방법 논문

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

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⸱

DOI:

10.3791/57518

⸱

2018년 4월 30일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Michigan

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

초록

클러스터 된 정기적으로 산재 된 구조 반복 (CRISPR)-CRISPR-관련 단백질 9 (Cas9) 간결한 적응 면역 방어 시스템을 공동 정확한 진 핵 게놈 엔지니어링에 대 한 강력한 도구로 선택한 되었습니다. 여기, 선물이 C. 선 충의 게놈 포인트 돌연변이 들의 효율적이 고 정확한 세대에 대 한 공상 단일 가이드 RNAs (sgRNA)와 CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs)를 사용 하 여 신속 하 고 간단한 방법. 우리는 sgRNA 대상 선택, 호몰로지 감독 수리 (HDR) 템플릿 디자인, CRISPR-Cas9-RNP complexing 및 배달 및 올바르게 편집된 동물의 강력 하 고 급속 한 식별 수 있도록 유전형 전략 파이프라인을 설명 합니다. 우리의 접근 허용 손쉬운 생성 및 원하는 게놈 포인트의 돌연변이 동물, 뿐만 아니라 또한 높은 효율성 및 감소 된 심사 작업 약 4-5 일에 다른 복잡 한 indel 대립 유전자의 탐지를 용이 하 게 한다.

서론

최근의 기술 진보 근본적으로 변형 하 고 정확 하 게 엔지니어 유전자 수를 가속. 특히, RNA 기반 endonuclease 관심의 대상 시퀀스 근처 두 배 물가 틈 (DSB)를 유도 하는 Cas9에 의존 하는, CRISPR-Cas9 시스템을 광범위 하 게 사용 되었습니다 정확 하 게 대부분에 사용 되는 모델 생물의 게놈 엔지니어링 생물 의학 연구1,2,,34. 크게, CRISPR-Cas9를 사용 하 여 게놈 C. 선 충5같은 어려운 종에도 편집 잠금을 해제 했다. 종에 세 가지 핵심 구성 요소에 의존 편집 시스템 CRISPR-Cas9 기반으로 게놈으로 포인트 돌연변이 생성: 1) Cas9 endonuclease, 대상 시퀀스와 설계 3)는 사용자에 게 Cas9 endonuclease 지휘 2)는 하나의 가이드 RNA (sgRNA) 관심2의 원하는 개의 편집 항목을 포함 하는 homology 감독 수리 (HDR) 템플릿.

대상 sgRNA 및 Cas9를 소개 하는 데 사용할 수 있는 여러 방법이 있다 nuclease 플라스 미드, RNA, 그리고 바이러스 성 기반 배달 방법6을 포함 하 여 셀에. 최근, 사전 complexed sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs)의 직접 배달 CRISPR-Cas9-기반 게놈7편집에 강력 하 고 효율적인 도구로 떠오르고 있다. 사전 complexed CRISPR Cas9 RNPs의 직접 배달 여러 가지 이점이 있다, 즉: RNPs 1) 세포 녹음 방송에 대 한 필요를 무시 하 고 번역, 2) RNPs는 급속 하 게 삭제는 사용할 수 있는 시간을 줄임으로써 특이성을 증가 시킬 수 있습니다 오프-대상 분열, 그리고 3) circumvents 아닌 임의의 통합을 통해 호스트 게놈 시퀀스의 소개는 아무 외국 DNA/RNA 요소를 포함 하는 RNPs. 함께, 이러한 특성 가능성이 대상에 CRISPR에서 대상 효과 최소화 하면서 편집의 짧은 버스트를 제공 합니다.

C. 선 충에서 사이트별 게놈 변화를 도입에 대 한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 sgRNA 및 단일 좌초 oligonucleotide (ssODN) HDR 서식 파일 디자인, sgRNA-Cas9 RNP complexing 및 납품, 및 제대로 편집된 동물의 명확한 식별을 위해 유전형 전략 대상으로 포함 되어 있습니다. 이 전략을 사용 하 여, 원하는 사이트 변경 내용을 복구할 수 있습니다, 뿐만 아니라 다른 일반적인 indel 돌연변이 복구할 수 있습니다. 따라서, 모노-유전자, bi-유전자, 어디 하나의 전략을 사용 하 여 유전자 시리즈의 생성을 허용 하는 우리의 전략 그리고 indel 돌연변이 F1 세대에서 생성 될 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 보호 및 실험 절차에서 건강의 국가 학회 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 미시간 대학에서는 가이드라인에 따 랐 다. RNase 무료 솔루션을 사용 하 고 플라스틱 프로토콜에 걸쳐 팁. RNase 오염 제거 솔루션 ( 자료 표참조) 제조업체 지침에 따라 작업 영역, 펫, 튜브, 그리고 원심 분리기를 청소.

