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방법 논문

PDGFRα + 셀 낮은 셀 Chromatin Immunoprecipitation 시퀀싱 분석에 의해 정화에 녹음 방송 요인 Olig2 게놈 바인딩 사이트를 심하게 식별

8.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57547

⸱

2018년 4월 16일

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center

이 논문에서

요약

여기에 우리가 현재 낮은 셀 chromatin immunoprecipitation (칩)를 수행 하 여 분석 하는 게놈 넓은의 바인딩을 oligodendrocyte 녹음 방송 요인 2 (Olig2) 심하게 정화 뇌 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs) 하도록 설계 된 프로토콜 도서관 준비, 높은 처리량 시퀀싱 및 bioinformatic 데이터 분석.

초록

포유류 세포에서 유전자 전사 genomic dna transcriptional 요인의 상호 작용에 의해 세포 유형 특정 방식으로 통제 된다. 계보 특정 녹음 방송 요인은 셀 사양 및 분화 개발 과정에 필수적인 역할을 간주 됩니다. 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq)와 결합 하는 칩은 genomic dna 녹음 방송 요인 (또는 그것의 관련 된 복잡 한)의 게놈 넓은 바인딩 사이트를 분석 하 널리 이용 된다. 그러나, 많은 세포는 하나의 표준 칩 반응, 어려운 고립 된 1 차 셀 또는 희귀 세포 인구 제한 수를 공부 하는 필요 합니다. Oligodendrocyte 계보 관련 전사의 규제 메커니즘을 이해 하기 위해서는 요소 Olig2 심하게 순화 마우스 OPCs Olig2 (또는 Olig2 복잡 한)의 게놈 넓은 바인딩 사이트 식별 칩 seq를 사용 하 여 상세한 방법에에서 표시 됩니다. 프로토콜 혈소판 파생 된 성장 인자 수용 체 알파 (PDGFRα)를 정화 하는 방법을 설명 하는 첫째, 긍정적인 OPCs 마우스 두뇌에서. 다음, Olig2 항 체 칩을 중재 하 고 도서관 건설 수행 됩니다. 마지막 부분 bioinformatic 소프트웨어 및 Olig2 칩 seq 분석에 사용 되는 절차에 설명 합니다. 요약 하자면,이 종이 심하게 정화 뇌 OPCs transcriptional 요소 Olig2의 게놈 넓은 바인딩 분석 하는 방법을 보고 합니다.

서론

단백질 (또는 복잡 한 단백질)을 공부 하는 것이 중요 하다 DNA 바인딩 및 후 성적인 부호 다양 한 생물학 과정에서 포함 된 transcriptional 규제 네트워크 구축. 특히, 게놈 dna 녹음 방송 요인의 바인딩 유전자 규칙, 세포 분화와 조직 개발에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 공부는 transcriptional 규칙 및 epigenetic 메커니즘에 대 한 강력한 도구 chromatin immunoprecipitation (칩)입니다. 차세대 시퀀싱 기술에 있는 급속 한 전진 때문 칩 (칩 seq) 연속 높 처리량 DNA와 결합 하 여 단백질-DNA 바인딩 및 epigenetic 마크1의 분석에 사용 됩니다. 그러나, 표준 칩 seq 프로토콜 셀 수는 고립 된 1 차 셀 등 희귀 세포 인구 제한 때이 기술의 응용 프로그램 어려운 반응 당 약 20 백만 셀을 필요 합니다.

Oligodendrocyte 계보 세포 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs)와 oligodendrocytes를 포함 하 여 두뇌를 통해 널리 배포 하 고 개발 및 뇌의 기능에 필수적인. 선구자 세포의 유형으로 OPCs 자체 갱신와 차별화 할 수 있다. OPCs는 창시자 oligodendrocytes에 대 한 역할 뿐만 아니라 또한 뇌 세포2의 다른 종류와 통신 함으로써 신경 신호의 전파에 중요 한 역할. 이전 연구는 oligodendrocyte 개발 Olig2와 Sox103,4같은 계보 특정 녹음 방송 요인에 의해 통제 된다 제안 했다. 이 녹음 방송 요인 oligodendrocyte 사양과 차별화 하는 동안 그들의 표정에 영향을 몇 가지 중요 한 유전자의 발기인 또는 증강 인자 영역에 바인딩할 발견 됐다. 그러나, DNA 바인딩 단백질 (또는 복잡 한 단백질) 심하게 정화 기본 OPCs 셀의 매우 제한 된 수의 식별 하는 도전입니다.

