번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

요약

Toeprinting 목표 체 외에서 의 능력을 측정 하는 다양 한 조건에서 리보솜과 양식 번역 개시 복합물에 RNA를 복사할 수 있습니다. 이 프로토콜 toeprinting 포유류 RNA에 대 한 메서드를 설명 하 고 모자-종속 및 IRES 기반 번역 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

번역 개시 단백질 합성의 속도 제한 단계 이며, 세포 단백질 출력을 조절 하는 핵심을 나타냅니다. 단백질 합성의 세포질 긴장 응답, 열쇠 이며 dysregulation 암 등 많은 질병 상태에 중앙 이다. 예를 들어, 세포 스트레스 글로벌 번역의 억제를 약하게 모자 종속 개시 리드, 비록 특정 스트레스 응답 단백질에 모자 독립적인 방식으로 선택적으로 변환 됩니다. 신중한 RNA 규제 등의 요소, 세포 내부 리보솜 입장 위치 (IRESes),이 특정 한 mRNAs의 번역에 대 한 수 있습니다. 이러한 mRNAs의 식별 및 그들의 규제 메커니즘의 특성 분자 생물학에는 핵심 영역 되었습니다. Toeprinting 번역 개시에 관련 된 RNA 구조와 기능 연구에 대 한 방법입니다. Toeprinting의 목표는 생체 외에서 의 능력을 평가 하는 시퀀스, 구조 요소 또는 액세서리 요인 리보솜에 참여를 결정 하기 위해 다양 한 조건에서 리보솜과 안정 되어 있는 복합물을 형성 하는 RNA 베 껴 바인딩-효율적인 번역 개시에 대 한 사전 커서. 서쪽 분석 및 polysome 프로 파일링와 같은 다른 기술 함께 toeprinting 번역 개시의 규칙에 대 한 메커니즘의 강력한 특성에 대 한 수 있습니다.

서론

으로 번역 가장 세포 에너지 소비, 그것은 말 번역은 단단히 규제¹. 반대로, 번역의 dysregulation-그리고 단백질 출력에 따른 변경-암^1,2등, 스트레스 반응과 질병의 상태에서 자주 관찰 됩니다. 변환 제어의 주요 장점은 속도는 셀 다양 한 자극³에 대응 하기 위해 그들의 단백질 출력 변경할 수입니다. 번역 규정 따라서 세포 생존과 죽음^1,2,3에 영향을 미칠 수 있는 중요 한 메커니즘을 나타냅니다. 번역의 단계의 개시는 대부분 높은 규제 하 고 복잡 한³입니다. 짧게, 가장 진 핵 mRNAs 포함 5' m⁷G 모자는 거의 항상 그들의 번역에 대 한 필수. 모자-종속 개시 진 핵 개시 요인 eIF4E, eIF4A, 및 eIF4G 필요 (모자 인식 복합)는 mRNA의 5' 끝에 상호 작용. 43S preinitiation 리보솜, eIF2 바인딩된 초기자를 포함 하는 mRNA를 통해 eIF3와 eIF4G의 상호 작용의 5' 끝에 tRNA와 eIF3, 모집. 복잡 한 괴롭힘 스캔 mRNA, eIF4A에 의해도 왔 생각 된다 (RNA helicase) 시작 codon (8 월)는 때까지. 복잡 한 48S 개시 이후에 형성 그리고 tRNA는 리보솜의 P 사이트에 전달 됩니다. 마지막으로, 60와 40 리보솜 소 단위 번역 신장^1,,34다음 80 개시, 복잡 한 형태로 결합 된다. 반면, 내부 리보솜 입장 위치 (IRESes) 개시 코 돈³에 직접 40 ribosomal 소 단위를 모집 하 여 5' 모자에 대 한 요구 사항을 무시할. 생리 적 스트레스 상태 감소 글로벌 mRNA 번역 키 일반 진 핵 개시 요인 (eIFs)의 수정으로 인. 그러나, 종종 스트레스 대응 단백질을 인코딩하는 특정 mRNAs의 선택적 번역 비 정식 번역 개시 메커니즘을 사용 하 고 비 정식 번역 개시의 dysregulation 암 같은 질병 상태에 연루 ^{1 , 2}. 세포 IRESes 등 신중 RNA 규제 요소 같은 mRNAs^2,3의 번역에 대 한 허용.

