석 완충액 포함; 독점 제형. 정지 용액은 1M 아세트산 |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, 고포도당, 글루타민 없음 | 인비트로겐 | 11960044 | |
| DMEM, 고당당, 글루타민 없음, 페놀 레드 | 없음 인비트로겐 | 31053028 | |
| Dulbecco의 PBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | 인비트로겐 | 14190144 | |
| 소 태아 혈청, 자격을 갖춘 미국 원산지 | Invitrogen | 26140079 | Heat는 55°C에서 비활성화되었습니다. C 50분 |
| 동안 Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | 독점 제형. 경화 장착 매체. 1.46 |
| 염소 안티 마우스 ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent의 내화율로 경화 핵산 염색 |
| C57BL/6J 마우스 | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- 마우스 | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X 컨포칼 현미경 | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 플레이트 리더 | 분자 장치 | 5000414 |
참고문헌
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677....
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