단백질 집계 세포 산화 스트레스 elicits. 이 프로토콜 amyloidogenic 단백질의 세포내 주와 관련 된, cytometry 사용 하 여 산화 스트레스 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 접근은 아 밀 로이드 β 펩 티 드의 가용성과 집계 경향이 이체의 동작을 연구 하는 데 사용 됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 misfolding 및 녹말 체 conformations로 집계 발병 및 여러 신경 퇴행 성 질환의 진행에 관련 되어있다. 그러나, 여전히 약간의 정보는 어떻게 불용 성 단백질에 대 한 집계는 그들의 독성 효과 비보를 발휘. 단순 간결한 및 진 핵 모형 유기 체, 박테리아와 효 모, 등 세포내 녹말 체 형성, 집계 전파 및 독성 뒤에 있는 메커니즘의 우리의 현재 이해에 크게 기여 했다. 이 프로토콜에서 효를 사용 하 여 단백질의 형성 및 세포질 산화 스트레스에 미치는 영향 관계를 해 부 모델로 설명 합니다. 메서드는 amyloidogenic 단백질의 세포내 수용 성/집계 상태 감지 세포 산화 손상 cytometry (FC)을 사용 하 여 식에서 결과의 정량화 결합 합니다. 이 방법은 간단 하 고 빠르며, 양적입니다. 연구는 그들의 각각 고유한 집계 경향으로 아 밀 로이드 β 펩 티 드 이체의 큰 세트에 기인한 세포질 산화 스트레스를 연관 하 여 기법을 보여 줍니다.
서론
Proteostasis 셀 체력과 노화 프로세스의 근본적인 결정 이다. 셀, 네트워크는 올바른 refolding misfolded 단백질 conformers의 보호자 또는 그들의 타겟된 베이스로 몇 가지 잘 보존 메커니즘1 보장 하기 위한 정교한 단백질 품질 관리에 의해 단백질 항상성 유지 ,2,3,,45. 연구의 많은 발병과 인간의 질병의 광범위 한 범위와 proteostasis, 단백질 misfolding 및 집계의 실패의 진행 사이의 링크에 지원을 제공 합니다. 예를 들어, 단백질 예금의 존재는 많은 신경 퇴행 성 질환, 알츠하이머병, 파 킨 슨 병, 등, 헌팅턴의 질병6,7,8의 병 적인 특징을 간주 됩니다. prionogenic 질병, 고 퇴행 성 비 amyloidoses9. 그것은 집....
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프로토콜
1. S. cerevisiae 문화와 단백질 표정
참고: Aβ 변종 전시 Aβ42 펩 티 드 (그림 1A)의 위치 19 (Phe19)에서 단일 잔류물에 돌연변이 인해 다른 상대 집계 경향. 이 펩 티 드 이체는 녹색 형광 단백질 (GFP), 집계 기자 (그림 1)29역할으로 태그 됩니다.
- 플라스 미드 BY4741 부모의 배경 (타 그의3Δ1 레이2Δ0 만난15Δ0 ura3Δ0)30효 모 세포로 20 Aβ42-GFP 변종에 대 한 인코딩 변환. 각 플라스 미드 GSSGSSG 링커에 의해 GFP를 융합 하는 Aβ42 돌연변이 인코딩합니다. 플라스 미드는 pESC(-URA) 이며 선택 가능한 마커 URA329를 포함.
- 다음 구성 요소와 uracil (사우스 캐롤라이나-우 라) 없이 합성 완전 한 매체 준비: 1.9 g/L 효 질소 uracil, 5 g/L 황산 암모늄과 900 mL ddH2
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결과
이 프로토콜 어디 Phe19은 모든 자연 proteinogenic 아미노산28변경 되었습니다 Aβ42 펩 티 드의 20 이체의 컬렉션을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이 단백질의 이론적인 집계 경향 두 다른 bioinformatic 알고리즘 (AGGRESCAN와 탱고31,32)를 사용 하 여 분석할 수 있습니다. 두 경우 모두에서이 분석 집계 추세, ascribing, 일반적으로 높은 값과 가장 낮은 소수 성 잔류물을 충전 하 고 극 지 것의 진보적인 그라데이션 렌더링 (그림 1B, 1c).
실험적으로 다른 Aβ42 이체의 세포내 집.......
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토론
다양 한 질병 세포 예금6,,78,33으로 misfolded 단백질의 축적에 연결 된다. 많은 노력 계정 단백질 농도를 고려 하지 않습니다, 계산 방법을 사용 하 여 이러한 질병의 발병을 트리거하는 분자 메커니즘을 해명 되었습니다 또는 생체 외에서 접근, 어떤 단백질 농도 반응 동안 상수 남아 있습니다. 그러나, 셀, 내 단백질 지속적으로 합성 되며 혼잡과 비 균질 환경에서 저하. 이 철에, 에서 시험관 및 생체 내에서 집계 속성 사이 amyloidogenic 단백질의 빈번한 불일치를 설명합니다.
왜 간단한 휴대 전화 모델, 효 모, 합리적인 선택 집계를 공부 하 고 더 많은 생물 학적 맥.......
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 효모 세포 BY4741 | ATCC | 201388 | : MATa his3 Δ 1 leu2Δ 0 met15&델타; 0 ura3&델타; 0 |
| pESC(-Ura) 플라스미드 | Agilent Genomics | 217454 | Gal promotor를 사용한 효모 발현 플라스미드. 선택 가능한 마커 URA3 |
| 효모 합성 드롭아웃 매체 보충제 | Sigma | Y1501 | 분말 |
| 효모 질소 염기 아미노산 없음 | 시그마 | Y0626 | 분말 |
| 라피노스 | 시그마 | R7630 | 분말 |
| 포도당 | 시그마 | G7021 | 분말 |
| 갈락토스 | 시그마 | G0750 | 분말 |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | 솔루션 10X |
| CellROX 딥 레드 시약 | Life Technologies | C10422 | 자유 라디칼 세포 투과성 형광 센서, 감소 상태에서는 비형광, 반응성 산소종(ROS)에 의한 산화 시 밝은 형광을 나타내며, 흡수/방출 최대값은 644/665 nm입니다. |
| Y-PER 단백질 추출 시약 | Thermo Scientific | 78990 | 액체 세포 용해 버퍼 |
| 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 | 시그마 | A6050 | 솔루션 |
| 브래드포드 염료 시약 | Bio-Rad | 단백질 농도의 한 단계 측정을 위한 5000205 염료 시약 | |
| &베타;-아밀로이드 항체 6E10 | BioLegend | 803001 | 마우스 IgG1. 에피토프는 베타 아밀로이드(EFRHDS)의 아미노산 3-8 내에 있습니다. |
| 염소 안티-마우스 IgG-HRP 접합체 | Bio-Rad | 1721011 | |
| Membrane Immobilon-P, PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Luminata forte | Merk | WBLUF0100 | Premixed, 즉시 사용 가능한 화학발광 HRP 검출 시약 |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) | Sigma | 93482 | Protease inhibitor. 에탄올 |
| FACSCanto 유세포 분석기에 | BD Biosciences | 657338 | 488 GFP 검출을 위한 nm 블루 레이저, 그리고 635 nm 적색 레이저 / 530/30nm BP 필터 및 660/20 BP 필터 |
| 미니 트랜스 블롯 전기 영동 전사 셀 | Bio-Rad | 1703930 | 단백질 전달 시스템 |
| Mini-PROTEAN Tetra 핸드 캐스트 시스템 | Bio-Rad | 1658000FC | 전기 영동 시스템 |
참고문헌
- Frydman, J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature.
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