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방법 논문

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

6.3K 조회수

DOI:

10.3791/57474

2018년 6월 18일

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜에서는 안전 하 고 효율적인 절차 CD133 수정+ 조 혈 줄기 세포. 제시 비 바이러스 성, 자기 polyplex 기반 접근 자기 공명 화상 진 찰을 통해 관리 셀 제품 모니터링에 관해서는 뿐만 아니라 치료 줄기 세포 효과의 최적화를 위한 기반을 제공할 수 있습니다.

초록

동안 CD133+ 조 혈 줄기 세포 (SCs) 재생 의학 분야에서 높은 잠재력을 제공 하기 위해 입증 되었습니다, 그들의 낮은 유지 비율 관찰된 대규모 세포 사망률 부상된 조직에 주입 후 매우 제한 된 치료 효과입니다. 이러한 한계를 극복 하기 위해 우리가 그들의 관리에 앞서 적당 한 셀 엔지니어링에 대 한 비 바이러스 성 기반된 프로토콜을 확립 하고자 했다. 인간의 CD133 수정+ 셀의 대상 잠재력 뿐만 아니라 통풍 관 효율 및 안전에 관하여 해결 SCs 예측에 관한 (미르) 로드 자석 polyplexes를 사용 하 여 표현. 우리의 프로토콜에 의존, 우리는 CD133 동안 80-90%의 높은 미르 통풍 관 비율을 달성할 수 있는+ 줄기 세포 속성을 받지 않습니다. 또한,이 수정 된 세포는 자기 대상의 옵션을 제공합니다. 우리 여기 CD133의 수정에 대 한 안전 하 고 매우 효율적인 절차 설명+ SCs. 우리는 줄기 세포 치료 효과의 최적화에 대 한 자기 공명 영상 (MRI)을 통해 관리 셀 제품의 모니터링을 위한 표준 기술 제공이 접근을 기대 합니다.

서론

CD133+ 이종 줄기 재생 의학에 대 한 잠재력 약속 된 조상 세포 인구를 대표 하는 SCs. 그들의 조 혈, 내 피, 및 조직적 분화 잠재적인1,2,3 수는 CD133+ 세포, 예를 들어, 차별화를 통해 neovascularization 프로세스에 기여 하 으로 새로 형성 선박 및 프로-신생 paracrine 메커니즘4,5,,67에 의해 신호의 활성화.

30 개 이상의 승인 된 임상 시험 (ClinicalTrails.gov)에서 그들의 높은 잠재력에도 불구 하 고 그들의 치료 결과 중인 여전히 논쟁 적인 토론4. 실제로, SCs의 임상 응용 프로그램 낮은 보존 관심과 대규모 초기 세포 죽음5,

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프로토콜

셀 격리에 대 한 sternal 인간 BM 헬싱키 선언에 따라 연구에 대 한 그들의 샘플을 사용 하 여 그들의 서 면된 동의 준 정보 기증자 로부터 얻은 것입니다. Rostock의 대학 윤리 위원회 제시 연구 (등록 번호 A 2010 23, 2015 년에 연장)을 승인 했습니다.

1. 세포 준비

참고: BM 시험에 대 한 응고를 방지 하기 위해 헤 파 린 나트륨 (250 IU/mL BM)를 사용 합니다.

  1. CD133+ SC 절연
    1. 필요한 솔루션의 준비
      1. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 준비/ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) EDTA (0.5 M)의 4 mL와 1 x PBS의 996 mL를 혼합 하 여 솔루션 (2 mM) 재고. 적극적으로 솔루션을 혼합 하 고 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 여과. 실내 온도 (RT)에 저장 합니다.
      2. 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 5 g 2mm PBS/EDTA의 995 mL를 혼합 하 여 맥 버퍼를 준비 합니다. 적극적으로 솔루션을 혼합 하 고 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 여과. 4 ° c.에 게

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결과

수동 격리와 인간의 BM 파생 CD133의 자석 농축 제시 프로토콜 설명+ SCs 후속 바이러스 독립 셀에 체 외에서 세포 조작 및 에 대 한 비-침략 적 기술 전략, 엔지니어링 vivo 모니터링 도구.

이 3 단계 절연 기술 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 통해 미리 소화 sternal BM에서 MNCs의 분리를 허용합니다. 이후에, CD133+ 적절 한 격리 기술을 사용 하 여 셀 분수를 자석으로 농축 될 수 있다. 이로써 CD133의 농축+ SCs cytometry (그림 1)에 의해 결정 될 수 있는 80% 이상의 높은 순도와 생존 능력. 이 하,만 SC 제품 요구 사항을 일치 하는 추가 실험을 위해 사용 되었다........

