Method Article

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

DOI:

10.3791/57543

⸱

May 21st, 2018

 ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 생체 외에서 문화에 대 한 셀의 신속 하 고 특정 격리 수 있는 기본 마우스 oligodendrocytes의 immunomagnetic 절연을 설명 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

효율적이 고 강력한 격리와 기본 oligodendrocytes (OLs)의 문화는 oligodendroglia의 개발 뿐만 아니라 demyelinating 다 발성 경화 증과 같은 질병의 생물학의 생체 외에서 연구에 대 한 유용한 도구와 Pelizaeus-Merzbacher-같은 질병 (PMLD). 여기, 우리 간단 하 게 제시 하 고의 immunomagnetic 절연에 대 한 효율적인 선택 방법을 단계 3 O4+ preoligodendrocytes 세포에서 신생아 쥐 새끼. 미 숙 OL 80% 이상 설치류 뇌 백색 질 출생 후 제 7 일에의 (P7)이 격리 방법 뿐만 아니라 셀룰러 고수익을 보장 뿐만 아니라 이미 oligodendroglial 계보 최선을 다하고 OLs의 특정 격리 구성, 이후 감소 하는 이다 등 오염 셀과 다른 셀 쥐의 뇌에서 분리 가능성. 이 방법은 기술 이전, 보고의 이며 약 4 시간에 80% 이상 oligodendrocyte 준비 순수성을 제공 합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oligodendrocytes (OLs) 중앙 신경 시스템 (CNS)1의 myelinating 세포 이다. 분리와 밀접 하 게 환경에서 기본 oligodendrocytes의 문화는 oligodendroglia의 개발 뿐만 아니라 demyelinating 질병 다 발성 경화 증2의 생물학의 생체 외에서 연구를 위한 유용한 도구 . 이는 효율적이 고 강력한 oligodendrocyte 고립과 문화 방법3필요합니다. 이 연구에서 우리는 신속 하 고 구체적인 수정된 격리 기술을 구현 하는 독특한 oligodendrocyte 세포 표면 마커 표현의 활용을 했다.

Oligodendrocyte 성숙의 4 단계로 발견 되었습니다, 그리고 각 각 발달 단계 (그림 1)에 대 한 독특한 세포 표면 마커 표현의 특징. 이러한 세포 표면 마커 특정 항 체4,5에 의해 인식 될 수 있다 그리고 특정 단계에서 OLs를 격리 하는 데 사용할 수 있습니다. 첫 번째 단계에서 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs) 증식, 마이그레이션, 특히 혈소판 파생 된 성장 인자 수용 체 (PDGF-Rα)6, ganglioside A2B5, proteoglycan NG27,8 표현 하 능력을가지고 , polysialic 산 신경 세포 접착 분자9 및 지방 산 묶는 단백질 7 (FABP7)10. OPCs는 신경 선구자 세포11의 특성은 세포 체의 반대 극에서 나오는 몇 가지 짧은 프로세스와 바이 폴라 형태가 있다.

희소돌기아교세포 성숙도; 마커가 있는 단계: OPC, 전희소돌기아교세포, 미성숙, 성숙.
그림 1: 식 세포 표면 마커 마우스 oligodendrocyte 개발 중. OLs 세포 표면 마커 같은 A2B5, GalC (o 1), NG2, O4, 및 PDGF Rα 구체적으로 특정 항 체를 사용 하 여 특정 발달 단계에서 oligodendrocytes를 분리 사용할 수 있습니다.   이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

두 번째 단계에서 OPCs preoligodendrocytes 하 고 세포 막에 표현 OPC 표식, 뿐만 아니라 O4 항 체12,13, 그리고14GPR17 단백질 의해 인식 하는 sulfatide (sulfated galactolipid) 미 성숙한 oligodendrocyte (OL) 단계까지 지속합니다. 이 단계에서 preoligodendrocytes는 다중 짧은 프로세스를 확장합니다. Preoligodendrocytes에 있는 주요 OL 무대 출생 후 하루 2 (P2)에 미 숙 OLs15의 작은 인구와 가진 쥐와 쥐의 대뇌 백 질.

세 번째 단계에서 미 숙 OLs O4 표현, 표현의 A2B5 및 NG2 마커를 잃고과 galactocerebroside C16을 표현 하기 시작 계속. 이 단계에서 OLs oligodendroglial 계보에 최선을 다하고 있습니다 그리고 긴 없는 분기17,18와 포스트 mitotic 세포가. 미 숙 OL P7에 설치류 백색 물질의 80% 이상 구성 하 고이 이번에 첫 번째 MBP+ 셀15,19,,2021관찰 된다. 따라서, P7에 OLs의 격리 수 셀룰러 고수익을 확인 하십시오.

