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방법 논문

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

6.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57474

⸱

2018년 6월 18일

 ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜에서는 안전 하 고 효율적인 절차 CD133 수정+ 조 혈 줄기 세포. 제시 비 바이러스 성, 자기 polyplex 기반 접근 자기 공명 화상 진 찰을 통해 관리 셀 제품 모니터링에 관해서는 뿐만 아니라 치료 줄기 세포 효과의 최적화를 위한 기반을 제공할 수 있습니다.

초록

동안 CD133+ 조 혈 줄기 세포 (SCs) 재생 의학 분야에서 높은 잠재력을 제공 하기 위해 입증 되었습니다, 그들의 낮은 유지 비율 관찰된 대규모 세포 사망률 부상된 조직에 주입 후 매우 제한 된 치료 효과입니다. 이러한 한계를 극복 하기 위해 우리가 그들의 관리에 앞서 적당 한 셀 엔지니어링에 대 한 비 바이러스 성 기반된 프로토콜을 확립 하고자 했다. 인간의 CD133 수정+ 셀의 대상 잠재력 뿐만 아니라 통풍 관 효율 및 안전에 관하여 해결 SCs 예측에 관한 (미르) 로드 자석 polyplexes를 사용 하 여 표현. 우리의 프로토콜에 의존, 우리는 CD133 동안 80-90%의 높은 미르 통풍 관 비율을 달성할 수 있는+ 줄기 세포 속성을 받지 않습니다. 또한,이 수정 된 세포는 자기 대상의 옵션을 제공합니다. 우리 여기 CD133의 수정에 대 한 안전 하 고 매우 효율적인 절차 설명+ SCs. 우리는 줄기 세포 치료 효과의 최적화에 대 한 자기 공명 영상 (MRI)을 통해 관리 셀 제품의 모니터링을 위한 표준 기술 제공이 접근을 기대 합니다.

서론

CD133+ 이종 줄기 재생 의학에 대 한 잠재력 약속 된 조상 세포 인구를 대표 하는 SCs. 그들의 조 혈, 내 피, 및 조직적 분화 잠재적인1,2,3 수는 CD133+ 세포, 예를 들어, 차별화를 통해 neovascularization 프로세스에 기여 하 으로 새로 형성 선박 및 프로-신생 paracrine 메커니즘4,5,,67에 의해 신호의 활성화.

30 개 이상의 승인 된 임상 시험 (ClinicalTrails.gov)에서 그들의 높은 잠재력에도 불구 하 고 그들의 치료 결과 중인 여전히 논쟁 적인 토론4. 실제로, SCs의 임상 응용 프로그램 낮은 보존 관심과 대규모 초기 세포 죽음5,,89의 기관에 의해 방해 된다. 추가 CD133의 엔지니어링+ SCs 사전 이식 이러한 난제를 극복 도움이 될.

효율적인 세포 치료에 대 한 전제 조건 치료 관련 셀10engraftment를 향상 시키기 위해 대규모 초기 세포 죽음의 감소 될 것 이다. 현재 연구 시연 첫 1-2 h, 이식된 세포 유형의 독립적인 동안 매우 끼얹는다 뇌와 심장 등 장기에 90-99%의 엄청난 셀 손실 또는 응용 프로그램 경로11,12,13 14,15,16,17,18,19,,2021. 관심22,23,,2425,26의 사이트에 대상 셀에 혁신적인 비-침략 적 전략을 가능 하 게 SC 마그네틱 나노 (MNPs)를 사용 하 여 라벨 고 동시에 셀 MRI27 (MPI) 이미징 자성 입자를 사용 하 여 모니터링 하는 것을 허용 한다. 가장 효율적인 vivo에서 정 맥 주입23,,2428 후 셀 지도 보다 로컬 관리 후 사용한 셀 보존 대상 적용 자성된 셀 연구 . 따라서, 우리의 그룹 superparamagnetic 산화 철 나노 입자29의 구성 된 배달 시스템을 설계. 이 기술로, CD133+ SCs와 인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)는 대상 효율적으로 수, 여 체 외에 시도30,31.

