Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

요약

여기 우리가 수집 하 고 microinjecting precellular 서쪽 옥수수에 대 한 프로토콜 rootworm 배아 생식 변환 및 CRISPR/Cas9-게놈 편집과 같은 게놈 기능 분석을 수행 하기 위해 제시.

초록

서양 옥수수 rootworm (WCR) 옥수수의 중요 한 해충 이며, 해충 관리 전략에 빠르게 적응 하는 능력으로 잘 알려져 있다. RNA 간섭 (RNAi) WCR 생물학 공부를 위한 강력한 도구가 될 수 입증 하고있다, 그것은 한계가 있다. 특히, RNAi 자체는 일시적 (즉 귀착되 지 않는다 관련 된 표현 형의 장기 Mendelian 상속), 그것은 대상 유전자의 DNA 순서를 알고 필요 합니다. 후자 수 수 제한 관심의 표현 형이 제대로 보존 하 고, 또는 심지어 새로운 유전자에 의해 제어 되는 경우 유용한 목표 식별 도전 될 것 이라고, 때문에 불가능. 따라서, 안정적인 돌연변이 체 긴장을 만들고 WCR 게놈의 순서에 관계 없이 조사를 활성화 하는 데 사용할 수 있는 방법의 개발에 의해 WCR의 게놈 도구 상자에서 도구 수를 확장 한다. 여기, 우리가 수집 하 고 핵 산와 precellular WCR 배아를 microinject 하는 데 사용 하는 방법 자세하게. 여기에 설명 된 프로토콜은 유전자 변형 WCR의 생성을 위한, 그러나 CRISPR/Cas9-게놈 편집 수 또한 수행 유일한 차이 배아에 주입 하는 솔루션의 구성 되 고 동일한 프로토콜을 사용 하 여.

서론

서 부 옥수수 rootworm (WCR) Diabrotica virgifera virgifera, 옥수수¹의 중요 해충 이다. 흥미롭게도, WCR 제어를 극복 하기 위해 표시 됩니다 그들은 뿐만 아니라 적응 뿐만 아니라 순수 행동^2,3,,45, 이후 가장 농업 해충 보다 더 빠르게 측정 ⁶. 지난 10 년간, RNA 간섭 (RNAi), 강력한 기능 게놈 도구 WCR^7,8에 대 한 잠재적인 제어 방법으로 조사 되 고 유전자 기능⁹공부 하는 수단으로도 사용 되었습니다. 그러나, RNAi 다른 종에서 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 microinjection에 의해 자주 수행 하는 동안 주입 기반 RNAi WCR에 드문 경우입니다. 사실, 몇 가지 보고서만 RNAi 통해 microinje....

프로토콜

1. 식민지 수준 WCR 성인의 양육

1. 충분 한 양의 WCR 성인 구하는 (500-1000)에서 신뢰할 수 있는 회사 또는 연구 실험실 ( 테이블의 자료 에 대 한 참조 예) 30cm³ 장에 배치.
   참고: 비-diapausing 긴장의 사용이 좋습니다.
2. 제조 업체의 프로토콜을 따르고 WCR 인공 다이어트 준비 하 고 38 온스 컨테이너 1 cm 두꺼운 레이어를 붓고 ( 재료의 표참조). 혼합 후, 최대 2 개월까지 4 ° C에서 사용 하지 않는 다이어트를 저장 합니다.
3. 30cm³ 케이지에 성인 다이어트 (10-15 g) 페 트리 접시 (100 x 15 m m)를 넣어. 음식이 부족 하거나 건조 할 때 더 많은 다이어트를 추가 합니다.
4. 물 소스로 봉사 하 면 롤 (6 "x 3/8"), 장소에서 개최 하는 데 사용 되는 면봉으로 덮여 물 플라스 크 (300 mL)을 넣어. 그것은 부족 하면 물을 변경 합니다.
5. WCR 습도 60%와 26 ° C에서 유지 하 고 14:10 빛 인큐베이터 양육 곤충에 주기.

2. 배아 수집 및 정렬

1. ....

결과

이 프로토콜을 개발할 때 중요 한 고려 사항은 microinjection의 때에 미 발달 발달의 단계 이었다. 특히, 생식 변환 배아 cellularization 이전 DNAs의 microinjection를 요구 한다. DNAs 쉽게 세포 막을 교차할 수 없습니다 때문입니다. WCR 배아 개발 핵 얼룩을 사용 하 여 단계를 시각화 하는 시도 dechorionation WCR 배아의 기본적으로 모든 태아의 무결성에 대 한 책임 보호 막을 녹이 고 때문에 실패 했다. 그러나, 질문의이 라인은 다른 어려움-배아의 충분 한 수량을 적시에 취득에 의해 바 뀌. 필드에서 WCR 여성 토양에 자신의 알을 낳는, 따라서 그것은 놀랄 그 연구실에서 여성만 알을 어둠 속에서 이어야 한다. 이 어려운 짧은 낮 컬렉션 (2-4 h) 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 단일 하룻밤 달걀 누워 수행 하 고 많은 양의 태아를 발견 했다. (그림 1

토론

비록 dsRNAs RNAi 목적으로 WCR의 microinjection 보고⁹, 이것이 microinjecting precellular WCR 배아 생식 변환 수행을 위한 중요 한 과정에 대 한 우수 사례를 확립 하는 첫 번째 프로토콜 및 CRISPR/Cas9 게놈이이 종에서 편집입니다. WCR 배아의 성공적인 microinjection 변환 효율성은 여러 요소에 따라 달라 집니다. 아래는 몇 가지 주요 문제에 영향을이 프로토콜을 사용 하 여 생식 변혁이이 딱정벌레에 대 한 결과.

Precellular 배아를 얻기
위에서 설명 했 듯이, DNA는 세포 막 방법 dsRNA 수 교차 하지 않습니다. 즉, 그것이 중요 한 중요성의 DNA, mRNA, 또는 단백질 cellularization 발생 하기 전에 주입 수 있습니다. 주입의 타이밍은 중요 한, 때문에 embryogenesis 완료 하려면 nondia.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
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1 oz 용기	Anny's 플라스틱 식기	ASET101	계란 용기
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깃털 무게 펜치	Bioquip	4748	유충과 번데기 다루기
Clorox Regular-Bleach1	Clorox	44600-30770	옥수수와 접시 세척
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EGFP 필터	Leica	GFP2	여기 필터: 440– 520 nm, 방출 필터: 510 nm
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