방법 논문

절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서

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DOI:

10.3791/57514

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2018년 5월 22일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, 2Tianjin Agricultural University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 선물이 성인 Schistosoma 나무에서 체 외에서 배양된 매체에 extracellular 소포 (EVs) 격리를 설명 하는 프로토콜.

초록

Extracellular 소포 (EVs)는 막 소포 세포 외 microenvironment로 셀의 다양 한 발표. EVs는 누구의 크기 범위 40 1000 nm 사이 이기종 vesicles의 인구를 나타냅니다. 축적 된 증거는 EVs에 중요 한 역할 규정 호스트 병원 체 상호 작용에 표시. Schistosome EVs에 대 한 깊은 이해는 기본 schistosomiasis에 대 한 새로운 전략의 개발을 활성화 하는 schistosome-호스트 상호 작용 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 해야 합니다. 여기, 우리는 성인 Schistosoma 나무 (S. 머 위)에서 절연 및 EVs의 특성화에 대 한 프로토콜을 제시 하 여 EVs 함수 schistosomes에 진학 하고자 합니다. EVs 문화 매체 체 외에 상업 exosome 격리 키트와 결합 하는 원심 분리를 사용 하 여 격리 했다. 고립 된 미 나무 EVs (SjEVs) 일반적으로 100-400 nm의 직경을가지고 그리고 전송 전자 현미경 검사 법 및 서쪽 blotting에 의해 특징입니다. 염료-표시 된 SjEVs PKH67의 사용 SjEVs 받는 사람 세포에 의해 내 면화는 설명 했다. 전반적으로, 우리의 프로토콜 성인 schistosomes;에서 EVs를 격리 하기 위한 대체 방법을 제공 한다 격리 된 SjEVs 기능 분석에 적합 수 있습니다.

서론

Extracellular 소포 (EVs)는 작은 막 도약 소포와 다양 한 단백질, 지질, 핵 산 캡슐화의 인구. 최근 연구 보여준 EVs 셀 셀 통신에 중요 한 역할을 하 고 셀 개발, 면역 조절, 신생, 세포 마이그레이션2, 등 수많은 생리 적 프로세스의 규칙에 관련 된 3,,45. 증거를 축적 EVs, exosomes, 그리고 그들의 miRNA 화물 순환 특정 질병6의 잠재적인 생체 나타냅니다 나타냅니다.

여러 가지 원생 동물 Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi, 등 Leishmania spp., EVs;를 분 비 수 표시 되었습니다 helminths 발견 되었습니다 또한7호스트 생활에 EVs를 분 비. 기생 EVs pathogenicity8, 감염과 면역 규칙9의 유지 보수에 포함 될 표시 되었습니다. 최근 두 Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 schistosomes에서 공부와 미 나무12 성인 schistosomes 분 수 있는 exosome 같은 소포 비 표명 특정 생물 학적 과정의 기능 규정에 참여.

날짜 하려면, 여러 가지 방법은 extracellular 소포, ultracentrifugation, 외13, 폴리머 기반 시 약, 크기 배제 크로마토그래피, immunoaffinity 격리의 사용을 사용 되었습니다. 이러한 다른 방법을 그들의 자신의 이점 및 제한 사항14. 일반적으로, ultracentrifugation는 소포 격리에 대 한 표준 방법으로 간주 됩니다. 그러나,이 방법은 잠재적인 EV 집계14의 한계에서 고통.

Schistosomes에서 방법의 몇 가지 EV 격리에 대 한 보고 되었습니다: ultracentrifugation11,,1210 와 여러 단계 (달걀16, 상업 EV 격리 키트16 를 사용 하 여 포함 됩니다 schistosomula11, 성인 schistosomes10,,1217). Microvesicles 천 나노미터 몇 백 나노미터 크기의 넓은 범위는, 그 주어진 우리 벤치 원심 분리기, 한, 그리고 분리에서 EVs 상업 킷은 절연을 사용 하 여 결합 하는 대체 방법 개발 성인 Schistosoma 나무. 격리 된 EVs는 일반적으로 100-400 nm의 직경을 소유 하 고 성공적으로 받는 세포에 의해 내 면화 했다.