사우스 캐롤라이나 요법에 대 한 또 다른 장애물 초기 세포 죽음32에 기여 하는 이식 후 영향을 받는 조직의 적대적인 염증 성 환경입니다. 여러 사전 컨디셔닝 연구 뿐만 아니라 치료 관련 미르의 응용 프로그램은 테스트33; 그것은 성공적으로 입증 되었습니다 안티 apoptotic 미르 생체 외에서 apoptosis를 억제 고 vivo에서세포 engraftment33을 강화. 이 작은 분자, 20-25의 뉴클레오티드로 구성 메신저 RNAs (mRNAs)의 posttranscriptional 변조기로 서 중요 한 역할을 하 고 따라서 줄기 세포 운명과 행동34를 영향을. 또한, 미르 세 도입 호스트 게놈34에 원치 않는 안정적인 통합을 하지 마십시오.

기본 SCs에 핵 산 (NAs)의 효율적인 도입에 대 한 현재 시도 주로 재조합 바이러스8,35기반으로 합니다. 높은 transfection 효율에도 불구 하 고 재조합 바이러스 조작은 벤치를 머리 맡 번역, 예를 들면, 통제 유전자 발현, pathogenicity, immunogenicity, 및 insertional mutagenesis35에 대 한 주요 장애물이 선물 ,36. 따라서, 폴리머 기반 구조 등 비 바이러스 성 전달 시스템 개발에 중요 하다. 그 중에서 polyethylenimine (페이) 저하, 세포질 통풍 관에서에서 보호 하기 위해 나 결로 등 미르에 대 한 혜택을 제공 하는 유효한 배달 차량 나타내고 endosomal 통해 세포내 릴리스 탈출37,38. 또한, 미르-페이 단지 임상 시험39높은 생체 적합성을 설명 했다. 따라서, 우리의 배달 시스템은 biotinylated의 구성 분기 25 kDa 페이는 streptavidin 입히는 MNP 코어30,,3140에 바인딩된.

이 원고에서는 CD133의 (i)는 수동 격리를 설명 하는 포괄적인 프로토콜 소개+ 사우스 캐롤라이나 사우스 캐롤라이나 제품과의 효율적이 고 부드러운 transfection 전략 (ii)의 상세한 묘사와 인간의 골 수 (BM) 기부에서 한 자석으로 비 바이러스 성 고분자 기반 배달 시스템 CD133의 유전 공학에 대 한+ SCs 미르를 사용 하 여. CD133+ SCs 격리 되며 표면 항 체 기반 자기 활성화 셀 정렬 (맥) 시스템을 사용 하 여 인간의 sternal BM aspirates에서 자석으로 농축. 이후에, 세포 생존 능력 뿐만 아니라 셀 순도 cytometry 사용 하 여 분석 된다. 그 후, 미르/PEI/MNP 단지 준비가 CD133+ SCs는 페. transfection 후 18 h, 통풍 관 효율성과 transfection SC 마커 표현과 세포 생존 능력에의 영향 분석 된다. 또한, transfection 복잡 한 화합물의 세포내 분포의 평가 4 색 레이블 및 구조화 조명 현미경 (SIM)를 사용 하 여 수행 됩니다.

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프로토콜

셀 격리에 대 한 sternal 인간 BM 헬싱키 선언에 따라 연구에 대 한 그들의 샘플을 사용 하 여 그들의 서 면된 동의 준 정보 기증자 로부터 얻은 것입니다. Rostock의 대학 윤리 위원회 제시 연구 (등록 번호 A 2010 23, 2015 년에 연장)을 승인 했습니다.

1. 세포 준비

참고: BM 시험에 대 한 응고를 방지 하기 위해 헤 파 린 나트륨 (250 IU/mL BM)를 사용 합니다.