OL 개발의 최종적이 고 4 단계에서 성숙 OLs 익스프레스 myelinating 단백질 (myelin 기본적인 단백질 (MBP), proteolipid 단백질 (PLP), 수 초 관련 된 당단백질 (MAG) 및 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG)22,23 ,,2425,26. 이 단계에서 성숙 OLs 확장 막 투과성 축 삭 주위 sheaths 그 양식 컴팩트 하 고 미 수 있습니다. 이 쥐와 쥐 두뇌에 MBP+ 세포 P1419,,2021에서 점점 더 풍부한가 관찰과 일치 한다.

Fewster와 동료 196727oligodendrocyte의 첫 번째 분리 이후 설치류 CNS에서에서 OLs의 격리를 위해 여러 가지 방법은 immunopanning28,,2930를 포함 하 여 구현 되었습니다. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 세포 표면의 특정 항 원28,31, 차동 그라데이션 원심32,,3334,35 이용 및 다른 CNS 명과36,37의 차동 준수에 따라 떨고 방법. 그러나, 기존의 문화 방법 특히 순도, 수율 및38의 절차 수행 하는 데 필요한 시간 측면에서 한계를가지고. 따라서, oligodendrocytes에 대 한 보다 효율적인 절연 방법이 제시해 주셔야 합니다.

이 문서에서는 간단한 소개 및 immunomagnetic 격리에 대 한 효율적인 선택 방법을 단계 3 O4+ preoligodendrocytes 세포에서 신생아 쥐 새끼. 이 방법은 기술에 머리 외 에 의해 보고 수정 39 그리고 Dincman 외. 40 약 4 h에서 80% 이상이 oligodendrocyte 준비 순수성을 제공 합니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에 사용 된 쥐 SUNY Downstate 의료 센터 부문의 실험실 동물 자원 (DLAR) 프로토콜 번호 15-10492의 지침에 따라 마음에 든다고 했다.

참고: 기본 oligodendrocytes 신생아 (P5-P7 야생-타입 C57Bl/6N)에서 고립 된 쥐. 이 단계에서 미 성숙한 OLs 셀룰러 고수익 보장 설치류 백색 물질의 80% 이상 구성 한다. 모든 버퍼 및 시 약 구성 재료의 테이블의끝에 사용할 수 있습니다.

1. Coverslips 준비

참고: 폴 리-D-리 (PDL) / 코팅 laminin coverslips OL 격리 전에 준비 되어야 한다.

  1. 장소 #1 독일 50 mL 원뿔 튜브에 coverslips 유리 및 추가 70%의 35 mL EtOH 그들을 청소.
  2. 튜브, nutating 믹서에 닫고 락을 부드럽게 하는 동안 적어도 30 분 동안 실 온에서 품 어. Coverslips는 하룻밤 incubated 수 있습니다.
  3. 70 %EtOH 삭제 합니다.
  4. Coverslips 이온을 제거 된 물으로 3 회 세척, 물 진공 포부와 함께 모든 시간을 제거 합니다.
  5. PDL 50 µ g/mL의 30-35 mL 50 mL 튜브, 충분히 커버는 coverslips에에서 coverslips를 추가 합니다.
  6. Nutating 믹서에 coverslips를 포함 하는 50 mL 튜브를 배치 하 고 적어도 30 분 동안 실내 온도에 온화 하 게 흔든 하는 동안 품 어.
  7. 워시 3 번 물 진공 포부와 함께 모든 시간을 제거 하는 이온된 수로 coverslips.
  8. 60 mm 접시 포함 하는 이온된 수로는 coverslips를 전송 합니다.
  9. P200 피 펫 팁을 사용 하 여 레이어를 페 트리 접시의 전체 표면을 커버는 coverslips를 정렬.
  10. 조심 스럽게, 진공 포부와 함께 요리에서 물 제거.
  11. coverslips 주위에 물의 과잉을 제거 하 고 그들이 하룻밤 말리 면 뚜껑 열고와 후드에 자외선 아래.
    참고: PDL 코팅 유리 coverslips 저장할 수 있습니다 멸 균 페 트리 디쉬에 4 ° C에서 최대 3 개월.
  12. 장소 잘 당 하나 24-잘 접시로 coverslips 미세 집게를 사용 하 여.
  13. 잘 확인 하 고 가장자리는 우물의 벽을 만지지 마십시오의 센터에 있는 coverslips를 이동 합니다.
  14. B27NBMA에 희석 10 µ g/mL laminin의 100 µ L를 추가 ( 테이블의 자료를 참조) 각 coverslip의 센터에서 시작 하 고 모든 영역을 커버 원형 패션 가장자리 쪽으로 이동.
    참고: 이후 laminin OL 유지 관리에 참여 하 고 성숙한 OLs로 차별화를 추진 하 고, 생체 외에서 문화41,42,,4344한 중요 한 OL 생존 요소 이다.
  15. 접시는 37 ° C 인큐베이터 5% CO2 는 OLs 도금에 대 한 준비가 될 때까지 또는 적어도 1 시간에에서 품 어.

