빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

요약

여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

초록

클러스터 된 정기적으로 산재 된 구조 반복 (CRISPR)-CRISPR-관련 단백질 9 (Cas9) 간결한 적응 면역 방어 시스템을 공동 정확한 진 핵 게놈 엔지니어링에 대 한 강력한 도구로 선택한 되었습니다. 여기, 선물이 C. 선 충의 게놈 포인트 돌연변이 들의 효율적이 고 정확한 세대에 대 한 공상 단일 가이드 RNAs (sgRNA)와 CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs)를 사용 하 여 신속 하 고 간단한 방법. 우리는 sgRNA 대상 선택, 호몰로지 감독 수리 (HDR) 템플릿 디자인, CRISPR-Cas9-RNP complexing 및 배달 및 올바르게 편집된 동물의 강력 하 고 급속 한 식별 수 있도록 유전형 전략 파이프라인을 설명 합니다. 우리의 접근 허용 손쉬운 생성 및 원하는 게놈 포인트의 돌연변이 동물, 뿐만 아니라 또한 높은 효율성 및 감소 된 심사 작업 약 4-5 일에 다른 복잡 한 indel 대립 유전자의 탐지를 용이 하 게 한다.

서론

최근의 기술 진보 근본적으로 변형 하 고 정확 하 게 엔지니어 유전자 수를 가속. 특히, RNA 기반 endonuclease 관심의 대상 시퀀스 근처 두 배 물가 틈 (DSB)를 유도 하는 Cas9에 의존 하는, CRISPR-Cas9 시스템을 광범위 하 게 사용 되었습니다 정확 하 게 대부분에 사용 되는 모델 생물의 게놈 엔지니어링 생물 의학 연구^1,2,,34. 크게, CRISPR-Cas9를 사용 하 여 게놈 C. 선 충⁵같은 어려운 종에도 편집 잠금을 해제 했다. 종에 세 가지 핵심 구성 요소에 의존 편집 시스템 CRISPR-Cas9 기반으로 게놈으로 포인트 돌연변이 생성: 1) Cas9 endonuclease, 대상 시퀀스와 설계 3)는 사용자에 게 Cas9 endonuclease 지휘 2)는 하나의 가이드 RNA (sgRNA) 관심²의 원하는 개의 편집 항목을 포함 하는 homology 감독 수리 (HDR) 템플릿.

프로토콜

모든 동물 보호 및 실험 절차에서 건강의 국가 학회 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 미시간 대학에서는 가이드라인에 따 랐 다. RNase 무료 솔루션을 사용 하 고 플라스틱 프로토콜에 걸쳐 팁. RNase 오염 제거 솔루션 ( 자료 표참조) 제조업체 지침에 따라 작업 영역, 펫, 튜브, 그리고 원심 분리기를 청소.

1입니다. sgRNA 대상 선택

1. 웹 페이지를 열고 웹 브라우저를 사용 하 여: http://crispor.tefor.net⁸
   1. ~ 60의 기본적인 쌍 (bp) 측면에 서는 관심의 원하는 편집 시퀀스의 입력 (즉 30 bp 5'과 3' 원하는 편집의).
   2. 꼬마 선 충 게놈 풀 다운 메뉴에서 선택 합니다.
   3. Protospacer 인접 한 모티브를 선택 (HF1-20 bp-NGG-SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) 풀 다운 메뉴에서.
   4. 전송을 클릭 합니다. 결과 페이지에서 최고 순위 대상 시퀀스의 편집에 가까운 선택 합니다. 측면에 서 60 bp 입력된 시퀀스 내의 아무 적당 한 대상 사이트 경우 확장 쿼리 시퀀스 1....

결과

인간의 superoxide dismutase 1에에서 돌연변이 (SOD1) 가족 루 경화 증, 마비와 죽음¹⁷변함없이 이끌어 치명적인 신경 질환의 10 ~ 20% 위한 계정. 인간의 떼-1 (그림 1B) C. 선 충 떼-1 단백질으로 55% 정체성과 70% 유사성을 공유 하는 진화론 보존된 단백질 이다. 단순, 타당성, 및 CRISPR Cas9 RNP-기반 접근의 효율성을 입증, 우리는 질병 관련 인간의 G93A 변종 웜 게놈 (그림 1A)에서 소개 하는 C. 선 충 떼-1 유전자 대상.

C. 선 충 게놈에 G93A 돌연변이를, sgRNA는 그 팸 인식.......

토론

CRISPR-Cas9 시스템 모델 생물의 게놈을 정확 하 게 수정에 대 한 강력 하 고 효과적인 도구입니다. 여기, 우리는 그 공상 sgRNAs²⁰ ssODN HDR 템플릿 사용 C. 선 충게놈 점 돌연변이의 고효율 세대 결합 보여 줍니다. 중요 한 것은, 시연 RNP 배달에 편집 고효율 생산 형광 공동 선택 마커로 사용할 때 편리 함과 기술의 안정성을 강조 합니다.

C. 선 충 게놈 엔지니어링에 대 한 CRISPR Cas9 메서드의 대부분 특정 유전 배경 또는 공동-CRISPR 전략¹에 의존합니다. Co CRISPR 메서드는 성공적인 게놈 편집의 가능성을 증가 하는 유용한 도구가 될 입증 되었습니다. 그러나, 공동-CRISPR 방법을 소개 하는 관심의 게놈 편집에 대 한 풍요롭게 마커 로커 스에 표현 형을 선택할 수 있는 편집 해야 합니다. 강력 하 고, 하는 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CRISPRevolution sgRNA  EZ 키트	Synthego Inc.		키메라 sgRNA
뉴클레아제 프리 TE	Synthego Inc.	sgRNA 키트와 함께 제공, EZ 키트
, 뉴클레아제가 없는 물	, Synthego, Inc.	sgRNA 키트와 함께 제공되는 EZ 키트
4 nmole Ultramer DNA Oligo	통합 DNA 기술		ssODN HDR 템플릿
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS	통합 DNA 기술	1078728	Cas9 단백질
pCFJ90	Addgene	19327	Pmyo-2 :: mCherry 마커 플라스미드
KCl	시그마	P5405
HEPES	시그마	H4034
DNA 클린 & 농축기	Zymo Research	D4004
Zymoclean 젤 DNA 회수 키트	Zymo Research	D4002
Q5 핫 스타트 고충실도 2X 마스터 믹스	New England Biolabs	M0494L
Proteinase K	Sigma	P2308
유리 붕규산 유리 마이크로피펫	Sutter Instruments	BF100-78-10	OD: 1.0mm. ID: 0.78mm
Trizma Hydrochloride	Sigma	T5941
MgCl2	Sigma	M2393
NP-40	Sigma	74385
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
RNaseZap 오염 제거 솔루션	Fisher Scientific	AM9780