Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한

요약

여기, 선물이 transgene 식 tebufenozide 치료에 의해 pEUI(+) 단일 유전자 스위치를 사용 하 여 변조에 대 한 프로토콜.

초록

Transgene 식의 정확한 제어 생물 학적 및 임상 연구에 바람직합니다. 그러나, 현재 고용된 유전자 스위치의 바이너리 기능을 단일 셀으로 두 치료 식 단위 전송 동시에 사용 하려면, 때문에 유전자 치료에 대 한 시스템의 실용적인 응용 프로그램 제한 됩니다. Transgene 식 시스템을 단순화 하기 위해 단일 벡터의 transgene 식 모듈의 완전 한 세트를 포함 하는 pEUI(+)로 지정 하는 유전자 스위치를 생성 했습니다. 새로 개발된 된 단일 유전자 스위치 높은 GAL4 DNA 바인딩 도메인의 구성 및 수정된 EcR (GvEcR), 최소 VP16 활성화 도메인 GAL4 DNA 바인딩 도메인 (EcR), 수정 된 초파리 ecdysone 수용 체와 융합 시간 복용량에 따라 방식으로 화학 유도의 관리에 응답. PEUI(+) 벡터는 transgene 식 생물 학적 연구와 전 임상 연구에서의 제어를 향상 시키기 위한 잠재적으로 강력한 도구입니다. 여기, 우리 tebufenozide (Teb)의 치료에 의해 pEUI(+) 벡터를 사용 하는 과도 하 고 안정적인 transgene 식의 변조에 대 한 상세한 프로토콜을 제시. 또한, 우리는 화학 유도로 Teb의 사용에 대 한 중요 한 지침을 공유합니다.

서론

여러 다른 유전자 스위치는 transgene 식 세포 배양 및 동물 모델, 성공^1,2,3의 다양 한 각도 정확 하 게 조절 하는 능력에 대 한 탐험 되었습니다. 잠재적인 유전자 스위치 시스템 등 몇 가지 엄격한 기준을 충족 해야: transgene, inducers, 발기인의 무시할 수 시키는, 가역 transgene의 복용량 및 시간에 따른 응답의 정확한 방향 표현 유도 제거, 및 유도 독성 레벨 셀 라인을 실험실 동물^1,2,3쾌활 통해 활성화. 항생물질^4,5, rapamycin^6,7,8, mifepristone^9,10를 포함 하 여 몇 가지 작은 분자 inducers 악용 되어 그리고 ecdysone^11,12,,1314. 일반적으로 이러한 시스템 2 개 또는 3 개의 개별 식 단위를 포함 하는 두 개 이상의 플라스 미드, 하나 또는 두 작성 transcriptional 활동을 얻기 위해 작은 분자 유도 규제 요소 (유도 플라스 미드) 그리고 또 다른 플라스 미드 (effector 플라스 미드) 유도 바인딩된 규제 요소에의 액세스를 허용 하는 규제 DNA 영역 통제 transgene를 포함. 이진 시스템의 주요 단점은 대상 셀에 두 개의 벡터 (유도 및 effector)의 수 반하는 도입 필요. 과도 transgene 식 실험에서 두 개의 플라스 미드의 동시 transfection 필연적으로 생산 하지는 유도 또는 이펙터, 페 단독 또는 공동 하지 똑같이 페 셀의 인구. 또한, 이진 시스템 2 라운드는 어렵고 힘 드는 안정 세포 선 확립 항생제 선택의 필요 합니다. 따라서, transgene 식에 필요한 모든 구성 요소를 결합 하 고 단일 벡터에 규제의 단일 셀의 모든 필수 요소 부수적인 표현 보장 transgene 표현의 규제에 대 한 허용을 이상적인 것 통해 작은 분자 inducers와 치료.