1입니다. sgRNA 대상 선택

  1. 웹 페이지를 열고 웹 브라우저를 사용 하 여: http://crispor.tefor.net8
    1. ~ 60의 기본적인 쌍 (bp) 측면에 서는 관심의 원하는 편집 시퀀스의 입력 (즉 30 bp 5'과 3' 원하는 편집의).
    2. 꼬마 선 충 게놈 풀 다운 메뉴에서 선택 합니다.
    3. Protospacer 인접 한 모티브를 선택 (HF1-20 bp-NGG-SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) 풀 다운 메뉴에서.
    4. 전송을 클릭 합니다. 결과 페이지에서 최고 순위 대상 시퀀스의 편집에 가까운 선택 합니다. 측면에 서 60 bp 입력된 시퀀스 내의 아무 적당 한 대상 사이트 경우 확장 쿼리 시퀀스 100 bp (즉 50 bp는 원하는의 양쪽 편집).
  2. 예: synthego, 사용 가능한 소스에서 얻을 다음 사양 20-메 르 대상 sgRNA: 3 nmol; 아니 수정입니다.
  3. 접수 한 후, 원심에서 튜브를 포함 하는 동결 건조 된 sgRNA > 실 온에서 1 분 동안 12000 x g. 튜브, nuclease 무료 테의 60 µ L을 추가 하 고 부드럽게 다시 15-20 회 P200 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 일시 중단. 최종 농도 50 μ M 이다입니다.

2. 상 동 감독 복구 템플릿 디자인

  1. SsODN HDR 템플릿을 포함 하는 디자인: 1)의 돌연변이, 2)는 독특한 프레임에서 금지 endonuclease 사이트, 3) NGG 팸 시퀀스 내의 Gs 중 하나 또는 모두의 침묵 돌연변이 4) 50 bp 5'과 3' homology 팔 성과 돌연변이 측면. (그림 1C) 9 , 10.
    1. NGG 팸 시퀀스의 돌연변이 가능 하지 않으면 sgRNA이 중재 ssODN HDR 서식 파일의 분열을 방지 하기 위해 sgRNA 대상 인식 시퀀스 내에서 5-6 침묵 돌연변이 소개 합니다.
  2. 사용 가능한 소스, 예를 들면 idtdna에서에서 다음 매개 변수는 "Ultramer DNA oligonucleotide" 얻을: 규모: 4 nmol; 배합: 없음; 정화: 표준 담입니다.
  3. 접수 한 후, 원심에서 튜브를 포함 하는 동결 건조 된 ssODN > 실 온에서 1 분 동안 12000 x g. 부드럽게 다시 일시 중단 100 µ M의 최종 농도에 ssODN nuclease 무료 ddH2O에서에서 15-20 회 P200 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로.

3. 디자인 유전형 뇌관

  1. 400 ~ 700 bp의 PCR amplicon11생성 하 게놈 수정 측면을 설정 하는 뇌관 디자인.
  2. 단일 및 특정 amplicon11생산 PCR 순환 상태를 최적화 합니다.

4. 주입 혼합 준비

  1. 표 1 시 약 4 ° c.에서 2 분 최대 속도로 원심
  2. 순서 대로, nuclease 무료 PCR 튜브에 표 1 시 약을 추가 합니다.
  3. 부드럽게 pipetting 아래로 10 번 P20 피 펫과에 의해 철저 하 게 혼합.
  4. 실 온에서 10 분 동안 주입 혼합 품 어.

