간단 하 고 효과적인 관리 및 신장 주입을 사용 하 여 작은 물고기의 순환 시스템에 미의 시각화

Summary

이 문서에서는 빠르고, 최소 침 습으로 주사를 형광 미의 작은 물고기의 circulatory system 및 물고기의 혈액에 미의 비보에 시각화의 원칙을 보여 줍니다.

Abstract

맥 관 구조 시각화, 약물 및 백신 납품, 작은 광학 센서 및 유전자 변형 세포의 이식에 대 한 살아있는 유기 체에 마이크로 크기 입자의 체계적 관리를 적용할 수 있습니다. 그러나, 생물 및 동물 실험실에서 주로 사용 되는 작은 동물에 정 맥 microinjections 매우 어려운 고 숙련 된 직원을 필요. 여기, 물고기 신장에 주입 하 여 성인 zebrafish (Danio rerio)의 순환 시스템에 미의 도입에 대 한 강력 하 고 효율적인 방법을 설명합니다. 시각화는 맥 관 구조에 소개 된 미, 하 우리는 물고기 아가미에 간단한 intravital 이미징 기술을 제안 합니다. 주입 된 microencapsulated 형광을 사용 하 여 달성 되었다 vivo에서 zebrafish 혈액 pH의 모니터링 조사, SNARF-1, 설명 기술의 가능한 응용 프로그램 중 하나를 보여 줍니다. 이 문서는 pH에 민감한 염료의 캡슐화에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 빠른 주사의 원리와 형광 신호의 비보에 기록에 대 한 취득된 microcapsules의 시각화를 보여 줍니다. 주입의 제안된 방법 낮은 사망률에 의해 특징입니다 (0-20%)와 높은 효율 (70-90% 성공), 그리고 그것을 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 쉽습니다. 관 상용 열대어와 메 다카 같은 다른 작은 물고기 종에 모든 설명 된 절차를 수행할 수 있습니다.

Introduction

동물 유기 체에 마이크로 크기 입자의 관리 약물 및 백신 납품¹, 맥 관 구조 시각화², 유전자 변형 세포 이식³및 작은 광학 센서 이식 등의 분야에서 중요 한 작업입니다. ^{4 , 그러나 5}., 작은 실험실 동물의 혈관 시스템으로 미 입자에 대 한 주입 절차는 어려운, 특히 섬세 한 수생 생물에 대 한. Zebrafish 같은 인기 있는 연구 표본에 대 한 조언 비디오 프로토콜을 사용 하 여 명백 하 게이 프로시저를.

Intracardiac 및 모 세관 microinjections zebrafish 혈액으로 microobjects의 납품을 위한 훈련 된 인력과 독특한 미세 시설 필요. 이전, 역 궤도 수동 주입³ 전체 셀의 관리에 대 한 간단 하 고 효과적인 방법으로 제안 했다. 그러나, 우리의 경험에 눈 모 세관 네트워크의 작은 지역 때문에 걸리는이 기술에서 원하는 결과 달성 하기 위해 많은 연습.

여기, 우리 기술 순....

Protocol

모든 실험 절차는 동물 실험에 대 한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 실시 했다 하 고는 동물 주제 연구 위원회 연구소의 생물학의 이르쿠츠크 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. Microcapsules의 제조

참고: Microcapsules 형광 염료를 들고 반대로 충전된 polyelectrolytes^7,8의 레이어, 레이어 어셈블리를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 모든 절차는 실 온에서 수행 했다.

1. 형광 염료를 포함 하는 다공성 CaCO₃ microcores 합성, 혼합 SNARF-1-dextran 솔루션 (FITC BSA 등 대부분 폴리머 바인딩된 형광 염료를 사용할 수 있습니다.)의 2 개 mL ~ 2 mg/mL의 농도에서 0.6 mL CaCl_{2의 1 mol/L 솔루션} 와 나₂CO₃ 빠른 교 아래.
   참고: photobleaching;에 형광 염료의 다른 감도에 관심을 지불 (SNARF-1) 같은 빛에 민감한 형광 프로브를 사용 하는 경우는 미의 저장 하 고 조작 ....

Results

얻은 결과 제시 프로토콜의 세 가지 주요 범주 중 하나에서 온: 형광 염료 (그림 1)에 추가 시각화와 microcapsules의 신장 주입의 캡슐화에 의해 형광 미의 형성 모세 혈관 (그림 2 및 3) 아가미와, 마지막으로, vivo에서 스펙트럼의 녹음 SNARF 1 형광 모니터링 하 혈액 pH 수준 (그림 4).

반대로의 계층으로 염료를 포함 하는 템플릿 CaCO₃ 코어의 코팅을 사용 하 여 레이어, 레이어 접근 청구 (PAH와 PSS) 고분자 및 생체 고분자 (PLL-g-PEG)의 가장 바깥쪽 레이어는 간.......

