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방법 논문

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

9.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57465

⸱

2018년 3월 15일

 ,  , 
1Department of Zoology and Physiology and Program in Neuroscience, University of Wyoming

이 논문에서

요약

이 종이 전체 셀 패치 클램프 기록 Xenopus laevis tadpoles의 retinotectal 회로 공부 하는 데 사용 하는 세 뇌 준비를 다루겠습니다. 그것의 자신의 특정 이점 각 준비 신경 회로 기능을 공부 하는 모델로 Xenopus 올챙이의 실험 추적성에 기여 한다.

초록

Xenopus 올챙이 retinotectal 회로, 어떤 형태로 광섬유 tectum에 신경에 직접 synapses 눈에서 망막 신경 절 세포 (RGCs)의 구성 어떻게 신경 회로 공부 하는 인기 모델은 자기 조립. 전체 수행 하는 기능 패치 클램프 기록 중 vivo에서 기록 RGC 갖는 응답을 tectal 뉴런에서 셀 또는 전체 두뇌 준비를 사용 하 여 일반 기본 메커니즘에 대 한 고해상도 데이터의 큰 몸 생성 했다 비정상적인, 회로 형성 및 기능. 여기 우리가 준비 vivo에서 , 원래 뇌 준비를 수행 하는 방법을 설명 하 고 더 최근 개발 tectal 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 녹음을 얻기 위해 수평 뇌 조각을 준비. 각 준비 독특한 실험 장점이 있습니다. Vivo에서 준비 tectal 신경의 눈에 투영 하는 시각적 자극에 직접 응답의 녹음 수 있습니다. 뇌 준비 매우 제어 방식에서 활성화 RGC 축 삭에 대 한 허용 하며 수평 두뇌 슬라이스 준비에서 녹음은 tectum의 모든 레이어에서

서론

Retinotectal 회로 양서류 비주얼 시스템의 주요 구성 요소. 그것은 광섬유 tectum postsynaptic tectal 신경 세포와 시 냅 스 연결을 형성 하는 어디에 그들의 축 삭을 프로젝트 눈에서 RGCs 구성 됩니다. Xenopus 올챙이 retinotectal 회로 신경 회로 형성 기능을 공부 하 고 인기 있는 개발 모델입니다. 그것은 강력한 실험 모델,12,3렌더링이 올챙이 retinotectal 회로의 많은 특성이 있습니다. 한 주요 특성, 그리고이 문서의 초점 tectal 신경, vivo에서 또는 뇌의 준비를 사용 하 여 전체 셀 패치 클램프 기록 수행 하는 기능입니다. 전압 및 전류 클램프 녹음 모드를 지원 하는 앰프와 복 전기 생리학 장비, 전체 셀 패치 클램프 기록 수 높은 해상도에서 특징에 뉴런의 전기 생리학. 그 결과, 전체 셀 패치 클램프 기록 retinotectal 회로 형성의 주요 단계에 걸쳐 tectal 뉴런에서 개발의 상세 하 고 포괄적인 이해 하 고 내장4,5 의 소성 제공 , 6 , 7 고 시 냅 스8,9,,1011 속성. 전체 셀 패치 클램프 tectal 신경 녹음을 결합, 유전자 또는 morpholinos 이러한 뉴런12, 그리고 설립된 시각적 회피 테스트13 통해 시각적 가이드 동작을 평가 하는 방법에 관심을 표현 하는 능력을 촉진 합니다 분자, 회로 기능 및 행동 사이 연결의 id입니다.

데이터 전체 셀 패치 클램프 기록에서 취득 불가능 유전 칼슘 표시기 GCaMP6, 같은 새로운 이미징 접근을 사용 하 여 있기 때문에 높은 해상도의 종류 칼슘 표시기를 사용 하 여 비록 허가 이미징 주의 하는 것이 중요 하다 칼슘의 신경 세포의 큰 인구에 걸쳐 역학 동시에, 아니 직접 또는 확실 한 방법은 특정 전기 매개 변수 somata에서 델타 형광을 측정 하 여 얻을 수 있습니다 그리고 거기 방법은 전압 클램프 측정 하 신경 전류-전압 관계입니다. 명확 하 게이 두 가지 접근, electrophysiological 녹음 및 칼슘 이미징, 겹치지 않는 강점가지고 고 다른 유형의 데이터를 생성. 따라서, 가장 좋은 방법은 해결 되 고 특정 실험적인 질문에 따라 달라 집니다.