2. 마우스 뇌 피 질 분리

  1. 이전에 70% 에탄올에 청소 하는 위로 빠른 잘린 여 출생 후 5-7 일 오래 된 C57Bl/6N 마우스 새끼를 희생.
    참고: 5-6 신생아 쥐 새끼에서 뇌성 외피가 각 준비를 위해 사용 되었다. 평균적으로, 한 쥐의 뇌 1-1.5 x 106 OLs 생성합니다.
  2. 작은 해가 위로 중간 선 따라 두 피 피부를 잘라내어 노출 두개골을 철회.
  3. 뇌의 손상을 방지 하려면가 위 들고 정면 지역으로 두개골 뒤쪽 오프닝에서 시작 하는 중간에 따라 신중 하 게 두개골을 잘라. 그런 다음, 두개골의 기지에 따라 각 눈 소켓으로 잘라 두개골 뒤쪽 열기를 사용 하 여.
  4. 미세 집게를 사용 하 여 부드럽게 애타게 하는 midbrain 멀리 외피가 고 B27NBMA의 7 mL를 포함 하는 60 m m 조직 문화 접시에 그들을 전송. 해 부 외피가 풀링 각 두뇌에 대 한 2.2 2.4 통해 단계를 반복 합니다.
  5. 외피가 분리 버퍼의 5 mL를 포함 하는 새로운 60 m m 조직 문화 접시에 전송 (B27NBMA, 20-30 U/mL Papain, 그리고 2500 U DNase I).
  6. #15 메스 블레이드를 사용 하 여 약 1 m m3 의 작은 조각으로 된 외피가 주사위 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기에에서 20 분 동안 품 어.
  7. 소 성장 혈 청 효소 반응을 중지 하 (BGS)의 1 mL를 추가 합니다.
  8. 10 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 15 mL 원뿔 튜브 외피가 분리 미디어 함께 전송.
  9. 부드럽게 천천히를 pipetting으로 뇌 조직의 분열을 시작 하 고 6-8 시간 10 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 아래로 거품을 최소화 하기 위해 관리 사용 하 여.
  10. 2-3 분 동안 정착 하 여 신선한 튜브는 상쾌한 전송 조직 덩어리를 허용 합니다.
  11. 10%를 포함 하는 B27NBMA의 3 mL를 추가 BGS/2500 U DNase I 조직에 작은.
  12. 5 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 위아래로 pipetting 동안 두뇌 조직 해리 번 6-8. 거품을 최소화 하기 위해 주의 해야 합니다.
  13. 2-3 분 동안 정착 조직 덩어리를 허용 합니다.
  14. 신선한 튜브는 상쾌한 전송. 10%를 포함 하는 B27NBMA의 3 mL를 추가 BGS/DNase I 조직에 작은.
  15. 부드럽게 P1000 피펫으로 팁을 사용 하 여 미디어의 믹스를 pipetting 뇌 조직의 해리와 뇌 조직 위와 아래로. 반복 단계 2.13, 2.14 조직의 더 큰 덩어리 유지 될 때까지 또는 B27NBMA까지 10% 포함 된 BGS/DNase I는 소진, 둘 중 먼저 온다. 거품을 최소화 하기 위해 주의 해야 합니다.
  16. 풀 세포 현 탁 액 이전 supernatants와.
  17. 50 mL 튜브에서 70 µ m 셀 여과기를 놓습니다. 10 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 전달 풀링된 세포 현 탁 액 부드럽게 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해.
  18. 10%를 포함 하는 B27NBMA의 1 mL을 추가 하 여 셀 여과기를 세척 BGS/DNase I.
  19. 셀 스 트레이너를 삭제 합니다. 30-mL와 함께 B27NBMA 10%를 포함 하는 볼륨가지고 BGS/DNase I.
  20. 두 개의 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 셀 서 스 펜 션 200 x g에서 10 분 원심
  21. 상쾌한 공기에 노출 하는 셀을 떠나지 않고 제거 합니다. 상쾌한 세포 파편으로 인해 흐린 될 것입니다. 10%를 포함 하는 B27NBMA의 3 mL를 추가 BGS 펠 릿을.
  22. 조심 스럽게 P1000 피펫으로 사용 하 여 셀 펠 릿 해리. 10%를 포함 하는 B27NBMA와 15 mL에 볼륨을가지고 BGS.
  23. 신선한 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 전달 합니다.
  24. 10%를 포함 하는 B27NBMA의 1 mL을 추가 하 여 셀 여과기를 세척 BGS. 셀 스 트레이너를 삭제 합니다.
  25. 10%를 포함 하는 B27NBMA와 30 mL에 볼륨을가지고 BGS.
  26. 2 x 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 셀 서 스 펜 션 200 x g에서 10 분 원심
  27. 공기에 노출 하는 셀을 떠나지 않고는 상쾌한의 대부분을 제거 합니다. 얼음 차가운 자기 셀 정렬 (MCS) 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.

