Method Article

선택 하는 람다 cII 돌연변이 탐지 시스템

DOI:

10.3791/57510

⸱

April 26th, 2018

 , 
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 유전자 변형 쥐의 배양된 세포에 람다 선택 cII 돌연변이 분석 결과 또는 해당 동물의 화학/물리적 에이전트 처리에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 접근은 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위한 널리 사용 되었습니다.

Abstract

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유전자 변형 동물 모델 및 돌연변이 탐지 시스템의 수 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위해 개발 되었습니다. 이들의 유전자 변형 생쥐와 돌연변이 탐지 시스템 람다 (λ) 선택 cII 되었습니다 고용 했다 변이 실험에 대 한 전 세계 많은 연구 그룹에 의해. 여기, 우리가 선택 하는 람다 cII 돌연변이 분석 결과, 유전자 변형 쥐/쥐의 배양된 세포에 적용 될 수 있는 대 한 자세한 프로토콜 설명 또는 해당 동물의 화학/물리적 에이전트와 치료. 프로토콜은 다음 단계로 구성 됩니다: 세포에서 게놈 DNA의 (1) 절연 또는 유전자 변형 동물의 기관/조직 치료 생체 외에서 또는 vivo에서각각, 시험 화합물; (2) 게놈 DNA;에서 mutational 리포터 유전자 (즉, cII transgene) 들고 람다 셔틀 벡터의 복구 (3) 포장 구조 벡터의 전염 성 살 균 소;에 (4) 호스트 박테리아를 감염 하 고 유도 cII 돌연변이;의 전파 수 있도록 선택적 조건 하에서 배양 그리고 (5) 득점 cII-돌연변이 DNA 순서 분석을 cII 돌연변이 주파수 및 돌연변이 스펙트럼, 각각.

Introduction

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다양 한 유전자 변형 동물 모델 및 돌연변이 탐지 시스템 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위해 개발 되었습니다. 이들의 유전자 변형 (라고도 BB) 빅 블루 마우스 및 돌연변이 탐지 시스템 λ 선택 cII 있다 변이 실험에 의해 고용 되었다이 그룹 및 많은 다른 연구 그룹 전세계1,2, 3,,45,6,7,,89. 지난 16 년 동안, 우리가이 유전자 변형 동물을 사용 하 여 다양 한 화학 및 물리적 에이전트의 변이 원 성 영향 조사 또는 자신의 해당 미 발달 섬유 아 세포 세포 배양 시험 화합물으로 치료 하 고 이후에 분석은 표현 형 및 λ 선택 cII 분석 결과와 DNA 시퀀싱, 각각

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Protocol

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1. 게놈 DNA 절연 마우스 미 발달 섬유 아 세포에서

참고: 기본 마우스 미 발달 섬유 아 세포는53게시 된 프로토콜 따라 BB 유전자 변형 마우스 C57BL/6 유전 배경에서 파생 된 배아에서 격리 됩니다. 1 x 107 배아 섬유 아 세포 세포 제어 복합 대 테스트와 치료 1 x 106 이 프로토콜에 대 한 시작 물자에 의하여 이루어져 있다. 참조10,,5455는 수확 하 고 표준 방법을 사용 하 여 이러한 셀의 계산을 참조 하십시오.

  1. 준비는 (0.3 M 자당, 60 m m KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5 m m spermidine, 0.15 m m spermine와 2 mM EDTA) 버퍼, 버퍼 B (150 m m NaCl 및 5 m m EDTA, pH 7.8), 및 C (20 mM Tris HCl, pH 8.0 버퍼 20 mM NaCl, 20 mM EDTA, 그리고 1 %SDS) 미리, 및 최대 1 년<....

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Results

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데이터 배포에 따라 패라메트릭 또는 비-파라 메 트릭 테스트 치료 및 제어 그룹 (즉, 자연 스러운 돌연변이 주파수 대 유도) cII 돌연변이 주파수 차이의 중요성을 결정 하기 위해 사용 됩니다. . 다른 치료 그룹 유도 cII 돌연변이 주파수의 비교에 의해 이루어집니다 다양 한 (인덱스도) 적용으로 통계적 테스트. 주파수를 비교 하는 χ2 테스트 또는 분산 분석 (ANOVA), 같은 다른 테스트를 사용할 수 있습니다 있지만 아담스 및 Skopek의 초기 하 시험 전체 유도-그리고 자연 스러운 돌연변이 스펙트럼57, 비교 하 일반적으로 사용 (예를 들어, 전환, transversion, 삽입 또는 삭제) 돌연변이 유도 및 제어 돌연변이 스펙트럼 사이 또는 다른 화학 물질/대리인 또는 동일의 다양 한 복용량에 의해 유도 된 다양 한 돌연변이 스펙트.......

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Discussion

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Λ 선택 cII 분석 결과 BB 설치류3의 장기/조직에서 파생 된 세포의 게놈 DNA에서 복구 cII transgene에 변이의 탐지를 위해 사용 됩니다. 이러한 유전자 변형 동물의 게놈 cII 운반 하는 chromosomally 통합된 λLIZ 셔틀 벡터의 여러 탠덤 복사본이 포함 (294 bp)와 lacI (1080 bp) transgenes mutational 리포터 유전자1, 2 , 25. λ 선택 cII 분석 결과 세포/조직 구조 벡터의 포장 뒤에 적절 한 호스트를 감염 시킬 수 있는 λ 살 균 소 머리에 유전자 변형 동물의 게놈 DNA에서 λLIZ 셔틀 벡터의 검색에 따라 E. 콜라 이입니다. 감염 된 박테리아 점수.......

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Disclosures

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모든 저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

Acknowledgements

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우리는 모든 동료의 기여 금 및 그 결과에 추천 된이 원고 (예시)에 대 한 우리의 원래 연구에 공동 작업자를 인정 하 고 싶습니다. 작가 작품은 AB (California Tobacco-Related 질병 연구 프로그램의 대학 및 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구는 건강의 국가 학회 (1R01DE026043) ab의 교부 금에 의해 지원 TRDRP-26IR-0015)와 세인트 (TRDRP-25IP-0001). 연구의 스폰서 연구 설계, 데이터 수집, 데이터 분석, 데이터 해석, 보고서의 작성 또는 게시를 위해 제출 하는 결정에 있는 역할을 했다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
한천MO 바이오 연구소, Inc.12112-05세균 등급
BigDye Terminator v3.1 주기 염기서열 분석 키트Thermo Fisher Scientific4337455없음
카제인 펩톤Alfa AesarH26557없음
젤라틴J. T. Baker2124-01분말
글리세롤Fisher ScientificBP 229-1 / M-13750없음
LB AgarFisher ScientificBP 9724-500없음
QIAquick PCR 정제 키트Qiagen810450 PCR 정제 반응
아세테이트 나트륨 TrihydrateFisher ScientificM-15756None
Taq5000 DNA 중합효소 Qiagen201207없음
티아민 염산염Macron Fine Chemicals2722-57없음
트랜스팩 포장 추출물Stratagene Corp., BioReliance에 인수 | 시그마-알드리치 주식회사20022350 패키징 반응
트리스 베이스피셔 사이언티픽BP 152-1 / EC 201-064-4없음
트립톤생명과학RC-110없음

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R.

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Lambda Select cII Mutation AssayGenomic DNA IsolationLambda Shuttle Vector RecoveryBacteriophage PackagingHost Bacteria InfectionSelective CulturingcII Mutant ScoringDNA Sequence AnalysisMutagenicity TestingTransgenic Rodent Cells

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