이진 진 스위치의 단점을 극복 하기 위해 우리 최근 개발 단 수 유전자 스위치는 초파리 melanogaster EcR 기반 유전자 유도할 수 있는 시스템¹⁵를 사용 하 여. Ecdysone 중재 유전자 발현 DNA 규제 요소^3,11EcR의 바인딩 차례로 유도 EcR/ultraspiracle (USP) heterodimer를 묶을 때. 척 추가 있는 retinoid X 수용 체 (RXR), 곤충, USP의 ortholog EcR 활성 transcriptional 활성 제¹⁶를 보충 한다. 따라서, 척추 세포 또는 조직에 있는 transgene의 타겟된 식 EcR과 RXR 해야 공동 표현한 동시에 ecdysone 또는 그 촉진제에 의해 자극 되 고 전에. 때문에 EcR 기반 유전자 스위치의 heterodimeric 기능 생 RXR 수준, Padidam 외에의해 영향을 받을 수 있습니다. EcR DNA 바인딩 및 활성화 도메인 분리 GAL4 DNA 바인딩, 포진 심 플렉스 바이러스 단백질 vmw65 교체 (VP16) 활성화 도메인 다음 생 RXR 응답 되었고 한 homodimer 형성 EcR의 ligand 바인딩 도메인에 융합 에 transcriptional 활동¹⁷를 얻을. EcR 기반 유전자 스위치는 homodimer 형성 ecdysone 주 작동 근, Teb^{16의 부재에 cytosol에는 GvEcR와 함께 최소한의 VP16 활성화 도메인의 구성 공상 단백질을 구성 하 여 더욱 향상 되었다 18}. Teb에 바인딩하여는 GvEcR 변경의 subcellular 지 방화는 cytosol에서 핵 zebrafish E1b 10 탠덤와 함께 최소한의 발기인의 구성 하이브리드 발기인 반복 상류 활성화 순서 (UASs) 시작을 인식 하는 ¹⁶대상 유전자의 전사

^16,18전환 이전에 보고 된 EcR 기반 유전자를 단순화 하기 위해, 우리는 자극 transgene 식에 대 한 모든 필수 요소를 갖춘 다음 지정 된 단일 벡터에 결합 시스템의 바이너리 기능 새로 생성 된 벡터, pEUI(+) (은행 승인 번호: KP123436, 그림 1A)¹⁵. GvEcR 드라이버 (이 드라이버)에 응답 하는 이펙터 EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, 및 AflII 인식 시퀀스 (그림 1B) 10 탠덤 UAS E1b 최소한의 발기인을 여러 복제 사이트 (MCS)에 의해 다음 다음 반복 구성 됩니다. 페의 선택을 촉진 하는 또한, 세포는 SV40 발기인 기반 puromycin N-아 세 틸-안정적인 셀 라인 (그림 1)를 유지 하기 위해 드라이버와 이펙터 영역 사이 전이 (PAC) 효소 유전자 배치 했다.

우리는 transgene 식 pEUI(+)를 사용 하 여의 과도 하 고 안정적인 변조에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 우리는 ecdysone 주 작동 근으로 Teb의 성공적인 사용에 대 한 자세한 지침을 제공합니다.

프로토콜

1. Transgene Subcloning

1. PEUI(+)의 MCS에 적절 한 제한 효소 인식 사이트 (또는 사이트)을 선택 하 고 원하는 방향으로 (그림 1) 관심사의 유전자를 subclone.
   참고: EGFP 또는 플래그 피토 프 태그 ankyrin 반복 도메인 13A EcoRI 사이트에 시퀀스 및 결 찰-독립적인 방법¹⁹를 복제 T4 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 pEUI(+) 벡터의 transgene (ANKRD13A) subcloned 이었다.
2. 37 ° c.에서 1 h EcoRI와 pEUI(+) 선형화 믹스 50 ng / µ L의 PCR 증폭 EGFP 또는 ANKRD13A, µ 40 ng/L 함께 pEUI(+) 선형화 및 T4 DNA 중 합 효소 (1 U) 10 분에 대 한 얼음에 부 화 하기 전에 실내 온도 (RT)에 1 분 동안 추가 10 µ L의 100 µ L 직접 반응 혼합물의 반응 다음 변환에 대 한 DH10B 유능한 세포 실험.
   참고: 몇 가지 제한 효소 인식 사이트 pEUI(+) (그림 1B)의 MCS에 추가 된, 있지만 좋습니다 EcoRI 사이트에 대상 유전자 subcloning 결 찰 독립적인 복제 기술^19,20를 사용 하 여.
3. 연속 삽입을 확인 하 고 transfection 적합 DNA 정제 키트를 사용 하 여 DNA를 정화.

