CRISPR의 바이러스 배달 Murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드

요약

이 프로토콜 murine 전립선에 바이러스 배달 하는 새로 설립된 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 기술, 유전자 overexpression 또는 Cre recombinase 배달 사용 하 여, 기술 유전자 발현의 orthotopic 변경 허용 하 고 전립선 암에 대 한 새로운 마우스 모델을 구현.

초록

전립선 암의 증가 발생, 새로운 종양 드라이버 또는 변조기의 식별은 결정적 이다. 전립선 암에 대 한 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMM) 종양이 성분 및 그것의 복잡 한 microevolution 역학에 의해 방해 된다. 전통적인 전립선 암 마우스 모델을 포함, 다른 사람, 사이 생식 및 조건부 녹아웃, oncogenes, 및이 종이 식 모델의 유전자 변형 식. 이러한 모델에 de novo 돌연변이의 발생은, 시간이 걸리는, 복잡 하 고 비용이 많이 드는. 또한, 전통적인 모델의 대부분 인간의 전립선 암 세포의 작은 하위 집합만 있는 고립 된 이벤트로 진화 하는 잘 알려진 반면 전립선 상피의 대다수를 대상. 귀중 한 모델 전립선 암 개시 뿐만 아니라 고급 질병 진행을 시뮬레이션 해야 합니다.

여기는 바이러스 입자에 의해 전립선 상피 세포를 시험 하 여 몇 가지 셀을 대상 하는 방법에 설명 합니다. Murine 전립선에는 설계 된 바이러스의 배달 전립선 epithelia에 유전자 발현의 변경 수 있습니다. 바이러스 유형 및 수량 이로써 암 개시에 대 한 몇 가지 세포 및 유전자 치료에 대 한 많은 셀 시험에 의해 유전자 변경 대상된 셀 수를 정의 합니다. 앞쪽 엽, 비뇨 기 추적에서 원심에서 수술 기반 주사를 통해이 모델에서 종양 동물의 오 줌 기능을 방해 하지 않고 확장할 수 있습니다. 또한, 전립선 상피 세포의 하위 집합만 대상으로 기술, 종양의 클론 확장을 가능 하 게 하 고 따라서 인간의 종양 개시, 진행, 뿐만 아니라 기저 막 통해 침공을 싫어 하지.

이 새로운 기술은 향상 된 생리 적인 관련성 강력한 전립선 암 모델을 제공합니다. 동물의 고통을 제한, 되며 아무 추가 사육 필수 이기 때문에, 전체 동물 수를 줄일 수 있다. 동시에 새로운 후보 유전자 및 통로의 분석 가속, 차례 차례로 더 비용 효율적입니다.

서론

검색 및 전립선 암 치료는 지난 10 년간 크게 개선 됩니다. 아직도, 전립선 암 발생률은 증가, 수명에 따라. 약 1.1 백만 새로운 경우 전세계, 그것 남자 ¹에 암 관련 된 죽음의 일반적인 원인 중 하나입니다. 전립선 암은 그 개발에서 속도가 느린 하지만 암 고급 전이성 상태로 진행, 예 후 불량-제한 된 치료 옵션. 지금까지 몇 가지 유전자만이 암에 일반적인 드라이버 확인 되었습니다 그리고 그것의 및 multifocality 방해 biomarkers 및 대상 질병 드라이버^2,3의 탐지.

클래식 기법의 생성 GEMMs는 종종 그들의 복잡성, 적시 비용, 및 비용에 의해 손상 됩니다. 조건부 녹아웃 모델 배아 치 생식⁴에서 비활성화 하는 경우에 발생 하는 전립선 암 후보 유전자 연구에 널리 사용 되어 왔습니다. 가장 일반적인 모델 수정된 Probasin⁵ 중 하나에 의해 구동 전립선 특정 Cre recombinase 또는 PSA⁶ 발기인 추가 교차 사육으로는 GEMM....

프로토콜

이 프로토콜에는 실험실 쥐에서 수술을 포함 한다. 모든 동물 실험을 개별적으로 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 될 해야 합니다. 동물 복구 및 생존에 접근을 기반으로, 모든 시간에 적절 한 마 취, 통증 관리, 무 균 수술 환경 확인 합니다. 가 열 패드를 사용 하 여 수술 및 마 취에서 회복까지 저체온증을 방지 하기 위해.