  1. CD133+ SC 절연
    1. 필요한 솔루션의 준비
      1. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 준비/ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) EDTA (0.5 M)의 4 mL와 1 x PBS의 996 mL를 혼합 하 여 솔루션 (2 mM) 재고. 적극적으로 솔루션을 혼합 하 고 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 여과. 실내 온도 (RT)에 저장 합니다.
      2. 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 5 g 2mm PBS/EDTA의 995 mL를 혼합 하 여 맥 버퍼를 준비 합니다. 적극적으로 솔루션을 혼합 하 고 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 여과. 4 ° c.에 게
      3. 12.5 ml PBS의 콜라 ( Clostridium histolyticum)에서 B의 500 mg을 diluting 하 여 콜라 B 재고 솔루션 (40 mg/mL)를 준비 합니다. 적극적으로 솔루션을 혼합, 350 µ L의 aliquots를 확인 하 고,-20 ° c.에 저장
      4. Deoxyribonuclease (DNAse) 100mg DNase diluting 하 여 솔루션 (10 mg/mL)을 재고 준비 PBS의 10 ml에서 (소 췌 장)에서 나. 적극적으로 솔루션을 혼합, 350 µ L의 aliquots를 확인 하 고,-20 ° c.에 저장
    2. 인간의 BM의 효소 소화
      1. 미리 따뜻한 인간 림프 구 매체 rt 하 고 효소 (1 약 수 각 콜라 B와 DNAse의 20 mL BM 당) 해 동.
      2. 50 mL 원뿔 튜브에 주사기에서는 BM을 수집 하 고 부드럽게 혼합. 모든 기존 혈전을 삭제 합니다.
        참고: 이후 흐름 cytometric 분석에 대 한 1.5 mL 튜브에 undiluted BM의 200 µ L을 전송. 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 합니다.
      3. 새로운 50 mL 원뿔 튜브로 10 mL BM, DNAse의 6 mL PBS/EDTA (2mm), 인간 림프 구 매체, 콜라 b (40 mg/mL), 175 µ L 175 µ L의 20 mL의 추가 나 (10mg/mL). 부드럽게 솔루션을 혼합 하 고 통에 RT에서 30 분 동안 품 어. 나머지 BM 샘플에 대 한 반복 합니다.
    3. 조밀도 기온 변화도 원심 분리
      1. 50 mL 튜브에 매체를 분리 하는 인간 림프 톨의 15 mL를 적용 하 여 50 mL 밀도 그라데이션 원심 분리 관을 프라임. 30에 대 한 1000 x g 에서 원심 분리기 s.
      2. 신중 하 게 레이어 밀도 그라데이션 원심 튜브 필터와 실시간에서 35 분 445 x g 에서 원심 분리기 희석된 BM의 35 mL
        참고: 원심 분리기 설정은 낮은 가속도 (3) 그리고 아무 브레이크 (1).
      3. 조심 스럽게 흔들어 없이 원심 분리기에서 튜브를 제거. 신중 하 게 필터 위에 직접 구름 레이어를 건드리지 않고 위 명확한 솔루션에서 ~ 20 mL를 버리십시오.
      4. 신중 하 게 새로운 50 mL 원뿔 튜브에는 흐림 레이어 (필터 위에 직접 이며 단 세포 (MNCs) 포함)을 전송 하 고 PBS/EDTA와 50 mL의 최종 볼륨을 채우기.
        참고: 하나의 새로운 튜브로 한 BM 환자 샘플에서 모든 MNCs를 결합 합니다.