여기, 우리가 올챙이 눈 tectum는 vivo에서 준비, 뇌 준비를 사용 하 여의 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 기록 인수에 대 한 우리의 방법을 설명 하 고 새로운 수정14 연구소에서 개발 된 뇌 준비 . 대표적인 결과 섹션에서 각 준비와 얻을 수 있는 데이터의 종류의 실험적인 장점을 보여 줍니다. 문제 해결을 위한 팁 뿐만 아니라 다른 준비의 강점과 한계 토론 섹션에 포함 됩니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 와이오밍 대학에 의해 승인 되었습니다. Electrophysiological 녹음을 포함 한 모든 절차는 실 온, 약 23 ° c.에서 실시 여기에 설명 된 모든 방법은 tadpoles 발달 단계 42 및 49 (Neiuwkoop와 페이 버15에 따라 개최) 사이에서 tectal 신경 기록 최적화 되어 있다.

1. Vivo에서 준비

  1. 올챙이 anesthetize
    1. 0.01% 스 테 인 버그의 솔루션을 포함 하는 작은 페 트리 접시에는 올챙이 놓고 약 5 분 동안 MS-222.
      참고: MS-222 일명 "Tricaine"는 일반적인 물고기와 양서류 마 취. Tadpoles는 m m에서 스 테 인 버그의 솔루션에서 발생 하는: 0.067 4.9 HEPES 5.8 NaCl, KCl, 0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O.
    2. 올챙이 깊이 anaesthetized (무응답과 이상 수영) 2 단계를 진행 하기 전에 확인 합니다.
  2. 해 부/녹음 접시의 바닥에 잠긴된 실리콘 블록을 마 취 올챙이 보안 합니다.
    1. 처분할 수 있는 이동 피 펫을 사용 하 여 외부 기록 솔루션을 포함 해 부/녹음 접시 anaesthetized 올챙이 이동 (115 m m의 NaCl, KCl, 2mm CaCl23 m m, MgCl23 m m, 5mm HEPES, 1mm 포도 당; 조정 7.25 사용 하 여 pH 10 N NaOH, osmolarity 255 mOsm의).
      1. 자발적인 근육을 최소화 하기 위해 기, 아 세 틸 콜린 수용 체 차단제, tubocurarine (100 µ M) 외부 솔루션에 추가 합니다. (일반적으로,이 이루어집니다 외부 솔루션의 10 mL를 100 µ L 10 mM tubocurarine 주식의 추가 200 µ L 피 펫을 사용 하 여).
    2. 곤충 핀을 사용 하 여 보안 올챙이, 등 쪽, 실리콘 탄성 중합체의 침수 블록 (예: Sylgard 184 참조 자료 테이블 세부 정보에 대 한), 어떤 해 접시 바닥에 붙어 있다.
      참고: 핀의 위치는 중요 한: 눈에서 그 프로젝트 뇌, 성의 RGC 축 삭을 impaling 피하기 위해 충분히 꼬리의 양쪽에 그들을 배치 하 고 그냥 눈 tectum (그림 1A) 앞쪽 뇌를 입력.
  3. 중간 선 따라 뇌를 모 깎기.
    1. 두뇌의 명확한 보기에 대 한 살 균 25 G 바늘을 사용 하 여 중간에 따라 표면 절 개 하 여 뇌를 overlying 피부를 제거 합니다.
    2. 신경 관에 바늘을 삽입 하 고 당겨 부드럽게 위쪽으로 (dorsally) 등 튜브의 등 쪽 부분 깔끔하게 절단 (절단) 바닥 플레이트 그대로 (그림 1B)를 떠나 있는 동안 그 같은 중간 축 따라 뇌를 모 깎기.
      참고: 때문에 구심 성 감각 입력 입력은 tectum는 바닥에 접시를 통해 신경 튜브의 바닥 접시 그대로 남아 있을 중요 하다.
  4. Tectal 신경 세포를 포함 하는 투명 한 심 실 막을 제거 합니다.
    1. 전기 생리학 장비에 기록 접시를 이동 하 고 깨진된 유리 피 펫 팁을 사용 하 여 심 실 막 overlying tectal 신경 셀 시체를 제거. 가볍게 섬세 한 작업와이 퍼에 걸쳐 그것을 드래그 하 여 팁을 휴식.
    2. 피 펫 홀더에 피펫으로 나사와 micromanipulator 통해 광섬유 tectum 내려 낮은.
    3. 깨진된 피 펫을 사용 하 여 껍질은 tectum에서 심 실 막.
      참고: 그것은 전체 tectum;에서 멤브레인을 제거 하는 데 필요한 작은 창이 충분 하 고 충분 한 뉴런에 대 한 액세스를 제공.
  5. 패치 클램프 기록을 전체 셀을 가져옵니다.
    참고:이 시점에서 접근이 비슷합니다 Segev, 외. 에 설명 된 대로 마우스 뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음을 실시 16 (그림 1C).
  6. 망막에 투영 하는 빛의 전체 필드 플래시 tectal 신경 응답을 기록 합니다.
    1. 망막에 빛의 전체 필드 플래시 프로젝트, 광학 섬유를 올챙이 눈에 인접 한 장소. 광학 섬유의 다른 끝에 LED 빛 광도 제어할 수 있도록 가변 저항 라인 이다. 앰프의 디지털 출력으로 LED를 트리거하십시오. 이 방법에서는, 섬광 빛의 다양 한 농도의 수는 전체 필드(그림 4)를기록 했다.