이 프로토콜 Olig2 순화 마우스 OPCs 칩 seq 기술을 사용 하 여 게놈 넓은 규모에 의해 게놈 DNA immunoprecipitated를 체계적으로 조사 하는 방법을 설명 합니다. 마우스 두뇌에서 OPCs 심하게 immunopanning에 의해 정화 되었고 확산 체 외없이 칩 실험에 사용. 제한 된 수의 OPCs immunopanning에 의해 얻어질 수 있다 그리고 표준 칩 seq 실험에 대 한 충분 하지 않습니다. 여기, 낮은 셀 칩 seq 프로토콜은 낮은 녹음 방송 요인에 대 한 칩 반응 당 20 천 셀으로 설명 되어 있습니다. 간단히, 교차 연결 된 셀 lysed 되었고 sonicated 쥡니다 장치는 chromatin를 전단 하 여. 깎인된 chromatin Olig2 바인딩된 항 체 게놈 DNA를 침전 하는 코팅 구슬 Olig2 항 체와 단백질 incubated 했다. 단백질 A 코팅 구슬 및 역방향 cross-linking에서 차입, 후 genomic DNA Olig2 항 체에 의해 시 켰 던 페 놀-클로 프롬 적 출에 의해 순화 되었다. 결과 제품 계량은 T-미행을 복종, 뇌관 어 닐 링 템플릿 전환 및 확장, 어댑터 및 증폭, 라이브러리 크기 선택 및 정화의 추가 칩 seq 도서관 건축을 위한 단계.

시퀀싱, 후 샘플 Olig2 전사 인자 항 체와 준비와 컨트롤 샘플에서 원시 읽기의 품질 분석 했다. 낮은 품질의 기본적인 쌍 어댑터 포함 된 읽기 조각 손질 했다. 다음, 트림 읽기 마우스 참조 게놈에 정렬 했다. 컨트롤 샘플에 비해 칩 읽기 봉우리로 검색을 위한 농축 크게 했다 게놈 영역입니다. 중요 한 봉우리, 대표 하는 잠재적인 전사 인자 바인딩 사이트 필터링 되었고 게놈 브라우저에 시각.

특히,이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 모든 셀 종류 제한 된 숫자의 다른 녹음 방송 요인의 칩 seq에 광범위 하 게 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 사용 및 실험 프로토콜 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드를 따라 수행 되었고 기관 Biosafety 위원회에서 건강 과학 센터 택 사스 대학에서 동물 복지 위원회에 의해 승인 휴스턴입니다.

1. 쥐의 뇌 (앞에서 설명한 immunopanning 프로토콜5,,67에서 수정)에서 PDGFRα 긍정적인 Oligodendrocyte 계보 세포의 정화

