이 프로토콜 murine 전립선에 바이러스 배달 하는 새로 설립된 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 기술, 유전자 overexpression 또는 Cre recombinase 배달 사용 하 여, 기술 유전자 발현의 orthotopic 변경 허용 하 고 전립선 암에 대 한 새로운 마우스 모델을 구현.
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이 논문에서
요약
초록
전립선 암의 증가 발생, 새로운 종양 드라이버 또는 변조기의 식별은 결정적 이다. 전립선 암에 대 한 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMM) 종양이 성분 및 그것의 복잡 한 microevolution 역학에 의해 방해 된다. 전통적인 전립선 암 마우스 모델을 포함, 다른 사람, 사이 생식 및 조건부 녹아웃, oncogenes, 및이 종이 식 모델의 유전자 변형 식. 이러한 모델에 de novo 돌연변이의 발생은, 시간이 걸리는, 복잡 하 고 비용이 많이 드는. 또한, 전통적인 모델의 대부분 인간의 전립선 암 세포의 작은 하위 집합만 있는 고립 된 이벤트로 진화 하는 잘 알려진 반면 전립선 상피의 대다수를 대상. 귀중 한 모델 전립선 암 개시 뿐만 아니라 고급 질병 진행을 시뮬레이션 해야 합니다.
여기는 바이러스 입자에 의해 전립선 상피 세포를 시험 하 여 몇 가지 셀을 대상 하는 방법에 설명 합니다. Murine 전립선에는 설계 된 바이러스의 배달 전립선 epithelia에 유전자 발현의 변경 수 있습니다. 바이러스 유형 및 수량 이로써 암 개시에 대 한 몇 가지 세포 및 유전자 치료에 대 한 많은 셀 시험에 의해 유전자 변경 대상된 셀 수를 정의 합니다. 앞쪽 엽, 비뇨 기 추적에서 원심에서 수술 기반 주사를 통해이 모델에서 종양 동물의 오 줌 기능을 방해 하지 않고 확장할 수 있습니다. 또한, 전립선 상피 세포의 하위 집합만 대상으로 기술, 종양의 클론 확장을 가능 하 게 하 고 따라서 인간의 종양 개시, 진행, 뿐만 아니라 기저 막 통해 침공을 싫어 하지.
이 새로운 기술은 향상 된 생리 적인 관련성 강력한 전립선 암 모델을 제공합니다. 동물의 고통을 제한, 되며 아무 추가 사육 필수 이기 때문에, 전체 동물 수를 줄일 수 있다. 동시에 새로운 후보 유전자 및 통로의 분석 가속, 차례 차례로 더 비용 효율적입니다.
서론
검색 및 전립선 암 치료는 지난 10 년간 크게 개선 됩니다. 아직도, 전립선 암 발생률은 증가, 수명에 따라. 약 1.1 백만 새로운 경우 전세계, 그것 남자 1에 암 관련 된 죽음의 일반적인 원인 중 하나입니다. 전립선 암은 그 개발에서 속도가 느린 하지만 암 고급 전이성 상태로 진행, 예 후 불량-제한 된 치료 옵션. 지금까지 몇 가지 유전자만이 암에 일반적인 드라이버 확인 되었습니다 그리고 그것의 및 multifocality 방해 biomarkers 및 대상 질병 드라이버2,3의 탐지.
클래식 기법의 생성 GEMMs는 종종 그들의 복잡성, 적시 비용, 및 비용에 의해 손상 됩니다. 조건부 녹아웃 모델 배아 치 생식4에서 비활성화 하는 경우에 발생 하는 전립선 암 후보 유전자 연구에 널리 사용 되어 왔습니다. 가장 일반적인 모델 수정된 Probasin5 중 하나에 의해 구동 전립선 특정 Cre recombinase 또는 PSA6 발기인 추가 교차 사육으로는 GEMM에 통합을 포함 한다. 이 모델에서 대부분 전립선 상피 세포의 증식을 생성 하는 동물의 요로 기능7저하 될 수 있습니다 전체 기관에 관심사의 유전자를 대상 것입니다.