2. 과도 Transfection 및 Teb 치료

1. 4 셀 문화 요리 (60 m m 직경) 5-10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 항생제 (100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스) 보완 수정된이 글 Dulbecco의 매체 (DMEM) 5 mL에 갓 passaged HEK293 세포를 준비 합니다. 여기서 부터는, "세포 배양 매체" 또는 단순히 "문화 매체" FBS와 항생제 보충 DMEM을 나타냅니다. 37 ° c.에 HEK293 세포 유지
2. HEK293 세포 transfection 시 약의 3 µ L를 사용 하 여 50-60%의 밀도 순화 된 DNA의 1 µ g transfect. Transfection 시 희석제 (FBS와 항생제 없이 DMEM)의 200 µ L을 추가 포함 하는 DNA. RT에서 30 분 동안 반응 혼합물의 부 화 후 HEK 293 세포 문화 접시에 혼합물을 추가 합니다. Transfection에 대 한 두 가지 요리를 사용 하 고 다른 두 컨트롤로 치료 떠나.
3. Transfection의 12-24 h 후 transfected 샘플 중 하나를 아닌 페 컨트롤 중 하나에 Teb (최종 농도, 0.2-10 µmol)를 추가 합니다. 다른 두 개의 샘플 실험 컨트롤로 치료를 둡니다.
   참고: Teb 재고 솔루션 (디 메 틸 sulfoxide에 녹아 50 m m) 세포 배양 매체, DMEM, 또는 실험적인 매개 변수에 따라 경작된 한 세포에 추가 하기 전에 적절 한 농도에서 인산 염 버퍼 염 (PBS)에 희석 수 있습니다. 그러나, 수성 해결책에 있는 Teb의 낮은 가용성, 때문 매체; Teb의 높은 농도 가진 마스터 믹스를 준비 하지 않도록 대신, 원하는 농도 Teb 포함 된 신선한 매체와 완전 한 세포 배양 매체를 교체 합니다.
4. 37 ° c.에 12-48 h Teb 치료 및 치료 세포 배양
5. EGFP 를 사용 하 여 삽입 하는 경우 ( 그림 2) 형광 현미경 EGFP 식 분석. 그렇지 않으면, immunoblotting 분석 결과 대 한 셀을 수확.
   1. Immunoblotting 분석 결과 대 한 차가운 PBS로 두 번 셀 린스 하 고 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 밖으로 그들을 긁어.
   2. 셀, 말뚝에 대 한 21000 x g 18-25 ° C (RT)에서 2 분 동안에 15 mL 원뿔 튜브에 수확 아래로 회전 합니다.
   3. PBS를 완전히 삭제 후 차가운 포유류 단백질 추출 시 약 0.5 mL을 추가 (M-당), 프로 테아 제 억제 물 (프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 100의 5 µ L), 셀 60 mm 접시에 교양 경우 펠 릿을 함께.
   4. 다시 pipetting의 몇 라운드와 셀을 일시 중지 하 고 18-25 ° C (RT)에서 15 분 동안 정지 셀을 품 어.
   5. 4 ° c.에서 10 분 동안 21000 x g에서 lysate 셀 회전
   6. Microcentrifuge 신선한 1.5 mL 튜브에 수성 상쾌한을 전송 합니다.
   7. 상쾌한 immunoblotting, 적절 한 항 체와 다음 표준 프로토콜 분석.