3입니다. 세포 수 그리고 생존의 결정

  1. 100 µ L 세포 현 탁 액의 0.4% (w/v)에 1:5 희석을 달성 하기 위해 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 Trypan 블루 솔루션의 400 µ L로 희석.
  2. 커버 유리 hemocytometer 챔버 및 채우기 셀 희석 P10 피 펫을 사용 하 고 피하의 10 µ L로 두 챔버 연극 센터. 솔루션은 모 세관 작용에 의해 커버 유리 아래에 전달 합니다.
  3. 현미경 단계에는 hemocytometer를 놓고 40 X 확대를 사용 하 여 초점을 조정 합니다.
    참고: 셀 카운트 5 사각형 (4 모서리와 한 센터)의 각각에서 휴대용 카운터를 사용 하 여 기록 됩니다. 비-가능한 셀만 염료를 흡수 하 고 블루, 라이브 하는 동안 표시 그리고 건강 한 세포 라운드 및 굴절 밀리 리터 당 실용적이 고 전체 셀의 수의 결심에 대 한 수 있도록 블루 색 염료를 흡수 하지 않습니다.

4. 절연 O4의+ Oligodendrocytes

  1. 셀 서 스 펜 션 10 분 200 x g에서 원심
  2. 신중 하 게 셀의 공기에 노출을 피하고 진공 포부를 사용 하 여는 상쾌한을 삭제 합니다.
  3. 1 x 107 총 셀 안티-O4 구슬 1 x 107 셀 당 10 µ L의 추가 의해 따라 당 MCS 버퍼의 90 µ L에 펠 릿을 resuspend.
  4. 부드럽게 터치 손가락 15 mL 원뿔 튜브 4-5 배 하 여 세포 현 탁 액 및 비즈 믹스.
  5. 터치는 손가락으로 15 mL 원뿔 튜브 4-5 timesevery 4 ° C에서 15 분 동안 혼합 품 어 5 분.
  6. 부드럽게 튜브를 1 x 107 셀 당 MCS 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 여 믹스를 씻어. 10 분 동안 200 x g에서 혼합 원심
  7. 상쾌한 신중 하 게 셀의 공기에 노출을 피하고 진공 포부를 사용 하 여 삭제 합니다. 모든 1 x 107 셀에 대 한 MCS 버퍼의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
  8. 마그네틱 구분 기호 자석 분리기 스탠드에 연결 합니다. 자석 분리기를 선택 열을 연결 하 고 열 위에 40 µ m 셀 여과기를 놓습니다. 두 개의 15 mL 또는 수집을 통해 흐름을 분리 열 아래 한 50 mL 원뿔 튜브를 배치 합니다.
  9. 미리 40 µ m 셀 스 트레이너 및 분리 열 MCS 버퍼의 3 mL을 헹 구 고 버퍼 없이 건조 시키는 열 통해 실행 하자.
  10. 셀 스 트레이너를 선택 열에 세포 현 탁 액 및 구슬의 믹스를 추가 합니다.
  11. MCS 버퍼의 1 mL와 함께 40 µ m 셀 여과기를 세척.
  12. 셀 스 트레이너를 삭제 하 고 셀, 구슬 및 버퍼 없이 건조 시키는 열을 통해 실행의 혼합.
  13. MCS 버퍼의 3 mL와 함께 3 번 분리 열 및 OL 확산 미디어와 1 시간 세척.
  14. 자석 분리기에서 분리 열을 제거 하 고 신속 하 게 15 mL 원뿔 튜브에 배치 즉시 OL 확산 미디어의 5 mL을 추가.
  15. 열과 단단히 15 mL 원뿔 튜브로 레이블이 지정 된 셀에 밖으로 플러시를 위에 플런저 장소.
  16. 세포 수 및 섹션 3에에서 표시 된 대로 Trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 생존 능력 결정에 세포 현 탁 액의 100 µ L을 제거 합니다.
    참고: 80% 이상의 세포 생존 능력의 OLs, 문화 계속 허용 것으로 간주 됩니다 하지만 가능성 90% 이상 최적입니다.