변환 제어의 1 개의 특히 재미 있는 양상은 특정된 mRNA의 비 정식 번역 대 정식의 메커니즘을 이해 하는 것입니다. Toeprinting 특정 RNAs 체 외의 번역 개시의 상세한 기계 연구를 허용 하는 기술입니다. Toeprinting의 전반적인 목표는 시퀀스, 구조 요소 또는 액세서리 결정 하기 위해 다양 한 조건에서 리보솜으로 복잡 한 번역 개시의 형성을 nucleate 관심의 RNA의 능력을 평가 하는 요소는 효율적인 번역 개시에 대 한 필요 합니다. 예를 들어, 리보솜 모집 5' 캡의 부재에 방해 수도 있습니다 하지만 한 IRES의 존재에 의해 자극.

체 외에서 하는 것입니다 기술의 원리 개시 단지 형태로, 그리고 반전 녹음 수 있도록 변환 컴포넌트 (또는 순화 된 구성 요소)을 포함 하는 세포 추출의 존재 그것을 품 어 관심, RNA 녹음 특정 뇌관는 RNA 안정적인 RNA 리보솜 단지 반전 녹음 방송에 리보솜의 소위 'toeprint'^5,,67의 3' 가장자리에 발생 합니다.

이 프로토콜, ribosomal 소 단위, eIFs, tRNAs, 및 IRES 트랜스-행동 요인 (ITAFs)는 편리 하 게 토끼 reticulocyte lysate (RRL)에 의해 기여. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 붙일 표시 된 뇌관 및 형광 젤 기반 영상, 보다는 오히려 방사선된 뇌관의 사용 이다. 이 등 radiolabeling 뇌관로 젤을 건조 강화 화면에 노출 하는 추가 단계를 제거 합니다. 형광 밴드는 큰 해상도 대 한 허용 젤 실행으로 실시간으로 기록 됩니다. 비록 출장된 mRNAs 또한이 기술을⁸에 의해 분석 될 수 있다 apoptosis 단백질 (XIAP) IRES RNA의 세척제 X 연결 억제제 여기, 예를 들어 사용 됩니다.

세포 lysates의 번역 과정의 최종 출력을 측정, 서쪽 분석, 달리 toeprinting은 번역 개시는 RNA에 복잡 한 대형을 측정 하기 위해 생체 외에서 접근 이다. 이 reductionist 접근 기판 또는 번역 개시 통제 요인의 매우 상세한 연구에 대 한 수 있습니다 (예., 출장 또는 취소 출장 mRNA, IRES 구조, 존재 또는 부재 특정 단백질 요인의, 폴 리 A 꼬리의 등)입니다. 따라서, toeprinting 번역⁸ 다른 모드 또는 mRNA, 같은 구조 IRESes, 단백질 합성^9,10의 효과 연구에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

참고: RNA는 ribonucleases (RNases)에 의해 저하에 매우 취약. RNA를 그대로 유지 하는 표준 예방 조치. 글러브를 자주 변경 합니다. 프로토콜의 모든 단계에서 필터링 된 피 펫 팁, nuclease 무료 plasticware 및 nuclease 없는 화학 물질을 사용 합니다. Nuclease 무료 사용 또는 diethyl pyrocarbonate (DEPC)-모든 솔루션에 대 한 물 처리.