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프로토콜

모든 동물 실험 상하이 수의학 연구소, 농업 과학의 중국 아카데미의 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 (허가 번호: SHVRIAU-14-0101).

1. Schistosomes 의 생체 외에서 문화

참고: Schistosomes 는 생물을 나타냅니다. 노동자 때 생물 학적 재료 관련 웜, schistosomal 정지, 또는 다른 처리 시간 라텍스 장갑을 전혀 착용 해야 한다. 뉴질랜드 토끼 복 부 노출 통해 ~ 2000 cercariae 감염 되었습니다. 간 단계에서 schistosomes 토끼 간 및 mesenteric 혈관의 관류에 의해 감염 된 후 28 일에 미 나무 cercariae 감염에서 수집 했다. 웜 컬렉션의 절차 이전 간행물 쥐18연구 보고에서 참조 되어 있다.

  1. 500 mL 비 커에 기생충을 수집 합니다. 그들을 철저 하 게 세척 하 고 200 mL와 함께 부드럽게 3 x preheated (37 ° C) PBS (pH 7.4).
  2. 각 90 mm 페 트리 접시 ~ 200 벌레 쌍을 구분 합니다. 다음 기생충을 철저 하 게 세척 하 고 50 mL와 함께 부드럽게 2 x preheated (37 ° C) 페니실린과 스의 100 mg/mL의 U 100을 포함 된 RPMI-1640 문화 매체.
  3. 37 ° C 미만 5% CO2 ~ 5 웜 쌍 /mL 90 mm 페 트리 h 2의 조밀도에 접시에 항생제 없이 데워 RPMI 1640 문화 매체의 40 mL에 기생충을 유지 합니다.
    노트: RPMI 1640 매체 혈 청을 포함 해서는 안, 그렇지 않으면 exogenous extracellular 소포를 소개 합니다.

2. 사전 처리 상태 미디어

  1. 문화 매체를 수집 하 고 계란을 제거 하 고 웜 tegmental 파편 30 분 2000 × g에서 4 ° C에서 매체를 원심.
  2. 신선한 튜브는 상쾌한 전송 하 고 0.22 μ m 주사기 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다.
  3. Dialyzed 가방에 필터링된 솔루션을 수집 (분자량 컷오프: 3.5kD)와 다음 하룻밤 4 ° C에서 8 %PEG8000 솔루션을 사용 하 여 솔루션을 dialyze.
    노트: 이 단계는 SjEVs 절연의 수율을 높이기 위한 SjEVs을 풍부 하 게 하는 것이 중요.

3입니다. SjEVs의 격리

  1. 새로운 튜브에 dialyzed 솔루션을 전송 하 고 총 exosome 격리 시 약의 0.5 볼륨을 추가 합니다.
  2. 솔루션 vortexing 또는 솔루션의 동질성을 되도록 아래로 pipetting으로 잘 섞는다.
  3. 2 ° C ~ 8 ° C에 혼합물을 밤새 품 어.
  4. 2 ° C 8 ° c에서 1 시간을 위한 15000 × g에서 혼합물을 원심
  5. 발음 하 고는 상쾌한 삭제.
    노트: EVs (대부분의 경우에는 표시 되지 않음) 튜브의 하단에 펠 릿에 포함 됩니다.
  6. 2 ml PBS의 EVs 펠 릿을 resuspend 하 고 추가 분석까지-80 ° C에서 EVs 솔루션을 저장 합니다.