      5. 1.5 mL 튜브에 10 µ L 50ml 셀 서 스 펜 션의 전송 하 여는 MNCs를 계산 합니다. 3% 아세트산 메 틸 렌 블루의 10 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고는 세 실에 10 µ L를 적용. MNCs의 수를 계산 합니다.
      6. 원심 분리기 MNC 정지 300 x g 에서 10 분에 대 한 폐기는 상쾌한.
        참고: 원심, 동안 진정 4 ° c에서 RT 원심 분리기
    4. 마그네틱 다양 CD133+ SCs 인간의 CD133 항 체에 연결 된 superparamagnetic 철 dextran 입자를 사용 하 여
      참고:이 단계 동안 얼음에서 작동. 4 ° c.에서 사용 될 때까지 저장소 솔루션 맥에서 영구 자석, 분리 열, 및 4 ° c.에 사전 분리 필터 저장
      1. 열 크기를 선택 합니다. < 108 MNCs, 열 사용 MS, x 그리고 1.2 > 1.2 x 108 MNCs LS 열 ( 재료의 표참조)을 사용.
      2. 1 x 108 총 셀 수에 대 한 자기 선택의 준비, 신중 하 게 300 µ L 맥 버퍼 (4 ° C)에 MNCs를 resuspend. 100 µ L FcR 차단 시 약 (4 ° C) 및 100 µ L CD133 항 체에 연결 된 superparamagnetic 철 dextran 입자 (4 ° C)를 추가 합니다.
      3. 부드럽게 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 4 ° c.에 30 분 동안 품 어 부드럽게 인큐베이션 (2-3 배) 동안 세포 현 탁 액을 흔들어.
      4. 1 x 108 총 MNCs. 부드럽게 믹스 셀 서 스 펜 션 및 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기 당 맥 버퍼 (4 ° C)의 2 개 mL를 추가
      5. 맥 자석 홀더를 설정 하 고 연결 맥 영구 자석. 맥 열을 설치 하 고 위에 사전 분리 필터를 적용 합니다.
      6. 맥에서 MS/LS의 첫 번째 열 및 사전 분리 필터 0.5 mL (MS) 또는 맥 버퍼 (4 ° C)의 3 mL (LS) equilibrate.
        참고: 결코 평형 후 건조 맥 열 수 있습니다.
      7. 삭제는 상쾌한 고 1 x 108 총 셀 금액 당 맥 버퍼 (4 ° C)의 500 µ L에서 얻은 펠 렛 resuspend. 사전 분리 필터에 세포 현 탁 액을 적용 합니다.
      8. 세 번 사용 하 여, 각 세척에 대 한 0.5 mL (MS) 맥 열 및 사전 분리 필터 세척 또는 3 mL (LS) 맥의 버퍼 (4 ° C).
        참고: 세 번째 세척 단계 동안 맥 영구 자석으로 두 번째 MAC 열을 설치 하 고 0.5 mL (MS) 또는 3 mL (LS) 맥 버퍼 (4 ° C)와 두 번째 맥 MS/LS 열 equilibrate.
      9. 사전 분리 필터를 삭제 합니다.
      10. 두 번째 MAC 열에 직접 셀 분수 elute: 1 mL (MS) 또는 첫 번째 MAC 열에 5 mL (LS) 맥 버퍼 (4 ° C)에서 추가 및 제거 맥 열 맥 영구 자석. 즉시 두 번째 MAC 열 위에 첫 번째 MAC 열을 전송 하 고 제공 된 플런저를 사용 하 여 맥 열 통해 세포 현 탁 액을 밀어.
      11. 씻어 맥 열 세 번 각 씻어 0.5 mL (MS)에 대 한 사용 하 여 또는 3 mL (LS) 맥 버퍼 (4 ° C).
      12. 1 mL (밀리초) 또는 두 번째 MAC 열에 5 mL (LS) 맥 버퍼 (4 ° C)를 추가 하 고 맥 영구 자석에서 맥에서 열을 제거 하 여 열에서 셀 분수 elute. 즉시 1.5 mL 튜브 (MS) 또는 15 mL 원뿔 튜브 (LS) 위의 두 번째 MAC 열을 전송 하 고 제공 된 플런저를 사용 하 여 맥 열 통해 세포 현 탁 액을 밀어.