5. 격리 O4 도금+ Oligodendrocytes

  1. 밀도 (coverslip 당 5 x 105 셀)을 도금 하는 욕망에 세포 현 탁 액 희석 OL 확산 미디어를 사용 하 여.
    참고: OL 시드 밀도 이므로 매우 중요 한 진행 하기 전에 조직 문화 현미경을 사용 하 여 적절 한 세포 밀도 확인 해야 합니다. 10, 000 셀/coverslips 아래 밀도 시드 가난한 세포 생존을 이어질 수 있습니다. 10, 000에 25000, OL에서 밀도 도금 형태학 차별화 느린45입니다. 우리는 세포 생존을 위해 적어도 50, 000 셀/coverslips의 시드 밀도에 OLs 플레이트.
  2. 포함 하는 조직 문화 후드에 인큐베이터에서 laminin 코팅 coverslips 24-잘 접시를 이동 합니다.
  3. 각 coverslip에서 laminin를 제거 하 고 이런 서 스 펜 션의 100 µ L로 대체.
  4. 홍보는 coverslips에 OL 접착 45 분의 최대 37 °C/5% CO2 배양 기에서 OLs를 품 어.
  5. 부 화, 후 인큐베이터에서 24-잘 접시를 제거 합니다. 각 홍수 OL 확산 미디어의 500 µ L로 24-잘 접시의 잘.
  6. 추가 24 h에 대 한 37 °C/5% CO2 배양 기에 다시는 OLs를 놓습니다.
  7. OLs, 도금 후 24 h 확산 미디어를 제거 하 고 차별화를 유도 하기 위해 이런 차별화 미디어와 대체.
  8. 인큐베이터에는 OLs를 놓고 셀 고정을 위한 준비가 될 때까지 제거 하지 마십시오.
    참고: ph에서 변화 OLs에 대 한 저해는 세포 생존 능력을 감소, 따라서 OLs 문화 인큐베이터에서의 불필요 한 제거는 피해 야 한다.

6. 면역 형광 염색

  1. 셀의 검출에 대 한 표면 마커 (NG2, o 1와 O4) 우물에서 미디어를 제거합니다.
  2. O 1 (undiluted)13 과 O4 (undiluted)13 에 대 한 1 차 항 체를 포함 하는 마우스 hybridoma supernatants의 250 µ L을 추가 하 고 NG2 상대로 polyclonal 토끼 (1:150 B27NBMA에 희석).
    참고: 상용 안티-o 1와 안티-O4 항 체 사용할 수 있다면, 그것은 제조 업체에서 제안 하는 희석을 활용 하는 것이 좋습니다.
  3. 37 °C/5% CO2 배양 기에서 최대 45 분에 대 한 1 차적인 항 체와 세포를 품 어.
  4. 트윈-20/1 X PBS 0.05%로 두 번 세척. 4 %paraformaldehyde 셀을 수정 (4 %PFA) 실 온에서 10 분.
  5. 트윈-20/1 X PBS 각 0.05 %5 분에 대 한 세 번 씻어.
  6. 알 렉 사 488 활용 된 염소 반대로 마우스 IgM 또는 안티-토끼 IgG 이차 항 체 (1:400) B27NBMA에 희석.
  7. coverslips에서 0.05% 트윈-20/1 X PBS를 제거 합니다. 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 이차 항 체와 세포를 품 어.
  8. 트윈-20/1 X PBS 각 0.05 %5 분에 대 한 세 번 씻어.
  9. 이중 내부 마커 (GFAP)의 검출에 대 한 얼룩, 0.05% 트윈-20/1 X PBS와 블록/permeabilize 셀 블록/permeabilization 버퍼 실 온에서 15 분을 제거 합니다. 그렇지 않으면 6.17 단계로 진행 합니다.
  10. 블록/permeabilization 버퍼를 제거 하 고 250 µ L 닭 안티-GFAP (1: 100) 블록/permeabilization 버퍼에 희석을 추가.
  11. 실 온에서 1 h에 대 한 안티-GFAP와 셀을 품 어. 트윈-20/1 X PBS 각 0.05 %5 분에 대 한 세 번 씻어.
  12. 알 렉 사 594 활용 된 염소 항 치킨 IgG 이차 항 체 (1:400) B27NBMA에 희석.
  13. coverslips에서 0.05% 트윈-20/1 X PBS를 제거 합니다. 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 이차 항 체와 세포를 품 어.
  14. 트윈-20/1 X PBS 각 0.05 %5 분에 대 한 세 번 씻어.
  15. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 counterstain 하 고 antifade DAPI 포함 된 미디어 설치 된 셀을 탑재.
  16. coverslips 하룻밤 실 온에서 어두운에서 치료 하자.
  17. Epifluorescence 현미경으로 얼룩진된 셀을 이미지.
    참고:이 프로토콜에 셀은 몇 군데 균일 한 노출 시간을 사용 하 여 40 X 확대.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구의 목적은 O4에 대 한 향상 된 절연 방법을 확립 하는 것 이었다+ 대상 셀의 가능한 최소 조작 해야 하는 기본 마우스 oligodendrocytes. Coverslips 셀의 도금에 새끼의 안락사에서 전체 절차에 대 한 4 시간 걸립니다 그리고 여기에 표시 된 데이터 3 개의 독립적인 실험을 대표 한다. 조직 분리 후 4.3 ± 0.46 x 107 셀의 평균 각 독립적인 실험, 91% ± 5.6%의 생존 능력에 대 한 격리 했다. Immunomagnetic 절연 안티-O4를 사용 하 여 태그 자석 microbeads 후 평균 6.9 ± 0.38 x 106 의 OLs 가져온 (1-1.5 x 10 마우스 당6 )는 16.2% ± 1.6% 총 처음 해리; 생존은 96.3% ± 3.5%.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 통신에 우리는 높게 순화 된 미 숙 마우스 oligodendrocyte 문화의 효율적인 격리 하는 방법을 제시. 이전에 게시 프로토콜39,40에 비해,이 방법은 GFAP 양성 이다의 훨씬 더 낮은 수준 및 기타 비 특징 셀의 매우 낮은 비율 높은 순도 나왔고. 그것은 이들은 미 숙 OLs oligodendroglial 계보 이미 최선을 다하고 지적 하는 것이 중요입니다. 따라서,이 세포 분화의 초기 단계의 연구에 유용 하지 않을 것 이다.