3. pEUI(+) 유전자 스위치의 게놈 통합 안정적인 HEK293 세포 라인의 세대

1. Transfection 시 약의 15-30 µ L를 사용 하 여 90mm 직경 셀 문화 접시에 50-60% 합칠 HEK293 세포에 있는 transgene로 순화 pEUI(+)의 5-10 µ g transfect. Transfection 시 희석제 (FBS와 항생제 없이 DMEM)의 500 µ L을 추가 포함 하는 DNA. RT에서 30 분 동안 반응 혼합물의 부 화 후 HEK 293 세포 문화 접시에 혼합물을 추가 합니다.
2. Transfection, 후 성장 하 고 표현 하는 37 ° c.에 24-48 시간 (puromycin) 없이 비 선택적 문화 매체에서 puromycin 저항 유전자 제품 transfectants 허용
3. Trypsinization 여 문화 요리에서 세포를 분리. 문화 매체를 삭제 후 씻어 미리 데워 공영 (37 ° C)와 transfectants, 0.25 %trypsin / ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 개 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 1 분 동안 품 어 미리 데워 진된 문화 매체 (10 mL, 37 ° C)를 추가 하 여 트립 신/EDTA를 냉각 후 셀 스 크레이 퍼, 뒤에 21000 x g 18-25 ° c.에 2 분 동안에 15 mL 원뿔 튜브에 원심 분리를 사용 하 여 셀을 수확
4. 다시 미리 데워 진된 문화 매체 (37 ° C), 및 90 m m 신선한 세포 문화 요리에 전송 셀의 10 mL 50 mL에는 transfectants를 일시 중단 합니다. 37 ° C에서 셀 puromycin 치료 전에 50-60 %confluency 문화 (일반적으로,이 약 24-48 시간 걸립니다).
5. 배양 세포 배양 매체 3 µ g/mL puromycin 3-4 주 보충에서 37 ° C에서 transfectants. 선택 기간 동안 세포 배양 매체 선택의 압력을 유지 하기 위해 2-3 일 마다 puromycin (3 µ g/mL)에 포함 된 변경. 셀이 될 때 완전히 confluent, 절차 단계 3.3-3.4 puromycin 포함 된 문화 매체에 따라 그들을 분할. 필요 하지 않은 경우 문화 매체에 나머지 셀을 삭제 합니다.
   참고: Puromycin 선택 조건은 특정 종류에 대 한 실험적으로 설정할 수 있어야 합니다. 우리 세포 배양 매체;에 puromycin의 3 µ g/mL을 사용 이것은 비 페 HEK293 세포 죽음을 유도 하기에 충분 했다.
6. 복제 실린더를 사용 하 여 개별 식민지에서 세포를 수확 하 고 제조업체의 지침을 따르십시오.
   1. 세포 배양 매체를 버리십시오. 미리 데워 진된 (37 ° C) 떠 있는 세포를 제거 하는 PBS로 두번 접시를 헹 구 십시오.
   2. 소독 집게를 사용 하 여 개별 식민지 복제 실린더를 설정 합니다.
   3. 각 실린더에 0.35 %trypsin / EDTA의 0.2 mL를 추가 합니다.
   4. 세포를 분리, 하 서 다음 실린더에 미리 따뜻하게 (37 ° C) 문화 매체의 몇 방울을 추가 때까지 1 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.
   5. 문화 매체의 2 mL 및 1 µ g/mL에 각 잘 puromycin 6 잘 플레이트의 개별 우물에 각 실린더에서 세포를 전송.
      참고: 셀 될 때 confluent, 문화를 확장. 이제 clone(s)는 설정할 수 있습니다.
7. 세포 배양 매체 1 µ g/mL puromycin의 보충에 개별 복제를 유지 관리 합니다.
8. 개별 식민지 immunoblotting와 transgene의 식 수준을 분석 하 여 24 h. 테스트에 대 한 Teb 치료 (최종 농도, 10 µ M)에 그들의 감도 Teb에 클론의 응답 속도 테스트 하 여 확인 합니다. 원하는 복제 (클론)를 선택 합니다. transgene의 유도 수준을 분석 하기 전에 Teb 취급 하 고 37 ° C에서 12-48 시간 배양에서 치료 샘플을 배양. 식 수준 transgene immunoblotting, 단계 2.5.1-2.5.7에서에서 절차를 통해 측정할 수 있습니다.