Discussion

Zebrafish 신장으로 미의 주입을 보여 우리 반 투과성 microcapsules 지시자 염료와 로드를 사용 합니다. 따라서, 프로토콜 반대로 충전된 polyelectrolytes^{7,8,,1516,17의 레이어, 레이어 어셈블리를 사용 하 여 microcapsules의 제조에 대 한 지침을 포함 ,18} (그림 1A). 이 기술의 장점은 사용 가능한 실험실 장비로 수행 하기 쉽습니다. 조건 및 화합물 사용에 따라 조작된 microcapsules 0.5에서 나노미터 두께 전해질 셸¹⁵

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-dextran, 70000MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	형광 프로브. 다른 적절한 폴리머 결합 형광 염료를 마이크로캡슐 필러로 사용할 수 있습니다:
알부민-플루오레세인 이소티오시아네이트 접합체(FITC-BSA)SIGMA		A9771	형광 프로브
, 로다민 B 이소티오시아네이트-덱스트란(RITC-덱스트란)	SIGMA	R9379	형광 프로브
염화칼슘	SIGMA	C1016	CaCO3 템플릿 형성
탄산나트륨	SIGMA	S7795	CaCO3 템플릿 형성
폴리(알릴아민 염산염), MW 50000 (PAH)	SIGMA	283215	양이온 고분자
폴리(4-스티렌설포네이트나트륨), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	음이온 고분자
폴리-L-라이신[20 kDa], 폴리에틸렌 글리콜[5 kDa]과 접목, g = 3.0 - 4.5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)	마이크로캡슐의 생체 적합성을 높이기 위한 최종 폴리머
염화나트륨	SIGMA	S8776	적용된 폴리머를 용해시키기 위해
정수 시스템	Millipore	SIMSV0000	탈이온수 제조
CaCO3 템플릿 형성
에펜도르프  연구  플러스 피펫, 1000 µ L	Eppendorf		투여 솔루션
Eppendorf  연구  플러스 피펫, 10 µ L	Eppendorf		분주 솔루션
피펫 팁, 부피 범위 200 - 1000 &마이크로; L	F.L. Medical	28093	투여 솔루션
피펫 팁, 부피 범위 0.1-10  &뮤; L	Eppendorf	Z640069	분주 솔루션
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed	BioSan		마이크로캡슐 원심분리 세척 절차용
Microcentrifuge tube, 2 mL	Eppendorf	Z666513	Microcapsule synthesis and storage
Shaker Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		마이크로캡슐 응집을 줄이기 위해
초음파 세척기			마이크로캡슐 응집을 줄이기 위해
헤드폰			초음파로부터 귀를 보호하기 위해
에틸렌디아민테트라아세트산	SIGMA	EDS	CaCO3 템플릿을 용해하려면
인산나트륨	SIGMA	S9638	pH 완충액의 제조
인산이나트륨	SIGMA	S9390	pH 완충액의 제조
산화나트륨	SIGMA	S8045	EDTA 용액 및 완충액의 pH를 조정하기 위해
온도 조절기 챔버			유리 슬라이드에서 마이크로캡슐을 건조시키기 위해
적혈구 분석기 혈구 계수 챔버			준비된 마이크로캡슐의 크기 분포 및 농도를 조사하기 위해
형광 현미경 Mikmed 2	LOMO		물고기 혈액
내 마이크로캡슐의 생체 내 시각화SNARF-1용 형광 필터 세트(현미경 모델에 따라 선택해야 함, 예시 제공)Chroma		79010	형광 프로브를 사용한 마이크로캡슐 시각화
Fiber spectrometer QE Pro	Ocean Optics		현미경 하에서 마이크로캡슐 보정
광섬유 QP400-2-VIS NIR, 400 μ m, 2m	Ocean Optics		분광계를 현미경 포트와 연결하기 위해
콜리메이터 F280SMA-A	Thorlabs		분광계를 현미경 포트와 연결하기 위해
유리 현미경 슬라이드	Fisherbrand	12-550-A3	현미경 하에서 마이크로캡슐 보정
Coverslips, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	하에서
마이크로캡슐 보정유리 미세 모세관 Intra MARK, 10 µ L	Blaubrand	BR708709	물고기 혈액
정향 오일	SIGMA	C8392	물고기 마
란셋 No 11	Apexmed international BV	P00588	물고기 꼬리를 자르고 인슐린 자기주사기의 끝에서 강철 바늘을 풀기 위해
헤파린, 5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	물고기 혈액 채취 중 물고기 혈액과 접촉하는 모든 표면 처리용
미세 전극이 있는 Seven 2 Go Pro pH	Mettler Toledo		물고기 혈액 pH
인슐린 펜 바늘 Micro-Fine Plus를 측정하려면 0.25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		주입 절차용. 모든 얇은 바늘 (Ø 0.33mm 이하)이 적합합니다
유리 모세혈관, 1 x 75mm	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co	9201075	주입 절차용
가스 토치			강철 바늘을 유리 모세관에 납땜하기 위해
마이크로인젝터 IM-9B	NARISHIGE		마이크로캡슐 현탁액
페트리 접시, 60mm x 15mm, 폴리스티렌	SIGMA	P5481	마취 하에 물고기를 이용한 조작용
플라스틱 숟가락			마취 중인 물고기를 이용한 조작용
축축한 스폰지			마취 중인 물고기를 이용한 조작용
해부 가위	Thermo Scientific	31212	물고기 머리에서 아가미 덮개를 제거하기 위해
파스퇴르 피펫, 3.5 mL	BRAND	Z331767	물고기 아가미를 적시려면