Dincman 프로토콜40 에서 수정 중 하나 우리의 확산 미디어에서 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF) 제거 했다. 그것은 알려졌다 그 생체 외에서bFGF 강한 mitogenic 요소 역할 뿐만 아니라 차별화에서 OPCs를 억제 하지만 또한 프로세스

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 아무 공개 있다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 국가 다 발성 경화 증 사회 (RG4591A1/2)와 건강의 국가 학회 (R03NS06740402)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자는 실험실 공간, 장비 및 조언을 제공 하기 위한 박사 이반 에르난데스와 그의 연구실 회원을 감사 합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10ml 혈청학 피펫Fisher Scientific13-676-10J
10ml 주사기 Luer-Loc 팁BD, Becton Dickinson309604
15ml 원추형 튜브Falcon352097
24웰 조직 배양 플레이트Falcon353935
40µ m 세포 여과기Fisher Scientific22368547
50ml 원뿔형 튜브Falcon352098
5ml 혈청학 피펫Fisher Scientific13-676-10H
60mm 조직 배양 플레이트Falcon353002
70µ m 세포 여과기Fisher Scientific22363548
Alexa Fluor 488 염소, 항-마우스 IgG (H+L), 2차 항체InvitrogenA11001
Alexa Fluor 488 염소, 항-토끼 IgM (H+L), 2차 항체InvitrogenA21042
Alexa Fluor 488 염소 anti-rabbit IgM (H+L), 2차 항체InvitrogenA11008
Alexa Fluor 594 염소 안티 닭 IgG (H + L) 2 차 항체InvitrogenA11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeadsMiltenyi Biotec130-094-543
Apo-Transferrin humanSigmaT1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250mlUSA Scientific6032-1101
Autofil complete bottle top filter 어셈블리, 0.22um 필터, 250mlUSA Scientific6032-1102
B27 보충제Invitrogen17504-044
붕산SigmaB7660
소 성장 세럼(BGS)GE Healthcare Life SciencesSH30541.03
BSAFisher ScientificBP-1600-100
CNTFPeprotech450-50
d-BiotinSigmaB4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I)WorthingtonLS002007
EDTAFisher ScientificS311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 cameraOlympusBx51
Feather 일회용 메스Andwin ScientificEF7281C
ForskolinSigmaF6886
독일 유리 커버 슬립, # 1 두께, 직경 12mm 원형NeuVitroGG-12-oz
GFAP 항체AvesGFAP
포도Fisher ScientificD16-1
GlutaMAXInvitrogen35050-61
InsulinInvitrogen12585-014
자기 분리기 스탠드 - MACS 멀티스탠드Miltenyi Biotec130-042-303
자기 분리기-MiniMACS 분리기Miltenyi Biotec130-042-302
Millex PES 0.22µ m 필터 유닛MilliporeSLG033RS
마운팅 미디어- Prolong Gold with DAPIThermo FisherP36930
N-acetyl-cysteine (NAC)SigmaA8199
Natural mouse lamininInvitrogen23017-015
Neurobasal Medium AInvitrogen10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3)Peprotech450-03
NG2 항체MilliporeAB5320
PapainWorthingtonLS003126
Ca2+ 및 Mg2+SigmaD5652
PDGFPeprotech100-13A
페트리 접시Falcon351029
Poly-D-LysineSigmaP6407
PrimocinInvivogenant-pm-2
ProgesteroneSigmaP8783
PutrescineSigmaP5780
Selection column-LS columnsMiltenyi Biotec130-042-401
Sodium SeleniteSigmaS5261
Trace elements B코닝25-000-CI