4입니다. 서 부 Blotting에 의해 EVs의 특성

  1. SjEVs 샘플, 예, BCA 분석 결과 의해의 단백질 농도 결정 합니다.
  2. 22.5 µ L RIPA 버퍼에 EVs의 10-20 µ g을 준비 합니다. 그런 다음 버퍼와 95 ° c.에 5 분에 대 한 열 로드 x 4의 7.5 µ L을 추가
  3. 12 %SDS 페이지 젤에 의해 별도 SjEVs 단백질.
  4. PVDF 막에는 단백질을 전송 하 고 안티-CD63 항 체 (1:1, 000 희석), 뒤에 안티-토끼 IgG-HRP (1:5, 000 희석)와 프로브와 프로브.
  5. 막 개발을 위한 ECL 검출 시 약을 사용 하 고 화학 이미징 시스템에 의해 신호를 감지.

5. 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 EVs의 특성

  1. 200 메쉬 formvar 코팅 격자를 고립 된 SjEVs의 2 µ L을 추가 하 고 실 온에서 건조를 허용.
  2. 1 분에 대 한 Phosphotungstic 산 2 %stain 고 실 온에서 건조.
  3. 전송 전자 현미경 샘플 홀더에 격자를 로드 하 고 이미지 캡처에 대 한 80 kV 전자 빔에 노출.

6. SjEVs 레이블 PKH67와 셀 이해 분석 결과

노트: 달리 명시 하지 않는 한 모든 후속 단계 온도 (20-25 ° C)에서 수행 했다.

  1. 원뿔 바닥 폴 리 프로필 렌 튜브에 5 µ g SjEVs 솔루션을 전송 및 RPMI 1640 매체를 추가 하 여 12 mL을 볼륨을 조정.
  2. SjEVs 펠 렛을 4 ° C에서 90 분 동안 110000 × g에서 SjEVs 원심
  3. 원심, 후 신중 하 게는 상쾌한 발음.
    참고: PKH67 ethanolic 염료 이기종 얼룩 및 감소 된 세포 생존 능력에 발생할 것이 SjEV 펠 릿에 직접 추가할 수 없습니다.
  4. SjEV 펠 릿;에 희석제 C의 1 mL을 추가 하 여 2 x EV 정지 솔루션 준비 완전 한 분산 되도록 부드러운 pipetting으로 resuspend.
  5. 희석제 C, 얼룩이 지기 전에 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브에서 희석제 C의 1 mL를 PKH67 ethanolic 염료 해결책의 2 µ L을 추가 하 고 분산을 잘 혼합 하 여 신선한 2x 염료 솔루션을 준비 합니다.
  6. 빠르게 EV 정지 (단계 6.4) 즉시 염료 솔루션 (단계 6.5) x 2의 1 mL를 혼합 샘플 pipetting 2 x의 1 mL를 추가 합니다.
  7. 4 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.
  8. FBS의 4 mL를 추가 하 여 얼룩을 중지 하 고 1 분 동안 품 어.
  9. 12 mL을 볼륨을 조정 하 고 다음 90 분 동안 4 ° C에서 110000 × g에서 원심을 RPMI1640 매체를 추가 합니다.
  10. 제거는 상쾌한 고 RPMI1640 매체 SjEV 펠 릿을 표시 하는 PKH67 resuspend를 추가 합니다.
  11. 한번 세척 한 후 PBS resuspend SjEVs 펠 릿을 추가 90 분 동안 4 ° C에서 110000 × g에서 원심.

7. SjEVs 셀 이해 분석 결과

  1. NCTC 같은 종자 포유류 세포 1469 셀 또는 HEK293T 셀 6 잘 플레이트 (잘 당 2 × 105 셀)에 복제 하 고 하룻밤 셀 문화.
  2. 5 µ g PKH67 표시 SjEVs를 추가 하 고 2-4 h 37 ° C에서 세포 문화.
  3. 후에 부 화, 매체를 제거 하 고 PBS 가진 셀을 두 번 세척.
  4. 15 분 동안 4% 포름알데히드 솔루션 셀을 수정 하 고 PBS를 가진 더 두 번 세척.
  5. 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 세포 핵 얼룩.
  6. 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀을 관찰 합니다.