      13. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기 신중 하 게 삭제는 상쾌한 고 맥 버퍼 (4 ° C)의 100 µ L에서 얻은 펠 렛 resuspend.
      14. 계산에서 CD133+ 셀: 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액의 전송 6 µ L. 6 µ L trypan 블루 솔루션 (0.4%)를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고는 세 실에 10 µ L를 적용. CD133 수 계산+ 세포.
      15. 저장은 CD133+ 시드까지 얼음에 세포.
  2. 갓 격리 CD133의+ SCs
    참고: 다음 작업 해야 실시 (희미 한 조명만) 밝은 빛에서 보호 한 방에. 달리 명시 하지 않는 한 튜브, 버퍼, 그리고 얼음에 항 체를 유지.
    1. 흐름 cytometric 분석을 위해 SCs의 준비
      1. 두 개의 샘플 (각 10 µ L) BM aliquots의 갓 격리 CD133의 하나의 샘플을 사용 하 여+ SCs (최소, 1 x 104 셀) 분석에 대 한. 1.5 mL 튜브에 세포를 전송 합니다. FcR 차단 시 약의 10 µ L을 추가 하 고 33 µ L의 볼륨에 맥 버퍼 (4 ° C)를 함께 기입.
      2. 각각의 안쪽에 다음 항 체를 추가 ( 표 1참조) 튜브: 안티-CD34-fluorescein isothiocyanate (FITC) (클론: AC136), 안티-CD133/2-phycoerythrin (PE) (클론: 293C 3), isotype PE-마우스 IgG 2b, 제어 안티-CD45-allophycocyanin (APC)-H7 (복제: 2 D 1), 및 7-aminoactinomycin (AAD). 모든 항 체 추가한 후 튜브의 항 체 아래로 흔들. 부드럽게 혼합 솔루션 (최종 볼륨 50 µ L)와 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어
      3. 1 x 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼의 1 mL을 추가, 부드럽게 혼합, 현 탁 액 및 얼음 10 분 4 ° c.에서 10 분 원심 분리기 300 x g 에서 서 스 펜 션에 품 어
      4. 삭제는 상쾌한 고 100 µ L PBS (4 ° C)에서 얻은 펠 렛 resuspend. 흐름 cytometric 분석까지 얼음에 저장 합니다.
    2. Cytometric 분석 CD133의 흐름+ SCs
      1. 세포 생존 능력 및 CD133의 순도 검사를+ 사우스 캐롤라이나는 Hematotherapy의 적응된 국제 사회 및 이식 엔지니어링 (ISHAGE) 흐름 cytometry 제어 전략41 (참조 그림 1에 대표적인 묘사)를 사용 하 여. 다음과 같은 순서를 사용 하 여:
        1 단계: 다양 한 세포 인구 (그림 1A)
        단계 2: 선택의 CD45+ 세포 (그림 1B)
        단계 3: 선택 가능한 CD45의+ 세포 (그림 1C)
        4 단계: 선택 가능한 CD45의+/CD34+ 세포 (그림 1D)
        5 단계: 선택 가능한 CD45의+/CD34+/CD133+ 세포 (그림 1E)
        실행 흐름 cytometer ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라.
      2. 세포 생존 능력 및 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 순도 계산.