트리요오드티로닌(T3)시그마T6397
트리톤-X시그마T8787
트리판 블루 솔루션코닝25-900-CI
트윈 20시그마P1379
B27NBMA487.75 mL 신경기저 배지 A; 10mL B27 보충제; 1mL 프리모신; 1.25mL 글루타맥스; 필터는 살균하고 4°C에서 보관합니다. C를 사용할 때까지.
B27NBMA + 10% BGS27 mL B27NBMA; 3 mL 소 성장 혈청
CNTF 용액 스톡(10 µ g/ml; 1000X)Peprotech에서 주문(450-50). 제조사에 따라 0.1-1 mg/ml로 메이크업 s 명령어(로트마다 다를 수 있음)를 버퍼(예: DPBS + 0.2% BSA)에 넣습니다. -80 °C.
저장 작업 솔루션(10 &마이크로; g/ml, 1000X)
1. DPBS 용액에 0.2% BSA(Fisher scientific BP-1600-100)를 넣고 살균합니다.
2. 마스터 스톡 부분 표본을 10µ로 희석합니다. 멸균, 냉각 0.2% BSA/DPBS.
의 g/ml 3. 부분 표본 (20µ l/tube) 및 액체 nitrogen.
에 있는 스냅 동결 4. 부분 표본은 -80 °C에서 저장합니다.
d-비오틴 원액(50 µ g/ml; 5000X)d-Biotin (Sigma-B4639)을 50 µ에서 이중 증류 H2O에 재현탁; g/ml(예: ddH2O 50ml에 2.5mg). 재부유는 상당한 양의 교반/소용돌이 또는 37°C에서 잠시 가벼운 온난화가 필요할 수 있습니다. d-비오틴이 여전히 용해되지 않으면 덜 농축된 것을 구성하는 것이 좋습니다(예: 10µ g/ml)을 사용하여 B27NBMA에 더 높은 부피(1/5000) 대신 1/5000)을 추가합니다. 4°C에 보관하십시오.
DNase I 재고 용액1. 12,500U Deoxyribonuclease I/ml에서 얼음에 식힌 HBSS에 용해합니다.
2. 필터는 ice
에서 살균합니다 3. 200 &마이크로에서 부분 표본; l 하룻밤 동안 -20°C.
에서 동결 4. 부분 표본은 -20에서 -30°C에 저장합니다.
둘베코' s 인산염 완충 식염수(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)파우치를 물 1리터에 녹여 배지 1리터당 분말 9.6g을 생성합니다. 2-8 °C에 보관하십시오.
포스콜린 원액(4.2mg/ml, 1000X)병(Sigma-F6886)에 50mg 포스콜린에 멸균 DMSO 1ml를 첨가하고 재현탁될 때까지 피펫팅합니다. 15 ml 원심분리기 튜브로 옮기고 11 ml의 멸균 DMSO를 추가하여 4.2 mg/ml를 만듭니다. 분취량(예: 20 µ l)에서 -20°C로 저장합니다.
행크' s 평형 염 (HBSS) (시그마1. 물 900ml를 측정합니다(온도 15-20 ° C) 실린더에 넣고 부드럽게 저어줍니다.
2. 힘을 넣고 녹을 때까지 저어줍니다.
3. 소량의 물로 원래 패키지를 헹구어 분말의 모든 흔적을 제거하십시오.
4. 2.
5단계에서 솔루션에 추가합니다. 최종 부피 1리터당 0.35gr의 중탄산나트륨(7.5% w/v)을 추가합니다.
6. 녹을 때까지 계속 저어줍니다.
7. 여과 중에 상승할 수 있으므로 pH= 7.4 미만의 0.1-0.3 단위로 교반하는 동안 버퍼의 pH를 조정합니다. pH.
8을 조정하려면 1N HCl 또는 1N NaOH를 사용하는 것이 좋습니다. 물을 더 추가하여 최종 부피를 1L.
9로 가져옵니다. 다공성이 0.22 미크론인 멤브레인을 사용하여 여과하여 살균합니다.
10. 2-8 °C에 보관하십시오.
인슐린 원액(4000 µ g/ml)병을 해동하고 부분 표본 25 µ 마이크로 원심 분리기 튜브 당 l 및 -20°C에서 보관합니다.
라미닌 용액추위에서 라미닌을 천천히 해동합니다(2° C에서 8° C) 젤 대형을 피하기 위하여. 그런 다음 폴리프로필렌 튜브로 분취합니다. 5°C에 저장; C에서 -20° 부분 표본의 C(예: 20 µ l) 반복적으로 얼거나 해동하지 마십시오. 라미닌은 이 온도에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
자기 세포 분류(MCS) 완충액산염 완충 식염수(PBS), pH 7.2 및 0.5% 소 혈청 알부민(BSA), 0.5mM EDTA, 5µ를 포함하는 용액을 준비합니다. g/ml 인슐린, 1g/L 포도당. 살균하고 여과에 의하여 가스를 제거하십시오 완충액은 0.22 µ를 통해서 통과해서 주십시오; m 밀렉스 필터. 버퍼를 4°에 저장합니다.
N-아세틸-L-시스테인(NAC) 원액(5mg/ml, 1000X)을 사용할 때까지 N-아세틸-L-시스테인(Sigma-A8199)을 DMEM(예: 10ml B27NBMA 중 50mg NAC)에 5mg/ml로 용해합니다. 여과기는 살균하고 분취합니다 (예: 20 µ 엘). -20°C에 보관하십시오.
NT3 원액(1 µ g/ml; 1000X)마스터 재고 :
Peprotech (450-03)에서 주문. 제조사에 따라 0.1-1 mg/ml로 메이크업 s 명령어(로트마다 다를 수 있음), 버퍼(예: DPBS + 0.2% BSA). -80°C.