5. 주입 프로토콜

  1. 사출 micropipette 주입 혼합12의 약 절반으로 로드 합니다. 주사 바늘 나 막 신 또는 나누기 경우 주입 혼합 나머지 저장 합니다.
  2. 있도록 ~ 20-30 p.s.i.는 점진적 흐르는 솔루션12micropipette 팁을 휴식.
    참고: 큰 직경 팁 부정적인 동물의 건강에 영향을 미칠 및 F1 자손 수확량 감소.
  3. 10-15 영 주사 성인 gonadal 양팔의 벌레 가능한 경우12. 그렇지 않으면, 주입 한 gonadal 팔으로 충분 하다.
  4. OP50-시드 35 m m 선 충 성장 미디어 (NGM) 접시에 주입 된 동물 (P0) 실 온에서 1-2 h에 대 한 복구를 허용 합니다. 그 후, 개별 OP50 시드 35 m m NGM 판 백 금 철사 벌레를 사용 하 여 단일 주입된 P0 동물12를 선택 합니다.

6. 스크린 P0 격판덮개 및 단일 mCherry(+) F1s

  1. 2 일 후 주입, P0 판 F1 자손 표현 mCherry 형광 stereomicroscope를 사용 하 여 인 두에 포함 된 식별 (그림 1D, 하루 2-3). 대부분의 mCherry(+) F1 동물을 포함 하는 3 개의 P0 플레이트를 선택 합니다.
  2. 3 선택한 P0 플레이트의 각 단일 24-36 mCherry(+) F1의벌레를 사용 하 여 총 8-12 mCherry(+) F1 동물 선택 (그림 1D, 하루 2-3).
    참고: mCherry(-) 동물 또한 이러한 P0 플레이트에서 안타 수 있습니다 하지만 올바르게 식별 확률 편집 동물 훨씬 낮은 (그림 2A).
  3. 개별 F1s self-fertilize 하 여 실 온에서 1-2 일에 대 한 알 수 있습니다.

7. 단일 벌레 PCR과 유전형

  1. 1-2 일 후 계란-누워, 개별 PCR 스트립 튜브 캡 포함 된 웜 선택 (표 2, 그림 1D, 하루 4-5)를 사용 하 여 웜 세포의 용 해 버퍼의 7 µ L로 F1s를 전송 합니다.
  2. 원심 분리기 튜브 하단에 동물을가지고 1 시간-80 ° C에서 튜브를 고정을 실 온에서 1 분 동안 최대 속도로 PCR 튜브.
    참고: 웜 저장할 수 있습니다-80 ° C에 무기한.
  3. Thermocycler 다음과 같은 프로그램을 사용 하 여 냉동된 벌레를 lyse: 60 ° C 60 분, 15 분 동안 95 ° C에 4 ° C를 개최.
  4. 설정 PCR mastermix 표 3에서 같이
  5. 깨끗 한 PCR 튜브에 PCR mastermix의 21 µ L을 추가 하 고 3 단계에서 웜 세포의 4 µ L를 추가 합니다. 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합 하 고 PCR 프로그램 제조 업체 지침 ( 자료 표참조)를 실행.
  6. 제조업체 지침에 따라 DNA 깨끗 하 고 집중 키트를 사용 하 여 PCR 반응 정화 ( 자료 표참조). 10 µ L 물 회전 열을 추가 하 여 DNA을 elute.
  7. 설정 제한 효소 mastermix 표 4와 같이
  8. 10 µ L의 제한 효소 mastermix 각 청소 PCR 반응에 추가 하 고 1-2 h 37 ° C13에서 품 어.
  9. 별도 소화 120 V 1 x 트리 스-아세테이트-EDTA (태) 버퍼14를 사용 하 여에서 실행 1.5 %agarose 젤에 PCR 제품.

8. 신분증 및 편집 된 동물의 시퀀스 확인

  1. 잠재적인 편집 동물14 (그림 1D, 하루 4-5)을 표시 하는 밴드의 존재에 대 한 소화 효소 샘플을 검사 합니다.
    참고: 밴드 크기 또는 예기치 않은 하 고 복잡 한 금지 효소 소화 패턴 밴딩 교대로 관찰 될 수 있는 잠재적인 indel 돌연변이 식별 하는 N2 컨트롤을 로드 합니다.
  2. 확인 후 잠재적인 편집된 동물, 웜 세포의 나머지 3 µ L를 사용 하 고 PCR 반응을 반복 합니다. 청소 하지 않는 또는 금지 효소 소화 PCR 반응 완료 되 면 프로그램. 별도 1 %agarose 젤에 PCR 반응을 로드 하 고 젤 추출 키트15 를 사용 하 여 밴드를 추출 ( 자료 표참조).
  3. 생어 시퀀스16 젤 올바르게 편집된 동물 (그림 1A)를 식별 하는 F1 뇌관을 사용 하 여 DNA를 추출
    참고: Heterozygote 읽기 포함 됩니다 야생 타입의 존재로 인해 봉우리 중첩 그리고 대립 유전자를 설계.
  4. Homozygous 동물에서에서 얻이 검증된 heterozygous 편집된 동물, 단일 8-12 F2 동물 7-8 단계를 수행 하려면.