1입니다. 솔루션의 준비

1. Toeprinting 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.6), 100 mM KOAc, 2.5 m m Mg(OAc)₂, 5% (w/v) 자당, 2 m m dithiothreitol (DTT), 그리고 0.5 m m spermidine.
   1. DTT와 spermidine 반복된 freeze-thaw 주기를 피하기 위해-20 ° C에서 단일 사용 aliquots에 저장.
      참고: DTT와 spermidine는 사용 하기 바로 전에 toeprinting 버퍼에 추가 되어야 합니다. DTT와 spermidine 솔루션-20 ° c.에 저장 될 수 있다
2. 85 m m 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP PNP)와 91 m m 아데노신 3 인산 염 (ATP)의 aliquots를 준비 합니다. -20 ° c.에 aliquots 저장
3. 450 mL 6 %polyacrylamide-7 M 요소 젤 믹스의 준비: 40 %acrylamide:bis 67.5 mL-아크릴 (19:1), 요소, TBE (트리 스/borate/thylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)), x 5의 112.5 mL 및 물 120 mL의 189 g. 37 ° C 물 목욕 또는 감동과 뜨거운 접시에 온난 하 여는 요소를 분해. 필터링 솔루션 (예., 0.2 μ m 니트로 진공 필터).
   참고: 솔루션 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 한 달 이상.
   주의: 아크릴 단위체는 피부를 통해 흡수 될 수 있는 neurotoxin입니다. 피부 접촉을 피하기 위해 상당한 주의 (즉., 장갑, 실험실 외 투를 착용 하 고 눈 보호). 으로 중 합을 100% 완료 진행 하지 않을 수 있습니다 polyacrylamide 또한 주의 처리 되어야 합니다.
4. Formamide 로드 염료 준비: 95 %formamide, 18 mM EDTA, 0.025% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 0.025% (w/v) bromophenol 블루, 0.025% (w/v) 자일 렌 cyanol. -20 ° c.에 게
5. 10 pmol/μ의 작업 집중에 대 한 물 100 μ로 1 nmol 뇌관 (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' 끝-IRDye 800으로 표시)의 분해. 빛에서 보호 하에 단일 사용 aliquots (약 10 µ L),-20 ° C에서 저장 합니다.

2입니다. mRNA의 준비

1. 적절 한 서식 파일에서 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 mRNA의 합성에 대 한 서식 파일 DNA 증폭 (즉., 게놈 DNA 또는 플라스 미드 DNA, 적절 한). 높은 충실도 제조업체의 지침에 따라 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 다음 반응 조건 (35 주기): 녹기, 98 ° C, 10 s; anneal, 53 ° C, 20 s; 확장, 72 ° C, 30 s.
   참고: 앞으로 뇌관 (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) 통합 RNA 녹음 방송; 있도록 T7 발기인 순서 반전 뇌관 (5' T₅₁GAATTCGGATCCGACCGTGG) 51 thymine 잔류물 베낀된 RNA에 대 한 폴 리 A 꼬리를 제공 하기 위해 포함 되어 있습니다. Note RNA에 생체 외에서 플라스 미드 DNA에서에서 복사할 수도 있습니다.
2. 체 외에 적절 한 전송 키트를 사용 하 여 IRES 포함 된 RNA 또는 DNA 템플렛에서 출장된 RNA를 고쳐 쓰다 제조업체의 지침을 따릅니다. 표준 20 μ 반응 볼륨에서 RNA 샘플을 준비 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 RNase 무료 DNase의 2 대와 새로 합성 RNA를 취급
3. 110 DNase 취급 RNA 희석 nuclease 무료 물 µ L 110 µ L 산 페 놀, 소용돌이 5 s와 3 분 동안 원심 분리기 실 온에서 20000 x g에 추가. 새로운 1.5 mL microfuge 관에 수성 단계의 100 µ L를 제거 3m 나트륨 아세테이트, 및 소용돌이 2 미 추가, 100% 에탄올, 소용돌이 5 s의 3 볼륨 10 µ L을 추가 하 고 하룻밤-20 ° C에서 RNA 침전.
4. 원심 > 삭제는 상쾌한 4 ° C에서 30 분 동안 20000 x g. 얼음 처럼 차가운 70% (v/v) 에탄올의 500 µ L와 펠 릿을 세척 하 고는 원심 분리를 반복. 많은 가능한 상쾌한으로 발음 하 고 5-10 분에는 펠 릿을 꺼내 려 하지 않도록 주의 대 한 펠 릿을 건조.
5. Nuclease 무료 물 0.5 μ g/μ의 작업 농도를 적절 한 볼륨에는 RNA를 resuspend. 이-80 ° C에 저장 하거나 즉시 사용 될 수 있습니다.