Murine 전립선의 앞쪽 엽에 주입 하 여 Cre 단백질의 바이러스 배달만 몇 셀8을 대상으로 하 여이 문제를 해결할 수 있습니다. 고려 실험실 기술 필수 구성 요소, 전문성, 그리고 목표, 방법 혜택 가능한 변이의 광범위 한 범위에서. 아 데 노비 루스 JunB 와 Pten9 또는 Lentivirus Pten 및 Trp5310 타겟팅 타겟팅을 활용 하 여 성공적인 접근 다른 표시 되었습니다. 바이러스 성 구조 나는 GEMM transgenes luciferase, 등을 추가 또한 생물 발광 영상11통해 질병 진행의 비-침략 적 모니터링 활성화 됩니다.
게놈 편집 CRISPR/Cas9 기술을 기반으로 새롭고 빠른 기회를 체세포 녹아웃12의 빠른 생성을 통해 암 연구를 보여준다. 단일 가이드 RNAs (sgRNAs)의 바이러스 배달 murine 전립선의 앞쪽 엽 감독 전립선 암의 순수 더 관련 모델을 설정 합니다. 이 방법으로 단일 셀 선택한 돌연변이 나르는 확장 및 침략 수 있는 클론을 형성할 수 있다. 또한, 여러 대상 유전자에 대 한 가이드 RNAs의 사용 다른 유전자에 변경 셀 클론을 생성 합니다. 이 각 유전자 변경 또는 epistatic 메커니즘의 중요성을 계시 할 수 있다 암 진행에 종양이 고 자연 선택의 압력을 허용할 것 이다.
여기 우리는 유전자 발현의 변경 murine 전립선에 바이러스 성 입자를 전달 하는 방법을 제시. 작은 복 부 절 개 하 여 murine 앞쪽 전립선 엽 노출 하 고 바이러스 성 입자는 엽에 주입 됩니다. 5 일 수술 후, 수술 클립은 피부에서 제거 될 수 있습니다 그리고 전립선 암은 8 주 후에서 분석 될 수 있다. 전반적으로, 이것은 마우스를 타협 하지 않고 개발에 더 큰 종양 하는 마우스에 작은 영향을 신속 하 고 비용 효율적인 절차.
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프로토콜
이 프로토콜에는 실험실 쥐에서 수술을 포함 한다. 모든 동물 실험을 개별적으로 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 될 해야 합니다. 동물 복구 및 생존에 접근을 기반으로, 모든 시간에 적절 한 마 취, 통증 관리, 무 균 수술 환경 확인 합니다. 가 열 패드를 사용 하 여 수술 및 마 취에서 회복까지 저체온증을 방지 하기 위해.
1. 시작 시 고려 사항
- 사용 하는 바이러스에 따라 다른 titer 요구 사항이 적용 될 수 있습니다; 바이러스를 따라 희석.
참고:이 예제에서는 PBS에 희석 한 Adeno 관련 바이러스 titer 1 x 1012 IU/mL에 주입 됩니다. 바이러스 serotype 9 있으며 가이드 RNA Pten 를 유비퀴틴 promotor (그림 1) 아래 Cre 단백질의 표현을 포함 합니다. Pten 의 손실 증가 pAKT 전립선 상피13의 확산. - 수술의 때에 8 주의 나이에 남성 마우스를 사용 하 여 적절 한 전립선 개발 되도록.
참고:이 실험에서 쥐 Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 쫓 고 마우스 C57BL/6J 배경12 (그림 1)에 있습니다. - 갓 전신 믹스를 준비 하 고 가능 하면 멸 균 유지.
참고: 복구를 위해 더 나은 동물 수술 후, 마 취 해독 제는 좋습니다.- 5 mL 마 취의 전체 볼륨, 혼합 준비 0.15 mL medetomidine 염 산 염 (1mg/mL), 0.4 mL midazolam (5 mg/mL), 및 0.25 mL butorphanol (10mg/mL) 4.2 mL와 멸 균 식 염 수 물 한다.
참고: 흡입 가능 isoflurane 등 대체 마 취 방법, 기관 동물 관리 지침에 따라 사용할 수 있습니다. - Medetomidine 염 수술 후의 효과를, 믹스 0.1 mL atipamezole (5 mg/mL) 4.9 mL와 멸 균 식 염 수 물.
- 5 mL 마 취의 전체 볼륨, 혼합 준비 0.15 mL medetomidine 염 산 염 (1mg/mL), 0.4 mL midazolam (5 mg/mL), 및 0.25 mL butorphanol (10mg/mL) 4.2 mL와 멸 균 식 염 수 물 한다.