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토론

최근 몇 년 동안, CD133+ SCs 등장 유망한 세포 인구로 SC 기반 요법으로 입증 단계 I, II, 및 III에 대 한 임상 시험43,44,,4546, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 ,

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공개 사항

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 연방 교육부 및 연구 (FKZ 0312138A 및 FKZ 316159), EU 구조 기금 (ESF/IVWM-B34-0030/10와 ESF/IVBM-B35-0010/12), 주 Mecklenburg 서쪽 Pomerania 독일과 DFG (DA1296/2-1)에 의해 지원 되었다는 독일 심장 재단 (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) 고 젖은 기초. 또한, F.H. 및 오후는 FORUN 프로그램의로 스톡 대학 의료 센터 (889001)에 의해 지원 됩니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
7-AADBD Biosciences559925
Methylene BlueStemcell Technologies70603%
anti-CD133/2-PE (클론: 293C3)Miltenyi Biotec GmbH130-090-853
anti-CD34-FITC (클론: AC136)Miltenyi Biotec GmbH130-081-001
안티-CD45-APC-H7 (클론: 2D1)BD Biosciences
로다 민 염료; 비오틴에 접합된 Atto 565 염료ATTO-TEC GmbHAD 565-71
BD FACS LSRII 유세포 분석기BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
BSASigma-Aldrich GmbHA7906
CD133 항체 결합 초상자성 철 덱스트란 입자; CD133 MicroBead KitMiltenyi Biotec GmbH130-097-049
콜라겐분해효소 BRoche Diagnostics GmbH11088831001
계수 챔버Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
시아닌 3 염료 표지 전구체 miR; Cy3 염료 표지 Pre-miR 음성 대조군 #1AmbionAM17120
시아닌 5 염료 miR 라벨링 키트; Cy5 염료 라벨 IT miRNA 라벨링 키트Mirus BioMIR 9650
DNAse IRoche Diagnostics GmbH10104159001(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 컨포칼 현미경Carl Zeiss Jena GmbH
FcR 차단 시약, humanMiltenyi Biotec GmbH130-059-901
밝은 녹색 단백질 라벨링 키트; Oregon Green 488 단백질 라벨링 키트Thermo Fisher ScientificO10241
수성 장착 매체; FluoroshieldSigma-Aldrich GmbHF6182
밀도 구배 원심분리 튜브; Leukosep 원심분리기 튜브Greiner Bio-One89048-932
MACS 자석 홀더; MACS MultiStandMiltenyi Biotec GmbH130-042-303
MACS 사전 분리 필터Miltenyi Biotec GmbH130-041-40730 µ m
MACS 분리 칼럼 (MS / LS)Miltenyi Biotec GmbH130-042-201 / 130-042-401
MACS 영구 자석; MACS 분리기Miltenyi Biotec GmbH130-042-302
Millex-HV PVDF 필터MerckSLHV013SL0.45 μ m
마우스 IgG 2b-PEMiltenyi Biotec GmbH130-092-215
아민 반응성 염료; Near-IR LIVE/DEAD 고정성 사세포 염색 키트: Thermo Fisher ScientificL10119
인간 림프구 분리 배지; PancollPan Biotech GmbHP04-60500밀도: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbHP04-53500Ca 및 Mg
PEISigma-Aldrich GmbH408727분지; 25 kDa
페니실린/스트렙토마이신Thermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100 μ g/mL
PFAMerck Schuchardt OHG1040051000
비표지 전구체 miR; Pre-miR miRNA 전구체 음성 대조군 #1AmbionAM17110
RBC 용해 완충액eBioscience00-4333-57
RNAse 오염 제거 용액; RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9780
인간 림프구 배지; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumPan Biotech GmbHP04-16500
재조합 인간 사이토카인 보충제; StemSpan CC100Stemcell Technologies2690
무혈청 조혈 세포 확장 배지; StemSpan H3000Stemcell Technologies9800
Streptavidin MagneSphere 상자성 입자Promega CorporationZ5481
Trypan Blue solutionSigma-Aldrich GmbHT81540.4 %
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific155750200.5 M; pH 8.0
ZEN2011 소프트웨어Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 분광 광도계Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH 초음파 처리 수조Bandelin 전자초음파 공칭 출력: 80W; 초음파 주파수 : 35kHz
560178

참고문헌

  1. Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
  2. Lee, S., Yoon, Y. -S.

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재인쇄 및 허가

태그

CD133