  1. PDGFRα 긍정적인 셀 선택 및 microglia 및 내 피 세포의 고갈에 대 한 2 접시는 immunopanning 접시의 준비.
    참고: 제발 note 접시 하지만 하지 셀 문화 요리 immunopanning 실험;에 대 한 작업 순화 된 세포 배양을 위해 사용 될 경우 immunopanning 단계 biosafety 내각에서 실시 해야 합니다.
    1. 10 cm 30 µ L 염소 반대로 쥐 IgG pH 9.5, 4 ° c.에서 하룻밤 50 mM Tris HCl의 10 mL에 페 트리 접시 코트 플레이트 플레이트의 표면은 균등 하 게 그리고 완전히 코팅 솔루션에 의해 보호 되도록 교 반 하십시오.
    2. PDGFRα 항 체 솔루션 diluting 40 µ L 쥐 안티-PDGFRα 항 체의 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 포함 하는 0.2 %BSA 12 mL로 하 여 준비 합니다.
    3. 10 mL와 IgG 코팅 판의 3 세척 후 각, 1 x DPBS IgG 코팅 접시 4 h에 대 한 실 온에서 PDGFRα 항 체 솔루션을 품 어.
    4. 쥐 안티-PDGFRα 항 체 코팅 접시 3 번 10 mL와 함께 1 x DPBS 세척. 부드럽게 접시의 측면 벽을 따라 DPBS 솔루션을 추가 하 고 코팅된 표면을 방해 하지 마십시오.
    5. 2 새로운 15 cm 페 트리 접시 2 h Banderiaea simplicifolia lectin 1 (BSL-1)의 2.3 µ g/mL를 포함 하는 DPBS의 20 mL와 microglia 및 내 피 세포의 고갈 코트.
    6. BSL-1 코팅 세척 접시 3 번 20 mL로 1 x DPBS. 부드럽게 플레이트의 측면 벽을 따라 DPBS 솔루션을 추가 하 고 코팅된 표면을 방해 하지 마십시오.
  2. 이전에 게시 방법6 에서 정화의 PDGFRα 긍정적인 oligodendrocyte 계보 셀 수정 , 7 , 8.
    1. 부 산 후 2에서 대뇌 피 질의 조직 하루 7 (P7) 마우스 머리 이전에 따라 게시 프로토콜5,6.
    2. 자세한 제조 업체의 지침에 따라 신경 조직 분리 키트 (P)와 단일 세포 현 탁 액을 생성 하 조직 분리
    3. 간단히, 해 부 대뇌 피 질의 조직 메스와 조각으로 잘라 하 고 37 ° c.에 효소 소화에 그들을 주제합니다 소화 후 수동으로 화재 광택 유리 단일 셀 서 스 펜 션으로 파스퇴르 펫 조각 해리.
    4. 실 온에서 10 분 동안 300 x g에서 단일 세포 현 탁 액을 원심 및 셀 펠 릿 immunopanning 버퍼의 15 mL를 사용 하 여 일시 중단 (immunopanning 버퍼는 0.02 %BSA 5 µ g/mL 인슐린 DPBS).
    5. Microglia 및 내 피 세포의 더 나은 고갈 되도록 2 BSL-1 코팅 접시 접시 마다 5 분의 부드러운 동요와 함께 실 온에서 15 분 동안에 순차적으로 2 마우스 두뇌에서 단일 세포 현 탁 액을 품 어.
    6. 부드럽게 세포 현 탁 액에는 비 부착 한 세포를 수집 하 여 실 온에서 45 분에 대 한 쥐-PDGFRα 항 체-코팅 접시에 그들을 품 어 접시를 소용돌이 친다.
    7. 쥐-PDGFRα 항 체-코팅 접시에 세포 현 탁 액의 부 화 후 부드럽게 소용돌이 격판덮개 세포 현 탁 액을 수집 하 고 8 번 비 부착 한 세포를 제거 하는 DPBS와 접시를 헹 굴. 부드럽게 세척 접시의 측면 벽을 따라 솔루션을 추가 하 고 여러 번 비 부착 한 세포를 제거 하는 접시를 선동.
    8. 37 ° c.에서 10 분 동안 세포 분리 솔루션 치료의 4 mL를 사용 하 여 쥐-PDGFRα 항 체 코팅 접시에서 세포를 분리 부착 세포를 꺼내 접시를 흔들어.
    9. 실 온에서 300 x g에서 원심 분리 하 여 정제 OPCs 수집, 2 mL OPC 세포 배양 매체와 셀 펠 릿을 일시 중단 하 고 trypan 블루는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 (500 mL 세포 배양 매체 DMEM/F12 매체 5 mL를 포함 하는 페니실린-스 솔루션 (P/S), N2 5 mL, 10 mL B27, 5 µ g/mL 인슐린, 0.1 %BSA, 20 ng/mL bFGF 그리고 10 ng/mL PDGFRα).
  3. Immunopanning 후 OPCs의 순수성의 유효성 검사입니다.
    1. Immunopanning 후 OPCs의 농축을 평가, guanidium 안산으로 RNA 추출 정화 OPCs 중 일부를 사용 하려면 제조업체의 지침에 따라 추출을 기반으로 합니다.
    2. 4이전 발표 한 자료 따르면 해리 뇌 세포에 비해 순화 OPCs에 PDGFRα 식의 농축에 대 한 확인을 형광 녹색 염료 마스터 믹스를 사용 하 여 qRT-PCR을 수행 합니다.
    3. 또한, 씨앗 일부 순화 OPCs는 폴 리-D-리 코팅으로 24 잘 플레이트 안티 NG2 콘 proteoglycan (NG2) 항 체로 immunostaining 이전 출판 자료9.