- 적절 한 소독과 멸 균으로 무 균 수술 환경을 준비 합니다. 압력솥 사용 하기 전에 수술 악기입니다.
2. 바이러스-배달 Murine 전립선에
- 살 균 1 mL 주사기와 바늘 27G x ½"복 주사 동물을 anesthetize. 0.01 mL/g 몸 무게의 마 취 복용량을 사용 합니다. 절차는 30 분 이상 지속, 유지 마 취 주입 하 여 1/3는 시작 복용량은 매 30 분.
- 근육 이완, 페달 철수, 및 종을 반사를 평가 하 여 마 취 깊이 검사 합니다. 반사의 손실, 관찰 하는 경우는 동물의 아랫 면도.
- 조심 스럽게 멸 균 면봉을 사용 하 여 각 막 반사의 부족으로 인해 실명을 방지 하기 위해 수의 안과 연 고와 동물의 눈을 커버.
- 70% 에탄올과 10 %povidone 요오드 소독 외과 영역을 면도 복 부를 닦아. 주변으로 외과 영역의 중앙에서 외과 영역을 문질러.
- 무 균 수술가 위를 사용 하 여 약 1 ㎝의 낮은 복 부 중간에 수직 피부 절 개를 수행 합니다.
- 리프트 아래 누워 장기 손상을 방지 하기 위해 좋은 포인트 집게를 사용 하 여 복 막. 신중 하 게 < 8 m m 절 개 통해 복 막 수술가 위를 사용 하 여 확인 합니다.
참고: 인간, 달리 쥐의 전립선 4 개의 별도 돌출부를 구성. 앞쪽 엽 정액 소포에 첨부 됩니다. - 부드럽게 정액 소포를 밝히기 지방 조직 옆으로 이동 합니다. 조심 스럽게 들어올려 링 집게를 사용 하 여 앞쪽 전립선 될 때까지 정액 소포 식별 (그림 1).
- 30G x 8 m m 바늘으로 0.5 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 앞쪽 전립선 상피에서 30 µ L 바이러스 (3 x 1010 바이러스 성 입자) 솔루션의 전체 볼륨을 주입. 누설을 최소화 하 고 액체는 작은 거품을 형성 하는 조직 내에서 흡수 합니다. 복 부 구멍에 다시 정액 소포를 놓습니다.
- 2-3 13 m m, 3/8 원와 테이퍼 포인트 바늘 6-0 흡수 봉합을 사용 하 여 간단한 중단된 바늘으로 복을 봉합.
- 3 살 균 4.8 x 6.5 m m 클립 복 막의 손상을 방지 하려면 집게와 함께 피부 리프팅 피부를 주식.
- 더 나은 복구에 대 한 살 균 1 mL 주사기와 바늘 27G x ½ "를 사용 하 여 복 주입 하 여 0.01 mL/g 몸 무게의 복용량에서 마 취 해독 제를 적용 합니다. 신중 하 게 그것의 감 금에 있는 동물 뒤 장소.
3. 수술 후 절차
- 1 시간에 대 한 난방 패드에 완전히 복구 될 때까지 저체온증을 방지 하기 위해 수술 후 수술 마우스 케이지를 유지. 해독 제를 적용 하는 경우 동물 이어야 한다 깨어 주사 후 몇 분입니다.
- 매일 적절 한 상처 치유와 통증 표시에 대 한 동물을 모니터링 합니다. 필요한 경우, 기관 동물 관리 지침에 따라 추가 진통제를 관리 합니다.
- 4-5 일 후, 상처를 닫으면 피부 클립을 제거 합니다.
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결과
평가 murine 전립선에 바이러스 배달, 샘플 수술 후 3 개월을 분석 했다. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 쥐12 셀 Cre 단백질은 바이러스에 의해 표현에 노출에 GFP를 표현 한다. 전립선 샘플 GFP 신호 (그림 2A) 영역을 식별 하는 형광 현미경 검사 법으로 시험 되었다. GFP 신호 전립선 상피만 하지 여부 유전자 편집 유도 하고있다 CRISPR 가이드 Cre 활동을 나타냅니다. Immunohistochemical 섹션 초점 영역 셀 pAKT (그림 2B)의 높은 식이 나타내는 Pten13의 손실을 보였다. 면역 형광 공동 얼룩 pAKT GFP의 두 배 긍정적인 세포 (그림 2C) 확인. 이...