4입니다. Teb의 고갈

1. Teb 무료 매체 Teb 포함 세포 배양 매체를 대체 하 여 Teb 자극을 끄다.
   참고: 먼저 새로운 문화 접시에 셀 reseeding 없이 성장 매체를 대체 하기 위하여 추천 된다. 잔여 Teb 플라스틱 접시에 집착에 나타나고는 transgene의 강한 배경 식을 이끌어내는 것입니다. 새로운 문화 접시에 셀 reseeding 전에 수확된 세포 배양 또는 PBS로 여러 번 씻어.
   1. Trypsinization 여 문화 요리에서 세포를 분리. Teb 문화 매체를 포함, 삭제 후 미리 데워 공영 (37 ° C)와 두 번 Teb 자극 세포를 씻어, 0.25 %trypsin / EDTA의 1 개 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 1 분 동안 품 어 미리 따뜻하게 Teb 무료 문화 매체 (10 mL, 37 ° C)를 추가 하 여 트립 신/EDTA를 냉각 후 셀 스 크레이 퍼, 뒤에 21000 x g 18-25 ° c.에 2 분 동안에 15 mL 원뿔 튜브에 원심 분리를 사용 하 여 셀을 수확
   2. 다시 미리 따뜻하게 Teb 무료 문화 매체 (37 ° C), 및 3 개의 60mm 신선한 세포 문화 요리에 전송 셀의 5 mL 50 mL에 셀을 일시 중단 합니다. 각각 24, 48, 및 72 h 37 ° C에서 세포 문화.
   3. 다른 시간 지점에서 세포를 수확 하 고 immunoblotting를 사용 하 여 식 수준 있는 transgene의 측정.
      참고: 이러한 실험 조건 transgene 식 Teb 무료 문화 매체 (그림 3)에서 세포의 탐지 약 3 일 후 문화 되었다. 식 수준 transgene immunoblotting 단계 2.5.1-2.5.7 당에 의해 측정할 수 있습니다.

결과

GvEcR 기반 단일 유전자 스위치 그림 1A에서 묘사 된다. PEUI(+) 벡터 Teb와 치료에 의해 규제 transgene 식을 위해 최적화 되었다. PEUI(+) 이펙터 지역 한 10xUAS는 E1b MCS EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, 및 AflII 제한 효소 인식 사이트를 포함 하 여 최소한의 발기인 따라 구성 되어 있습니다. SV40 많은 신호는 MCS (그림 1B) 뒤에 추가 되었습니다. PAC 유전자 puromycin 저항을 수 여 하는 pEUI(+)의 드라이버와 이펙터 지역 사이 삽입 되었다.

활동을 시키는 pEUI(+)의 평가, 하 우리는 MCS의 EcoRI 사이트에 EGFP 를 su...

토론

이진 진 식 스위치를 사용 하 여의 주요 단점은 동시에 대상 셀에 두 개의 별도 플라스 미드 (드라이버 및 이펙터)를 제공 하는 필요. 이 플라스 미드와 inducers^,12,3스위치의 일관성이 응답에서 결과의 부동 한 배급을 이어질 수 있습니다. 두 벡터 시스템의 또 다른 단점은 항생제 선택의 2 라운드의 최소 유망한 셀 라인을 식별 하는 데 필요한 것입니다. 따라서, 하나의 단위를 구성 된 유전자를 유도할 수 있는 카세트 오래 생물학 연구에 사용 하기 위해 모색 되었습니다. PEUI(+) 단 수 transgene 식 스위치 transgene 자극에 필요한 모든 규제 장치를 갖춘 단일 벡터에 포함 됩니다. 따라서, pEUI(+), subcloned transgene의 유도 수준 과도 transfection 실험 및 화학 유도의 복용량에서 transfected D...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
pEUI(+)	TransLab		특허 라이선스가 TransLab Inc.로 이전되었습니다.
Gene-Fect 형질주입 시약	TransLab	TLC-001
HEK293	ATCC	CRL-1573
Tebufenozide	Fluka	31652
클로닝 실린더	Sigma	CLS31668
Puromycin	Corning	58-58-2
항생제	Gibco	15240-062
Trypsin-EDTA	Welgene	LS015-01
DMEM	Welgene	LM001-05
소 태아 혈청	Welgene	S001-01
세포 배양 접시	SPL 생명 과학	11090
마우스 FLAG M2	Sigma	F3165
안티 알파 튜불린 항체	Calbiochem	CP06
복제 실린더	Sigma	CLS31668
NucleoBond Xtra Midi	Macherey-Nagel	740410.1
M-PER 포유류 단백질 추출 시약	Thermo Fisher	78505
100X 프로테아제 억제제 수탉. III	T& 나는	BPI-9200