3. Toeprinting 반응

1. 토끼 1 μ (40 대) RNase 억제제, 1 µ L 91 mM ATP의 (최종 1.82 m m) 및 1.5 mL microfuge 관 85 mM GMP PNP (최종 1.7 m m)의 1 μ의 Reticulocyte Lysate (RRL, nuclease 치료 하지 않을)의 혼합 15 μ. 5 분 30 ° C에서 품 어.
   참고:는 RRL 반복적인 동결 해빙을 피하기 위해 단일 사용에 대 한 aliquoted 이어야 한다. 중요 한 제어 RRL, 반전 녹음 방송 RNA의 이차 구조 때문의 자연 일시 중지를 명료 하 게 하기 위해 부족 한 반응입니다. Toeprinting 버퍼 RRL이이 컨트롤에 대 한 대체를 추가 합니다.
2. RNA의 0.5 µ g (1 µ L)를 추가 하 고 5 분 30 ° C에서 품 어.
3. Toeprinting 버퍼의 22 µ L을 추가 하 고 3 분 동안 30 ° C에서 품 어.
4. IRDye 표시 된 뇌관의 0.5 µ L (5 pmol)를 추가 하 고 10 분 동안 얼음에 품 어.
5. 2 µ L 25 mM dNTPs의 추가 (최종 농도: 1 m m), 2 µ L 100 mM Mg(OAc)₂, 1 µ L의 조류 Myeloblastosis 바이러스 역전사 (AMV-RT)과 Toeprinting 버퍼의 3.5 µ L의. 마지막 볼륨은 50 μ.
6. 45 분 30 ° C에서 반응을 품 어.
7. Nuclease 무료 물 200 µ L을 추가 하 고 즉시 25:24:1 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (pH 약 8.0)의 250 µ L를 추출. 소용돌이 5 s 하 고 실 온에서 3 분 20000 x g에서 원심 분리기. 새로운 1.5 mL microfuge 관에 수성 단계 제거 100% 에탄올, 소용돌이 5 s의 3 볼륨을 추가 하 고 하룻밤-20 ° C에서 침전.
8. 원심 > 삭제는 상쾌한 4 ° C에서 30 분 동안 20000 x g. 얼음 처럼 차가운 70% (v/v) 에탄올의 500 µ L로 DNA 펠 릿을 세척. 원심 > 20000 x g 4 ° c.에서 15 분 Aspirate 가능한 및 5-10 분에 대 한 펠 릿은 펠 릿을 꺼내 려 하지 않도록 주의 해야 건조 공기 만큼 표면에 뜨는.
9. Nuclease 무료 물 6 μ에 펠 릿을 녹이 고 염료를 로드 하는 formamide의 3 μ를 추가.

4. 연속 반응

1. 2.1에서 DNA 템플렛 및 3.4 단계에서 IRDye 라는 뇌관을 사용 하 여 체인 출현으로 dideoxynucleotides (ddNTPs)를 사용 하 여 표준 연속 반응에 대 한. 적절 한 DNA 시퀀싱 장비를 사용 하 고 제조업체의 지침을 따르십시오.
2. Formamide 로드 하는 염료의 3 μ와 각 연속 반응의 믹스 6 μ

5입니다. 시퀀싱 하는 젤 전기 이동 법의 준비

참고:이 프로토콜 사용 하 여 형광 젤 기반 영상 고는 21 cm x 23cm x 0.2 m m 젤 하지만 필요한 경우 다른 시퀀서 또는 젤-크기, 적응 시킬 수 있다.

1. 0.2 m m 간격으로 짧은 (23 × 25 cm) 및 긴 100% 에탄올 (30 × 25 cm) 유리 접시를 철저 하 게 청소. 건조 공기.
2. 6 %polyacrylamide-7 M 우 레 아 젤의 믹스 30 mL 200 μ 10% (w/v) 암모늄 persulfate (AP)의 혼합 및 tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 μ. 젤, 거품을 피하기 위해 돌을 부 어 하 고 ' 상어 이빨 ' 젤 빗을 삽입 합니다. 실 온에서 1 h에 대 한 유해를 젤을 수 있습니다.
3. 시퀀싱 기구를 조립 하 고 1 저수지를 채울 x TBE.
4. 사전 실행 15 분 1500 V에서 55 ° C의 최적의 온도 달성 될 때까지.
5. 샘플/로드 염료 혼합 (3.9 또는 4.2 단계)에서 85 ° C 5 분 부하 1 μ 시퀀싱 젤에 대 한 열.
6. 1500 V 8 h에 젤을 실행 합니다. 기계는 실시간으로 밴드를 읽을 것 이다.
7. 분해 장치, 그리고 아크릴 아 미드 젤 실행 버퍼를 처분.