2. 낮은 셀 칩 준비 및 높은 처리량 시퀀싱 칩 도서관 건축

  1. 상용 쥡니다 시스템 및 상용 낮은 휴대폰 번호 칩 Olig2 낮은 셀 칩 준비 키트 (재료의 표 참조) 제조 업체의 지침에서 자세한 표준 절차에 따라.
    1. 쥐 안티-PDGFRα에서 분리 후 항 체-코팅 판과 trypan 블루와는 hemocytometer 계산 셀 1 mL OPC 세포 배양 매체 각 칩 반응에에서 20000 순화 OPCs을 넣어.
    2. 실 온에서 10 분 동안 세포 현 탁 액을 해결 하기 위해 36.5% 포름알데히드의 27 µ L를 추가 합니다.
      주의: 제발 note는 포 름 알 데히드 화학 증기 두건에서 안전 상의 이유로 사용 해야 합니다.
    3. 실 온에서 5 분 동안 50 µ L 2.5 M 글리신과 DNA-단백질 cross-linking 중지 합니다.
      참고: 모든 단계 얼음에 또는이 시점에서 4 ° C 차가운 방에서 밖으로 실행 되어야 한다.
    4. 칵테일 1 mL의 얼음 처럼 차가운 행 크 스 균형 소금 솔루션 (HBSS) protease 억제제와 함께 상호 연결 된 셀 펠 릿을 세척 하 고 세포에 4 ° c.에 300 x g 사전 냉각된 분리기에 의해 일지도
    5. 25에서 셀 펠 릿을 lyse µ L 얼음에 5 분에 대 한 세포의 용 해 버퍼를 완료.
      참고: 튜브 세포 세포의 용 해 버퍼에서 일시 중지를 교 반 하십시오.
    6. 75 µ L을 포함 하는 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 전단 HBSS 세포 lysate 의해 chromatin 사전 냉각 쥡니다 시스템과 5 주기 30 s 및 30 s OFF 프로그램의 얼음으로 lysate 셀을 보충 한다. 항상 함께 6 튜브를 sonicate 고 균형 튜브 100 µ L 물 포함을 확인 합니다.
    7. 전단, 후 14000 x g 10 분 4 ° C에서 원심와 원심 분리 후 상쾌한 새로운 튜브에서를 수집 합니다.
    8. 얼음 처럼 차가운 완벽 한 칩 버퍼 protease 억제제와의 동등한 양으로 깎인된 chromatin의 100 µ L를 희석.
    9. 입력 컨트롤 샘플으로 희석된 깎인된 chromatin의 20 µ L를 저장 합니다.
      참고: 입력 컨트롤 샘플 Olig2 immunoprecipitated 샘플 Olig2 항 체 immunoprecipitated DNA를 식별 하는 비교로 필요 이기도 합니다.
    10. 토끼 반 olig2 항 체는 희석의 180 µ L의 1 µ L chromatin 전단 및 4 ° c.에 16 h 40 rpm에 회전 바퀴에 반응 관을 품 어 추가
      참고: 차가운 방에이 단계를 수행 합니다.
    11. 각 칩 반응에 대 한 세척 11 µ L 자기 단백질 A 코팅 구슬 55 µ L와 구슬 워시 버퍼와 넣어 구슬 2 세척 후 비드 워시 버퍼의 11 µ L에 작은.
      참고: 차가운 방에이 단계를 수행 합니다.
    12. 각 칩 반응에 대 한 칩 반응 관에 미리 씻어 단백질 A 코팅 구슬의 10 µ L를 추가 합니다. 콜드 룸에서이 단계를 수행 합니다.