figure-protocol-1   공식 1

figure-protocol-2   공식 2

  1. 세포 배양의 갓 격리 CD133+ SCs
    1. 재조합 인간 cytokine x aliquot 100 100 µ L aliquots에 보충 하 고-20 ° c.에 저장 중간 준비 하기 전에 해 동 한 100 x 약 수.
    2. 준비는 CD133+ SC 배양, 혈 청 무료 조 혈 세포 확장 중간 재조합 인간 cytokine 보충 (최종 1 x)와 1% 페니실린/스 보완.
    3. 씨앗 5 x 104 갓 CD133 절연+ SCs 500 µ L 문화 매체와 24-잘 접시에서 transfection에 대 한. 37 ° C, 5% CO2 와 20% O2에 셀을 품 어.
      참고: 씨앗 5 x 104 갓 절연 CD133+ SCs 제어 흐름 cytometric 분석에 대 한.

2입니다. Transfection 복합물의 준비

참고:이 단계 동안 계속 전체 작업 공간 ribonuclease (RNAse)-RNAse 오염 제거 솔루션을 사용 하 여 자유롭고만 RNAse 소모품 소재를 사용 하 여.

  1. 미르의 준비
    참고: 다음 작업 해야 실시 (희미 한 조명만) 밝은 빛에서 보호 한 방에.
    참고: 미르-표본에 대 한: 사용 Cyanine 3 염료 라는 전조 미르와 레이블이 전조 미르.
    1. 미르 재고 솔루션 (50 µ M)를 준비 하려면 적절 한 양의 nuclease 무료 물 (예를 들어, 100 µ L 물에 미르의 희석 5 nmol)에서 미르의 원하는 금액을 희석. 부드럽게 혼합 솔루션, aliquot 미르 주식 (5 µ L), 및-20 ° c 저장
  2. PEI의 준비
    1. 표준 프로토콜 및 참고는 페이 재고 농도31,42 페이 준비 합니다.
  3. MNP의 준비
    1. 표준 프로토콜에 따라 MNPs를 준비 하 고 MNP 재고 농도31,42합니다.
  4. 미르/페이 복합물의 준비
    1. Diluting D-(+) 하 여 5% 포도 당 용액을 준비-nuclease 무료 물 포도 당. 부드럽게 혼합 솔루션, aliquot 주식 (1.5 mL), 및 4 ° c.에 저장
      참고: 다음 작업 해야 실시 (희미 한 조명만) 밝은 빛에서 보호 한 방에.
    2. 24-잘 접시30의 당 20 pmol 미르를 사용 합니다. 미르 미르 0.25 pmol / µ L의 최종 농도에 5% 포도 당 용액에 희석.
    3. 페이 필요한 양의 미르 금액 (20 pmol, 단계 2.3.1)와 기반 (미르)의 인산 염 하 (PEI)의 최적 질소 (N/P) 비율은 페이 재고 농도에 따라 계산 (2.2.1; 단계 여기, 7.5의 비율 사용 되었다)30. 방정식에 따라 5% 포도 당 솔루션의 동일한 금액에서 페이 희석:
      figure-protocol-3
      이를 다시 정렬
      figure-protocol-4    식 3
      여기서 페이 볼륨은 µ L에 [페이]는 m m, 그리고 N/P (이 프로토콜에 대 한 최적화)는 0.75. 0.12 미르 관련 변환 요소 이다입니다.
    4. 미리 희석된 미르와 30에 대 한 소용돌이에 미리 희석된 페이 추가 s.
    5. 미르/페이 실시간 30 분에 대 한 복잡 한을 품 어
  5. 미르/PEI/MNP 복합물의 준비
    참고: 다음 작업 해야 실시 (희미 한 조명만) 밝은 빛에서 보호 한 방에.
    1. 잠복기 동안 미르/페이 단지 sonicating MNPs는 입자에에서는 되도록 RT에서 sonicating 물 목욕에서 35 kHz에서 20 분 및 집계 하지는 MNPs를 준비 합니다.
    2. MNP 재고 솔루션 (2.3.1 단계)에 따라 필요한 MNPs (3 µ g 철/mL)의 수를 계산 합니다.
    3. Sonicated MNPs 미르/페이 단지 및 소용돌이에 대 한 추가 30 미 품 30 분 미르/PEI/MNP 단지 실시간에
  6. 준비를 위한 transfection 단지의 SIM을 사용 하 여 4 색 레이블 지정
    참고: 레이블이 전조 미르를 사용 합니다.
    1. Cyanine 5 염료를 사용 하 여 Cyanine 5 염료 미르 라벨 키트 ( 재료의 표참조)와 미르 라벨 제조업체의 지침에 따라. 나열 된 분 광 광도 계를 사용 하 여 최종 미르 농도 측정 ( 재료의 표참조) 제조업체 (핵 산, RNA-40)에서 제공 하는 사전 설정에 따라에서. 약 수 미르 (5 µ L)-80 ° C에 게 빛 으로부터 보호.
    2. 밝은 녹색 형광 염료 사용 하 여 적절 한 단백질 라벨 키트 ( 재료의 표참조) 페이 라벨 제조업체의 지침에 따라. 마지막 페이 농도 Ninhydrin 분석 결과 (2.2.1 단계)를 사용 하 여 정의 합니다. 약 수는 페이 (볼륨에서 계산에 따라 식 3) 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 저장.
    3. 1:1,000 w/w의 비율을 사용 하 여 비타민 b 복합체에 활용 된 rhodamine 염료는 MNPs 레이블, MNP를 염색. 미르/페이 복잡 한 대형의 준비 동시 rhodamine 염료 및 MNPs를 혼합 하 고 어둠 속에서 30 분에 대 한 솔루션을 품 어. 직접 사용 MNPs를 표시 합니다.

3. CD133 transfection+ SCs

참고:이 단계 동안 계속 전체 작업 공간 ribonuclease (RNAse)-RNAse 오염 제거 솔루션을 사용 하 여 자유롭고만 RNAse 소모품 소재 사용
참고: 다음 작업 해야 실시 (희미 한 조명만) 밝은 빛에서 보호 한 방에.

  1. 직접 갓 격리 CD133 포함 된 적절 한 우물에 dropwise 준비 미르/PEI/MNP 복잡 한 추가+ SCs 문화 매체에.
  2. 접시와 락으로 부드럽게 혼합. 18 h 37 ° C, 5% CO2 와 20% O2에 대 한 셀을 품 어.