1. 시작 시 고려 사항

1. 사용 하는 바이러스에 따라 다른 titer 요구 사항이 적용 될 수 있습니다; 바이러스를 따라 희석.
   참고:이 예제에서는 PBS에 희석 한 Adeno 관련 바이러스 titer 1 x 10¹² IU/mL에 주입 됩니다. 바이러스 serotype 9 있으며 가이드 RNA Pten 를 유비퀴틴 promotor (그림 1) 아래 Cre 단백질의 표현을 포함 합니다. Pten 의 손실 증가 pAKT 전립선 상피¹³의 확산.
2. 수술의 때에 8 주의 나이에 남성 마우스를 사용 하 여 적절 한 전립선 개발 되도록.
   참고:이 실험에서 쥐 Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 쫓 고 마....

결과

평가 murine 전립선에 바이러스 배달, 샘플 수술 후 3 개월을 분석 했다. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 쥐¹² 셀 Cre 단백질은 바이러스에 의해 표현에 노출에 GFP를 표현 한다. 전립선 샘플 GFP 신호 (그림 2A) 영역을 식별 하는 형광 현미경 검사 법으로 시험 되었다. GFP 신호 전립선 상피만 하지 여부 유전자 편집 유도 하고있다 CRISPR 가이드 Cre 활동을 나타냅니다. Immunohistochemical 섹션 초점 영역 셀 pAKT (그림 2B)의 높은 식이 나타내는 Pten¹³의 손실을 보였다. 면역 형광 공동 얼룩 pAKT GFP의 두 배 긍정적인 세포 (그림 2C) 확인. 이.......

토론

이 프로토콜에서 바이러스 주입에 의해 murine 전립선의 앞쪽 엽에 유전자 발현을 변경 하는 방법에 설명 하 고 전립선 암 (그림 2)에 대 한 강력한 새로운 마우스 모델을 만드는 우리. 아 데 노 바이러스의 성공적인 관리 Leow 그 외 여러분 2005⁸에 의해 처음으로 설명. 우리는 이전 어떻게 Cre recombinase 단백질에 대 한 코딩 하는 아 데 노비 루스 조직 관련 삭제 ⁹ (그림 2D)에 대 한 Cre 대립 유전자의 시간이 교차 사육을 바꿀 수 있습니다 나타났습니다. 바이러스 감염 몇 셀⁹, 이후이 모델 클론 확장^14,15 의 인간의 시나리오를 모방 하며 암.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Equipment
B6J.129(B6N)-GT(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J 마우스	The Jackson Laboratory	26175
0,5 ml U-100 인슐린 주사기	BD	324825	바이러스 주입용
1 ml 주사기	BD	300013	마취 주입용
30 G 1/2' ' 바늘	BD	304000	마취 주사
6-0 Polysorb 봉합	Medtronic	GL889	복막을 닫는
멸균 수술 드레이프	여러 공급 업체
가열 패드	여러 공급 업체
Povidone-Iodine Prep Pad	Fisher Scientific	06-669-70
트리밍	복부를 면도하는	Aesculap	GT415
Dumont 집게	F.S.T	11252-00
Halsey 마이크로 바늘 홀더	F.S.T	12500-12
홍채 가위	F.S.T	14094-11
좁은 패턴 집게	F.S.T	11002-12
링 집게	F.S.T	11106-09
상처 클립 시스템 핸들 포함	피부 상처	F.S.T	12030-01
상처 클립 시스템 리무버	F.S.T	12030-04
현미경	Leica		다른 모델이 사용되었습니다
Reagents
1x PBS	Gibco	10010-023
Antisedan			동물시설로부터 수득
시설로부터 수득된	부토르파놀
동물시설로부터 수득된	메데토미딘하이드로클로라이드
다졸람			동물시설로부터 수득
100% 에탄올	Fisher Scientific	22-032-103
Eye ointment	Takeda	7242
바이러스(AAV, AV)	여러 공급업체		바이러스는 사내 생산
pAKT 항체	CST	4060	사용 1:200 딜루션
GFP anitbody	CST	2956	사용 1:100 딜루션

사 일회용 기계 클립 시스템 리무버 된 동물미된이 프로토콜에 사용되는 입니다.