    13. 칩 반응 관 회전 바퀴에 다른 2 h 4 ° C에서 품 어.
    14. 칩 반응 관 1 분에 대 한 자석 선반에 넣어.
      참고: 차가운 방에이 단계를 수행 합니다.
    15. 제거는 상쾌한 고 비드 펠 릿을 꺼내 하지 마십시오.
    16. 4 ° c.에 회전 바퀴에 4 분 동안 각각 4 워시 버퍼의 각 100 µ L로 비드 펠 릿을 세척
    17. 세척, 후 비드 펠 렛을 차입 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 상호 연결 단백질-DNA를 4 h 65 ° C에서 칩 반응 관을 품 어.
    18. 또한, 20 µ L 입력 컨트롤 샘플을 차입 버퍼의 180 µ L을 추가 하 고 상호 연결 단백질-DNA 뿐만 아니라 반대로 4 h 65 ° C에서 품 어.
    19. 각 칩 반응 관에 페 놀, 클로 프롬, 및 isoamyl 알콜의 200 µ L 25:24:1 (v/v) 혼합을 추가 합니다.
    20. 1 분을 실 온에서 15 분 13000 x g에서 원심 분리기 적극적으로 소용돌이. 새로운 튜브를 이동 위 단계입니다.
    21. 40 µ L 3 M 나트륨 아세테이트 솔루션, 100% 에탄올의 1000 µ L, 2 µ L glycogen precipitant의 covalently 하룻밤-20 ° c.에 각 칩 반응 관에 파란 염료에 연결 추가
    22. 4 ° c.에 20 분 13000 x g에서 원심 분리기
    23. 삭제는 상쾌한, 500 µ L 찬 70% 에탄올으로 씻어 및 4 ° c.에 20 분 13000 x g에서 원심
    24. 삭제는 상쾌한, 펠 릿 공기를 10 분 동안 건조 유지 하 고 50 µ L 물 펠 릿을 녹.
  2. 높은 처리량 시퀀싱 칩 도서관 건축
    1. 깨끗 하 고 제조업체의 지침에 따라 청소 키트 칩 DNA를 집중.
    2. 제조업체의 지침에 따라 피코 그린 칩 샘플을 계량.
    3. 칩 seq 키트를 사용 하 여 T-미행, 복제와 미행, 템플릿 전환 및 확장, 어댑터 및 증폭, 라이브러리 크기 선택 및 제조업체의 지침에 따라 정화의 추가.
      1. DsDNA의 변성, 후 새우 알칼리 성 인산 가수분해 효소에 의해 ssDNA의 3' 끝을 dephosphorylate 하 고 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소에 의해 폴 리 (T) 꼬리는 ssDNA를 추가 합니다.
      2. DNA 복제 및 템플릿 전환 ssDNA 서식 파일 DNA 폴 리 (다) 뇌관 anneal
      3. 서식 파일 전환, 후 인덱싱에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관으로 PCR에 의해 칩 seq 라이브러리를 증폭.
      4. PCR 증폭 칩 seq 도서관 파편 250에서 500까지 선택 옵션 2 두 배 크기 선택 하 여 상자성 구슬에 의해 혈압.
      5. 미세 칩-모 세관 전기 영동 장치를 사용 하 여 선택한 칩 seq 라이브러리의 품질을 검사 합니다.