4입니다. 미르 Transfection의 분석

  1. 미르 글귀 효율성과 transfection 단지의 세포 독성 시험
    참고: 미르-표본에 대 한: 통풍 관 평가 및 비 페 CD133 전조 미르 라는 Cyanine 3 염료를 사용 하 여+ SCs 흐름 cytometry 제어 게이츠에 대 한.
    참고: 다음 작업 해야 실시 (희미 한 조명만) 밝은 빛에서 보호 한 방에.
    참고: 달리 명시 하지 않는 한 튜브, 버퍼, 그리고 얼음에 항 체 유지.
    1. 4 g PFA 100 mL PBS에에서 희석 하 고 80 ° c.에 해결책을가 열 하 여 paraformaldehyde 재고 솔루션 (PFA, 4%)를 준비 적극적으로 솔루션을 혼합 하 고 pH 값 7.3 조정. Aliquot는 PFA (1.5 mL)을 재고 하 고-20 ° c.에 저장
    2. transfection 후 18 h, 수집 각 잘 별도 1.5 ml에서 튜브. 각 잘 한 번 PBS의 500 µ L을 세척 하 고 같은 튜브에 세포 현 탁 액이 전송.
    3. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기 삭제는 상쾌한 고 4 ° C 맥 버퍼의 100 µ L에서 얻은 펠 렛 resuspend.
    4. 라이브와 죽은 세포를 구별, 부드럽게 혼합 하는 서 스 펜 션, 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어 아민 반응성 염료의 0.5 µ L을 추가 300 x g 4 ° c.에서 10 분에 1 mL PBS (4 ° C) 및 원심 분리기를 추가
    5. 삭제는 상쾌한 100 µ L PBS에서 얻은 펠 릿 resuspend, 33 µ PFA (4%), L을 추가 하 고 흐름 cytometric 분석까지 얼음에 또는 4 ° C에서 저장.
    6. 그림 2에 대표적인 묘사에 따르면 제어 전략을 정렬 합니다. 교류 cytometer에서 샘플을 실행 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라.
  2. 미르 페 CD133의+ SCs
    참고: 사용 레이블 없는 전조 미르로 비 페 CD133+ SCs 흐름 cytometry 제어 게이츠.
    1. 수집 각각 별도 1.5 mL 튜브에 잘와 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심
    2. 1.2 단계에서 설명한 대로 제어 전략을 사용 합니다.
  3. Transfection 단지 SIM에서의 세포내 분포 시험
    1. 단지를 준비 하 고 제 2 및 제 3에서 설명한 대로 셀을 transfect.
    2. 18 h는 transfection 후, 별도 1.5 mL에 각 잘 수집 튜브. 각 잘 한 번 PBS의 500 µ L을 세척 하 고 잘의 각 관으로 세척을 전송. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기
    3. 삭제는 상쾌한 고 PBS에 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)의 1 mL에 얻은 펠 릿 resuspend, 부드럽게 혼합, 현 탁 액 및 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심
    4. 삭제는 상쾌한, PBS의 100 µ L에서 얻은 펠 릿을 resuspend 하 고 20 분 33 µ L PFA (4%)를 추가 합니다.
    5. 불 임 유리 coverslips 및 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기를 포함 하는 새로운 24-문화 접시에 세포 현 탁 액을 전송
    6. 삭제는 상쾌한 고 PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 흔들어 접시와 PBS를 삭제.
    7. 현미경 슬라이드 수성 설치 매체를 사용 하 여 형광을 유지 하 고 적어도 1 시간에 대 한 실시간에 그들을 건조 하에 준비 된 coverslips를 놓습니다.
    8. 100 X 기름 침수 목표를 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. SIM 설정: 405, 488, 561, 및 여기와 3 각, 3 단계, 4, 격자 레이저 라인 당 평균 16-비트 깊이 z-스택 633 nm 레이저 라인: 23 µ m-405, 34 µ m-488, 42 µ m-561, 51 µ m-633.

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결과

수동 격리와 인간의 BM 파생 CD133의 자석 농축 제시 프로토콜 설명+ SCs 후속 바이러스 독립 셀에 체 외에서 세포 조작 및 에 대 한 비-침략 적 기술 전략, 엔지니어링 vivo 모니터링 도구.

이 3 단계 절연 기술 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 통해 미리 소화 sternal BM에서 MNCs의 분리를 허용합니다. 이후에, CD133+ 적절 한 격리 기술을 사용 하 여 셀 분수를 자석으로 농축 될 수 있다. 이로써 CD133의 농축+ SCs cytometry (그림 1)에 의해 결정 될 수 있는 80% 이상의 높은 순도와 생존 능력. 이 하,만 SC 제품 요구 사항을 일치 하는 추가 실험을 위해 사용 되었다....