2. 뇌 준비

  1. 1.1 1.3 단계를 수행 합니다.
    참고: tubocurarine이이 준비를 위한 외부 솔루션에 대 한 필요가 있다.
  2. 뇌를 격리 합니다.
    1. 25 G 바늘을 사용 하 여 서버 hindbrain (그림 2A).
    2. 올챙이에서 뇌를 분리 하려면 부드럽게 모든 측면 및 복 부 결합 조직 및 신경 섬유를 절단 하는 꼬리-rostral 방향에서 뇌 밑 바늘을 실행 합니다.
  3. 실리콘 엘라 스토 머의 블록에 두뇌를 보호 합니다.
    1. 일단 완전히 해제 후 각 전구 중 하나를 통해 하나의 핀 hindbrain (그림 2B)를 통해 또 다른 핀을 배치 하 여 실리콘 탄성 중합체의 블록에 뇌를 보안 합니다. Tectal 신경에서 기록에 대 한 최적의 구성입니다.
  4. 전기 생리학 장비에 해 범위에서 고정 된 뇌 준비를 포함 하는 접시를 이동 합니다. 1.4 단계에서 설명한 대로 깨진된 유리 피 펫을 사용 하 여 심 실 멤브레인을 제거 합니다.
  5. 바이 폴라 자극 전극에 배치 시 chiasm (어디 각 눈에서 축 삭 책자는 midbrain에 크로스) RGC 축 삭을 직접 활성화 하.
    1. 바이 폴라 자극 전극 rostral, 그리고 거의 옆에, 큰 중간 심 장소. 광학 chiasm는 즉시 rostral 큰 가운데 심 (그림 2B)에 있습니다.
      1. 부드럽게 낮은 자극 전극 다운 시 chiasm에 되도록 작은 덴트 직물에서 형성 된다. 양극 전극은 정밀 하 게 제어 하는 자극의 강도 수 있는 펄스 자극에 의해 구동 됩니다.
  6. Segev, 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 수행 하는 전체 셀 패치 클램프 기록 (그림 2C) 16

3. 수평 뇌 슬라이스 준비

  1. 2.1 2.3 단계를 수행 합니다.
  2. 면도날을 사용 하 여 하나의 광섬유 tectum의 한쪽의 가장 측면 4 (는 비보에 해당 하는 가장 등 4) 소비 세. 이 컷 평면에 평행 rostral 꼬리 그림 3A와 같이 이루어집니다.
  3. 두뇌는 슬라이스 된 실리콘 엘라 스토 머의 측면에 다시 핀 사이드 (somata 및 neuropil는 기록에 대 한 직접 액세스할 수 있습니다)을 향하도록 하 고 실리콘 고무 블록 (그림 3 멀리 직면 하는 뇌의 심 실 표면 B) (있도록 양극 전극 광학 chiasm에 놓일 수 있다).
  4. 전체 셀 패치 클램프 또는 로컬 출원된 잠재적인 기록 (그림 3C) Segev, 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 수행 16