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결과

설명 된 프로토콜을 사용 하 여 격리 된 SjEVs의 수익률을 계량, 우리는 28 일 성인 schistosomes에서 고립 된 SjEVs의 단백질 농도 액세스할 수 BCA 단백질 분석 결과 사용. 표 1에서 같이, SjEV 단백질 농도의 매체 (표 1) 100 mL 당 250 µ g을 208 µ g에서 배열 했다. 입자 크기 Malvern 나노 분석에 의해 결정 된 대로 표시 된 격리 SjEVs 100에서 240 400 nm nm, 높은 인구 약 220 nm의 크기 (그림 1). 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 SjEVs의 더 특성 직경 (그림 2)에 약 100-200 nm의 둥근 소포를 되도록 EVs를 공개 했다. 분석을 더럽혀 서는 고립된 SjEVs 인식 되었다 CD63 항 체를 사용 하 여 일반적인...

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토론

EVs에 대 한 최근 연구는 schistosome EVs 호스트 병원 체 상호 작용3,9,,1216에 중요 한 역할을 설명 했다. 추가 주소에 그들의 규정 하는 기능 필수적 이다 schistosomes에서 EVs를 분리. 여기, 우리 SjEV 절연을 위한 다른 방법을 설명합니다. 이 메서드 생성, SjEVs의 넓은 범위 크기 100에서 400 nm nm, 성인 미 나무에. 다음 셀 이해 분석 결과 EVs 설명된 프로토콜에서 고립 된 받는 사람 세포에 의해 성공적으로 내 면 그들의 관련 된 miRNAs 잠재적으로 규제 역할17재생 표시.

EVs, 셀의 많은 다른 종류에 의해 분 비 될 수 있습니다...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구는, 일부 또는 전체, 국가 자연 과학 재단의 중국 (31472187 및 31672550) 및 농업 과학, 농업 과학의 중국 아카데미의 기술 혁신 프로그램 지원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Material
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)ThermoFisher SCIENTIFIC4478359For isolatating S. japonicum extracellular vesicles
PKH67Sigma-aldrichMINI67For labeling Evs
RPMI 1640 MediumThermoFisher SCIENTIFIC11875119For parasite culture
페니실린-스트렙토마이신ThermoFisher SCIENTIFIC15140122
0.22μ m 주사기 필터MerckSLGP033RB
SnakeSkin 투석 튜빙Thermo SCIENTIFIC68035
PEG8000Sangon BiotechA100159 
RIPABeyotimeP0013B
EMD 밀리포어&트레이드; 이모빌론&트레이드; 서부 화학발광 HRP 기판(ECL)Fisher 과학WBKLS0100 
DAPI세포 신호 전달 기술4083
BCA 키트BeyotimeP0010
CD63 항체Sangon BiotechD160973-0025
PVDFBio-Rad1704273
Formvar/Carbon 400 meshTed Pella01754-F
포스포텅스텐 산Ted Pella19402
안티-마우스 IgG-HRPCWBIOCW0102
NCTC 클론 1469 세포ATCCATCC® CCL-9.1&무역;
FBSHyCloneSV30087.02
Equipments
GE 화학발광 이미징 시스템GEImageQuant LAS4000mini
투과 전자 현미경HitachiH-7600
Milli-Q 물Milli-QMilli-Q Elix
Eppendor 원심분리기 EppendorfCentrifuge 5804R
Zetasizer NanoMalvernZetasizer Nano ZS 
초원심분리기BeckmanOptima L-100 XP 초원심분리기
인큐베이터ESCOCCL-107B
현미경ZeissZeiss Axin Observer Z1

참고문헌

  1. Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
  2. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  3. Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175(2017).
  4. Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  6. Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
  7. Marcilla, A., et al. Extracellular vesicles in parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 3, 25040(2014).
  8. Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
  9. Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488(2014).
  10. Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
  11. Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665(2015).
  12. Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
  13. Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
  14. Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
  15. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319(2015).
  16. Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574(2016).
  17. Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885(2016).
  18. Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 11(2001).
  19. Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).

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EVCD63PKH67

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