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결과

인간의 superoxide dismutase 1에에서 돌연변이 (SOD1) 가족 루 경화 증, 마비와 죽음17변함없이 이끌어 치명적인 신경 질환의 10 ~ 20% 위한 계정. 인간의 떼-1 (그림 1B) C. 선 충 떼-1 단백질으로 55% 정체성과 70% 유사성을 공유 하는 진화론 보존된 단백질 이다. 단순, 타당성, 및 CRISPR Cas9 RNP-기반 접근의 효율성을 입증, 우리는 질병 관련 인간의 G93A 변종 웜 게놈 (그림 1A)에서 소개 하는 C. 선 충 떼-1 유전자 대상.

C. 선 충 게놈에 G93A 돌연변이를, sgRNA는 그 팸 인식...

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토론

CRISPR-Cas9 시스템 모델 생물의 게놈을 정확 하 게 수정에 대 한 강력 하 고 효과적인 도구입니다. 여기, 우리는 그 공상 sgRNAs20 ssODN HDR 템플릿 사용 C. 선 충게놈 점 돌연변이의 고효율 세대 결합 보여 줍니다. 중요 한 것은, 시연 RNP 배달에 편집 고효율 생산 형광 공동 선택 마커로 사용할 때 편리 함과 기술의 안정성을 강조 합니다.

C. 선 충 게놈 엔지니어링에 대 한 CRISPR Cas9 메서드의 대부분 특정 유전 배경 또는 공동-CRISPR 전략1에 의존합니다. Co CRISPR 메서드는 성공적인 게놈 편집의 가능성을 증가 하는 유용한 도구가 될 입증 되었습니다. 그러나, 공동-CRISPR 방법을 소개 하는 관심의 게놈 편집에 대 한 풍요롭게 마커 로커 스에 표현 형을 선택할 수 있는 편집 해야 합니다. 강력 하 고, 하는 ...

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공개 사항

우리는이 논문의 중요 한 독서에 대 한 애 원 실험실의 구성원 감사. 종자는 꼬마 유전학 센터, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 애 원 실험실에 있는 연구는 교부 금에 의해에서 지원 NIH (R01 NS094678)와 근 위축 증 협회 (MDA382300) A.A.B.

감사의 글

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CRISPRevolution sgRNA  EZ 키트Synthego Inc.키메라 sgRNA
뉴클레아제 프리 TESynthego Inc.sgRNA 키트와 함께 제공, EZ 키트
, 뉴클레아제가 없는 물, Synthego, Inc.sgRNA 키트와 함께 제공되는 EZ 키트
4 nmole Ultramer DNA Oligo통합 DNA 기술ssODN HDR 템플릿
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS통합 DNA 기술1078728Cas9 단백질
pCFJ90 Addgene19327Pmyo-2 :: mCherry 마커 플라스미드
KCl시그마P5405
HEPES시그마H4034
DNA 클린 & 농축기Zymo ResearchD4004
Zymoclean 젤 DNA 회수 키트Zymo ResearchD4002
Q5 핫 스타트 고충실도 2X 마스터 믹스New England BiolabsM0494L
Proteinase KSigmaP2308
유리 붕규산 유리 마이크로피펫Sutter InstrumentsBF100-78-10OD: 1.0mm. ID: 0.78mm
Trizma HydrochlorideSigmaT5941
MgCl2SigmaM2393
NP-40Sigma74385
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
RNaseZap 오염 제거 솔루션Fisher ScientificAM9780

참고문헌

  1. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  3. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
  5. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
  6. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
  7. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
  8. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  9. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
  10. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
  11. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
  15. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
  16. Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
  17. Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
  18. Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  19. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  21. Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
  22. Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
  23. Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
  24. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).

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C eleganssgRNAssODN HDRmCherry

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