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토론
이 프로토콜에서 바이러스 주입에 의해 murine 전립선의 앞쪽 엽에 유전자 발현을 변경 하는 방법에 설명 하 고 전립선 암 (그림 2)에 대 한 강력한 새로운 마우스 모델을 만드는 우리. 아 데 노 바이러스의 성공적인 관리 Leow 그 외 여러분 20058에 의해 처음으로 설명. 우리는 이전 어떻게 Cre recombinase 단백질에 대 한 코딩 하는 아 데 노비 루스 조직 관련 삭제 9 (그림 2D)에 대 한 Cre 대립 유전자의 시간이 교차 사육을 바꿀 수 있습니다 나타났습니다. 바이러스 감염 몇 셀9, 이후이 모델 클론 확장14,15 의 인간의 시나리오를 모방 하며 암...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
미스터 덴마크 암 협회 (R146-A9394-16-S2)에서 친목에 의해 투자 되었다. MFB와 시가 AUFF 노바 (AUFF-E-2015-FLS-9-8)에 의해 투자 되었다. 미스터와 MFB 공동 대학원, 건강, AU에 의해 투자 되었다. E.F.W. 실험실은 경제 (SAF2015-70857, ERDF-유럽 연합에 의해 공동 투자)와 그랜트 (741888-과학 수사 대-재미) 고급 한 ERC의 스페인 정부에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.
Liliana Fajardo Mellor (유전자, 개발 및 질병; 감사 하겠습니다. 국립 암 연구 센터) 원고의 중요 한 독서에 대 한.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-GT(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J 마우스 | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 인슐린 주사기 | BD | 324825 | 바이러스 주입용 |
| 1 ml 주사기 | BD | 300013 | 마취 주입용 |
| 30 G 1/2' ' 바늘 | BD | 304000 | 마취 주사 |
| 6-0 Polysorb 봉합 | Medtronic | GL889 | 복막을 닫는 |
| 멸균 수술 드레이프 | 여러 공급 업체 | ||
| 가열 패드 | 여러 공급 업체 | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| 트리밍 | 복부를 면도하는 | Aesculap | GT415 |
| Dumont 집게 | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey 마이크로 바늘 홀더 | F.S.T | 12500-12 | |
| 홍채 가위 | F.S.T | 14094-11 | |
| 좁은 패턴 집게 | F.S.T | 11002-12 | |
| 링 집게 | F.S.T | 11106-09 | |
| 상처 클립 시스템 핸들 포함 | 피부 상처 | F.S.T | 12030-01 |
| 상처 클립 시스템 리무버 | F.S.T | 12030-04 | |
| 현미경 | Leica | 다른 모델이 사용되었습니다 | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | 동물시설로부터 수득 | ||
| 시설로부터 수득된 | 부토르파놀 | ||
| 동물시설로부터 수득된 | 메데토미딘하이드로클로라이드 | ||
| 다졸람 | 동물시설로부터 수득 | ||
| 100% 에탄올 | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Eye ointment | Takeda | 7242 | |
| 바이러스(AAV, AV) | 여러 공급업체 | 바이러스는 사내 생산 | |
| pAKT 항체 | CST | 4060 | 사용 1:200 딜루션 |
| GFP anitbody | CST | 2956 | 사용 1:100 딜루션 |
참고문헌
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162, 454(2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mech Dev. 101, 61-69 (2001).
- Ma, X., et al. Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis. Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).
- Chen, Z., et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature. 436, 725-730 (2005).
- Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus. Prostate. 65, 1-9 (2005).
- Thomsen, M. K., et al. Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer. Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).
- Cho, H., et al. a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis. Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).
- Cho, H., et al. Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome. Methods. 77-78, 197-204 (2015).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Wang, S., et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).
- Liu, W., et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med. 15, 559-565 (2009).
- Haffner, M. C., et al. Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer. J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).
- McNeal, J. E. Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views. Prostate. 1, 3-13 (1980).
- Thomsen, M. K., et al. SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation. Cancer Res. 70, 979-987 (2010).
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