결과

우리는 이전 모자 독립적인 번역 개시 생체 외에서^8,10을 지원 하기 위해 XIAP IRES의 능력을 설명 했습니다. Toeprinting 복잡 한 XIAP IRES 개시의 기계적 세부가 핵심 기술 했다. 인코딩 XIAP IRES (그림 1A)를 포함 하는 mRNA는 DNA 구조에 생체 외에서 복사할 및 toeprinting 분석을 받게 했다. 여기 사용 IRES XIAP mRNA의 돌연변이 변종 그림 1B에 표시 됩니다. 반전 녹음 방송 XIAP mRNA 리보솜 복잡 한의 전형적인 toeprints + 17 + 19 나왔고 nt 하류 (

토론

Toeprinting 직접 고도로 제어 된 상황에서 번역 개시 복합물의 대형을 지원 하기 위해의 RNA의 능력을 측정 하는 강력한 기술입니다. Toeprinting에 대 한 단순화 된이 프로토콜 설명 포유류 RNAs. 토끼 reticulocyte lysate (RRL) 리보솜, eIFs, 초기자의 편리한 원본으로 사용 되, tRNA와 IRES 트랜스-행동 요인 (ITAFs). 실험 선택의 그들의 RNA를 제공 하 고 또한 그들의 선택의 특정 공동 인자와 toeprinting 반응을 보충할 수 있다. 예를 들어, 번역 개시 단지 대 80 48S toeprints⁷의 형광 농도의 분포에 따라 분화 될 수 있습니다. 관찰 개시 복잡 한 사용 하는 구 아닌 뉴클레오티드의 종류에 따라 달라 집니다. 여기 논의 XIAP IRES 경우 GMP PNP 플러스 ATP 안정화 48S 전 개시 복합물, toeprint 메일 + 17≥ + 18 특징 > + 19. GMP PN...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DEPC (디 에틸 피로 카보네이트)	시그마	D5758-100ML
트리스베이스, 초순수	JT 베이커	4109-01
KOAc (칼륨 아세테이트)	바이오 베이직	PB0438
mg (OAc) 2< / sub> (마그네슘 아세테이트 테트라 하이드레이트)	바이오 베이직	MB0326
자당, 분자 생물학 학년	Calbiochem	573113-1KG
스페르미딘	시그마	85558
GMP-PNP (구아노신 5 ′ -[β,γ -imido] 트리 포스페이트 트리 소듐 염 수화물) 0.1 M 용액	시그마	G0635
ATP (아데노신 5 &프라임; -트리 포스페이트) 디 소듐 염, 100 mM 용액	시그마	A6559
19 : 1 아크릴 아미드 : 비스- 아크릴 아미드, 40 %	바이오 베이직	A0006
Urea	Bio Basic	UB0148
500mL 병 상단 여과 장치, 0.2 µ m	Sarstedt	83.1823.101
포름 아미드	시그마	F9037-100ML
EDTA (디 소듐 염, 이수화 물)	바이오 베이직	EB0185
SDS	바이오 베이직	SB0485
브로모 페놀 블루	바이오 베이직	BDB0001
자일렌 시아놀 FF	바이오 베이직	XB0005
MEGA짧은 스크립트 T7 전사 키트	Ambion	AM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 전사 키트	Ambion	AM1344
산성 페놀 : 클로로포름 (5 : 1)	Ambion	AM9722
25:24 : 1 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올	Invitrogen	15593-049
토끼 망상 적혈구 용해물 (RRL). 뉴클레아제 치료를 해서는 안 됩니다.	Green Hectares, 미국		Green Hectares에 연락하여 1:1 RRL:water
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µ L)	Thermo Fisher	E00382
100 mM dNTP	Invitrogen	56172, 56173, 56174, 56175	각각 25 mM의 재고에 대해 동일한 부품을 혼합합니다.
AMV-RT, 10 U/&마이크로; L	Promega	M5101
Sequenase 버전 2.0 DNA 염기서열분석 키트	Thermo Fisher	707701KT
모델 4200 IR2 DNA 분석기	LI-COR		제품이 단종되었습니다
APS (Ammonium Persulfate)	Bio Basic	AB0072
TEMED	Bio Basic	TB0508
Phusion High Fidelity Polymerase	New 잉글랜드 Biolabs	M0530
터보 Dnase	써모 피셔	AM2238