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토론

최근 몇 년 동안, CD133+ SCs 등장 유망한 세포 인구로 SC 기반 요법으로 입증 단계 I, II, 및 III에 대 한 임상 시험43,44,,4546, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 ,

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공개 사항

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 연방 교육부 및 연구 (FKZ 0312138A 및 FKZ 316159), EU 구조 기금 (ESF/IVWM-B34-0030/10와 ESF/IVBM-B35-0010/12), 주 Mecklenburg 서쪽 Pomerania 독일과 DFG (DA1296/2-1)에 의해 지원 되었다는 독일 심장 재단 (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) 고 젖은 기초. 또한, F.H. 및 오후는 FORUN 프로그램의로 스톡 대학 의료 센터 (889001)에 의해 지원 됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
7-AADBD Biosciences559925
Methylene BlueStemcell Technologies70603%
anti-CD133/2-PE (클론: 293C3)Miltenyi Biotec GmbH130-090-853
anti-CD34-FITC (클론: AC136)Miltenyi Biotec GmbH130-081-001
안티-CD45-APC-H7 (클론: 2D1)BD Biosciences
로다 민 염료; 비오틴에 접합된 Atto 565 염료ATTO-TEC GmbHAD 565-71
BD FACS LSRII 유세포 분석기BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
BSASigma-Aldrich GmbHA7906
CD133 항체 결합 초상자성 철 덱스트란 입자; CD133 MicroBead KitMiltenyi Biotec GmbH130-097-049
콜라겐분해효소 BRoche Diagnostics GmbH11088831001
계수 챔버Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
시아닌 3 염료 표지 전구체 miR; Cy3 염료 표지 Pre-miR 음성 대조군 #1AmbionAM17120
시아닌 5 염료 miR 라벨링 키트; Cy5 염료 라벨 IT miRNA 라벨링 키트Mirus BioMIR 9650
DNAse IRoche Diagnostics GmbH10104159001(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 컨포칼 현미경Carl Zeiss Jena GmbH
FcR 차단 시약, humanMiltenyi Biotec GmbH130-059-901
밝은 녹색 단백질 라벨링 키트; Oregon Green 488 단백질 라벨링 키트Thermo Fisher ScientificO10241
수성 장착 매체; FluoroshieldSigma-Aldrich GmbHF6182
밀도 구배 원심분리 튜브; Leukosep 원심분리기 튜브Greiner Bio-One89048-932
MACS 자석 홀더; MACS MultiStandMiltenyi Biotec GmbH130-042-303
MACS 사전 분리 필터Miltenyi Biotec GmbH130-041-40730 µ m
MACS 분리 칼럼 (MS / LS)Miltenyi Biotec GmbH130-042-201 / 130-042-401
MACS 영구 자석; MACS 분리기Miltenyi Biotec GmbH130-042-302
Millex-HV PVDF 필터MerckSLHV013SL0.45 μ m
마우스 IgG 2b-PEMiltenyi Biotec GmbH130-092-215
아민 반응성 염료; Near-IR LIVE/DEAD 고정성 사세포 염색 키트: Thermo Fisher ScientificL10119
인간 림프구 분리 배지; PancollPan Biotech GmbHP04-60500밀도: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbHP04-53500Ca 및 Mg
PEISigma-Aldrich GmbH408727분지; 25 kDa
페니실린/스트렙토마이신Thermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100 μ g/mL
PFAMerck Schuchardt OHG1040051000
비표지 전구체 miR; Pre-miR miRNA 전구체 음성 대조군 #1AmbionAM17110
RBC 용해 완충액eBioscience00-4333-57
RNAse 오염 제거 용액; RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9780
인간 림프구 배지; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumPan Biotech GmbHP04-16500
재조합 인간 사이토카인 보충제; StemSpan CC100Stemcell Technologies2690
무혈청 조혈 세포 확장 배지; StemSpan H3000Stemcell Technologies9800
Streptavidin MagneSphere 상자성 입자Promega CorporationZ5481
Trypan Blue solutionSigma-Aldrich GmbHT81540.4 %
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific155750200.5 M; pH 8.0
ZEN2011 소프트웨어Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 분광 광도계Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH 초음파 처리 수조Bandelin 전자초음파 공칭 출력: 80W; 초음파 주파수 : 35kHz
560178

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