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결과

빛 갖는 응답를 빛의 전체 필드 플래시 결과 응답 개별 tectal 뉴런(그림 4)에서 기록 하는 동안 망막에 예상 된다. 이 특정 프로토콜은 모두 빛 ("에" 응답) 켜기 한 다음 15 신경의 응답을 측정 하도록 설계 되어 나중 "에서 응답." 측정 하는 s Tectal 신경은 일반적으로 응답에 이따금 강력한 전시 (표시 여기에 기록 된 전압 클램프 모드, 신경으로 고정-60mV 측정 시 냅 스 전류 (그림 4B)). 어떤 한 뉴런에서 수신 시 냅 스 드라이브의 양은 자발적 시 냅 스 이벤트 (그림 4C) 기록 하 여 측정할 수 있습니다. 전류-전압 관계 (I-v 곡선)을 신경 점점 depolarized 전위를 스텝으로 ...

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토론

이 작품에서 설명 하는 모든 방법 tadpoles 발달 단계 42 및 49 (Neiuwkoop와 페이 버15에 따라 개최) 사이에서 tectal 신경 기록 최적화 되어 있다. 무대 42는 tadpoles는 충분히 크고 충분히 개발 곤충 핀 vivo에서 녹음 한 뇌 해 부를 수행 하기 위한 뇌의 양쪽에 배치 될 수 있도록. 이전 단계에서는 tadpoles는 근본적으로 2 차원 (즉, 평면), 여기서 설명 하는 접근은 최적이 아닙니다.

용이성에 tectal 신경 수 액세스 하 고 전체 셀 구성에 기록으로 인해이 모델 회로가 되었습니다 어떻게 신경 회로 형태에 대 한 기본적인 발견에 대 한 온상-기능과 기능 하는 동안19를 형성 하는 동안. 여기 우리가 전체 셀 패치 클램프 기록 vivo에서 올챙이 뇌 준비, 다른 녹음 구성, 및 데이터의 다른 유형의 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

NIH 그랜트 SBC COBRE 1P20GM121310-01에 의해 지원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Stemi 스테레오 508Zeiss495009-0006-000 해부 현미경
MS-222 "Tricane"FinquelARF5G양서류 전신 마취
염화나트륨 (NaCl)Fisher ScientificS271-3Stienberg의 용액 및 외부 용액
염화칼륨 (KCl)Fisher ScientificP217-500Stienberg의 용액 및 외부 용액을 준비하는 데 사용
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGStienberg의 용액 및 외부 용액을 준비하는 데 사용
질산 칼슘 테트라 히레이트 (Ca (NO 3 < / sub>) • 4H2O)Sigma-Aldrich237124-500GStienberg의 솔루션을 준비하는 데 사용됩니다   
Magnesium Sulfate (MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04Steinberg의 용액
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500G외부 기록 용액을 제조하는 데 사용
염화마그네슘 (MgCl2)J.T. Baker2444-01외부 기록 용액을 제조하는 데 사용
D-glucose 무수Mallinckrodt Chemicals6066-04외부 기록 용액
Tubocurarine hydrochloride pentahydrateSigmaT2379니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 길항제
곤충 핀미세 과학 도구26002-100.1mm 직경 스테인레스 스틸 핀
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Micro-g Lab TableTMC63-533전기생리학 현미경용 에어 테이블
Inspiron 620 개인용 데스크탑 컴퓨터 Windows 7 64비트DellD06D001컴퓨터 전기생리학 소프트웨어를 실행하는
c2400 CCD 카메라Hamamatsu70826-5전기생리학 이미징용 전하 결합 장치 카메라
7시 방향 슈퍼 플래티넘 스테인리스 면도날질레트CMM01049플래티넘 코팅 스테인리스 면도날
트랜스퍼 피펫피셔 사이언티픽13-711-7M일회용 폴리에틸렌 트랜스퍼 피펫
제 을 준비하는 데 사용 를 제조하는 데 사용 . 유연한 컴퓨터

참고문헌

  1. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
  2. Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
  3. Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
  4. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
  5. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
  6. Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351(2015).
  7. Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
  8. Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
  9. Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
  10. Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
  11. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  12. Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705(2008).
  13. Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  14. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
  16. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024(2016).
  17. Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
  18. Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
  19. Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
  20. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).

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