에서 보관 작업 재고(1&마이크로; g/ml; 1000X):
1. DPBS 용액에 0.2% BSA를 넣고 sterilize.
필터를 만듭니다 2. 마스터 스톡 부분 표본을 1 µ로 희석합니다. 멸균, 냉각 0.2% BSA/DPBS.
의 g/ml 3. 부분 표본(예: 20µ l/tube) 및 액체 nitrogen.
에 있는 스냅 동결 4. 부분 표본은 -80°C에서 저장합니다.
PDGF 원액(10 µ g/ml; 1000X)마스터 재고 :
Peprotech (100-13A)에서 주문. 제조사에 따라 0.1-1 mg/ml로 메이크업 s 명령어 (로트마다 다를 수 있음)를 버퍼(예: DPBS) + 0.2% BSA)에 넣습니다. -80°C.

에서 보관 작업 재고(1&마이크로; g/ml; 1000X):
1. DPBS 용액에 0.2% BSA를 넣고 sterilize.
필터를 만듭니다 2. 마스터 스톡 부분 표본을 1µ로 희석합니다. 멸균, 냉각 0.2% BSA/DPBS.
의 g/ml 3. 부분 표본(예: 20µ l/tube) 및 액체 nitrogen.
에 있는 스냅 동결 4. 부분 표본은 -80°C에서 저장합니다.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X)0.15M 붕산 pH 8.4에서 0.5mg/ml로 poly-D-lysine, 분자량 70-150 kD(Sigma P6407)를 재현탁합니다(예: 50ml 붕산염 완충액 내 50mg). 여과기는 살균하고 분취합니다 (예를들면 100µ l/튜브). -20°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 100X 재고(1mg/ml)를 50°마이크로로 희석하십시오. 멸균 된 물에 g / ml.
희소돌기아교세포 증식 배지보충 표 1
희소돌기아교세포 분화 배지보충 표 1
Sato 보충 (100X)참조 보충 표 1
참고문헌: 시약 및 레시피 목록은 이전에 Emery et al. 2013(Emery, B. & Dugas, J. C. 면역 판닝에 의한 마우스 피질에서 희소돌기아교세포 계통 세포의 정제. 콜드 스프링 Harb 프로토콜 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) 및 Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. 피질 마우스 희소돌기아교세포 전구 세포의 분리. J Neurosci 방법. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))
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