3. 데이터 분석

  1. 디렉터리 구조를 준비 합니다.
    1. 칩 seq 데이터 분석을 수행 하기 위한 디렉터리를 만듭니다. 새로 만든 디렉터리 다음 이름으로 6 개의 하위 디렉터리 만들기: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis, 및 보고서.
  2. 데이터를 준비 하 고 원시 시퀀스 데이터의 품질 관리 분석을 수행.
    1. "Raw.files" 디렉터리에 이동한 칩 seq 데이터 파일을 다운로드 합니다.
    2. 파일 이름을 확인 합니다. 시퀀싱 쌍 간 경우, 비슷한 기본 이름 가진 4 개의 파일 (치료를 위해 2)와 두 개의 입력에 대 한 될 것입니다: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq, 및 PDGFRα_input.read2.fastq. 파일 이름이 서로 다른 경우, "mv" 명령을 사용 하 여 그들의 이름을 바꿉니다.
    3. "Fastqc.output" 디렉토리를 이동 합니다.
    4. Fastq 파일 품질 관리 소프트웨어10를 사용 하 여 원시 읽기에서 품질 관리 통계를 가져옵니다. 그림 S1A 에서 명령을 사용 하 여 별도로 각 fastq 파일에 대 한 품질 관리 프로세스를 실행. 소프트웨어는 html 파일에서 여러 품질 관리 통계를 표시 합니다.
    5. Html 품질 관리 파일을 열고 읽기, 수 확인 기준 시퀀스 품질, 시퀀스 품질 평가 점수, 시퀀스 GC 내용, 시퀀스 중복 수준, 어댑터 콘텐츠 및 kmer 콘텐츠 당 당 길이 읽기.
  3. 후행 고품질 읽기 및 어댑터 콘텐츠 트림.
    1. "당 기준 시퀀스 품질"과 "어댑터 콘텐츠" 플롯을 관찰 합니다. 머리와 꼬리 각 읽기의 트리밍 길이 결정 합니다. 트리밍에 대 한 적절 한 길이 기본 품질 30 미만으로 떨어지면 어댑터 콘텐츠의 증거가 있다.
    2. "Raw.files" 디렉토리를 이동 합니다.
    3. 다운로드 및 트리밍 읽기11용 소프트웨어 설치. 그림 S1B 명령을 사용 하 여 별도로 치료와 입력을 트리밍에 대 한. 트리밍 끝에서 기지 고 읽기의 시작에서 제거 되어야 하는 기지의 수를 지정 하는 'HEADCROP' 매개 변수 '자르기' 나머지 읽기 길이 나타냅니다.
    4. 트리밍 명령을 읽기 'MINLEN' 매개 변수에서 필터링 후 허용 길이 최소 포함 됩니다. 읽기는 적어도 50 경우 읽기 길이 임계값으로 사용 35 bp, bp.
    5. "Fastqc.output" 디렉토리를 이동 합니다.
    6. 읽기 트리밍 후 fastq 파일 품질 관리 분석을 수행 합니다. 품질 관리 문제가 해결 되었는지 확인 합니다. 그림 S1C 명령을 사용 하 여 품질 관리 삼습니다.
  4. 마우스 참조 게놈을 단일 엔드 또는 쌍-엔드 칩 seq 읽기를 맞춥니다.
    1. 매핑에 대 한 "bowtie.output" 디렉토리를 이동 합니다.
    2. 다운로드 GENCODE mm10 마우스 참조 게놈. "Mm10.fa"로 mm10 마우스 참조 게놈을 이름을 바꿉니다.
    3. 읽기 매퍼12 다운로드 하 고 시스템에 설치 합니다.
    4. 그림 S2A에 명령을 사용 하 여 다운로드 참조 게놈의 인덱스 파일을 만듭니다. 6 개의 파일이 자동으로 만들어집니다: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2, 및 mm10.rev.2.bt2.
    5. 명령을 사용 하 여 그림 S2B 에 맞춤을 실행 하 고 매개 변수 조정 "-p" 시스템 설정에 따라 프로세싱 코어의 수를. 짝-엔드 모드를 실행 하는 경우 매개 변수 "-1"과 "-2" 트림된 fastq 파일의 이름을 나타냅니다.
      참고: 매핑을 수행 되 별도로 치료 및 입력 샘플에 대 한 고 출력 통계 로그 파일은 각 샘플에 대 한 만들어집니다.
    6. 샘 형식13 파일을 조작 하기 위한 소프트웨어를 다운로드 하 고 시스템에 설치 합니다. 그림 S2C명령을 사용 하 여 BAM 파일에 정렬된 하는 SAM 파일을 변환 합니다.
  5. 최대 두 쌍-엔드 치료 및 제어 샘플에 대 한 호출 전에 매핑된 읽기의 품질 관리 통계를 가져옵니다.
    1. 주소에 가장 중요 한 품질 관리 통계 중 하나 시퀀싱 깊이입니다. 파일 "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" 및 "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" bowtie.output 디렉터리에서 열고 각 샘플에서 고유 하 게 매핑된 읽기 쌍 수 10 백만 이상 인지 확인 합니다.
    2. "Homer.output" 디렉토리를 이동 합니다.
    3. 주제 발견과 차세대 시퀀싱 분석14 에 대 한 소프트웨어를 다운로드 하 고 시스템에 설치 합니다.
    4. "TagDir" 라는 디렉터리를 만듭니다.
    5. 태그 clonality를 확인 하려면 그림 S3A에 묘사 된 명령을 사용 합니다. 4 품질 관리 출력 files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt, 및 tagLengthDistribution.txt "makeTagDirectory" 명령을 생성 합니다.
    6. "TagDir" 디렉토리를 이동 합니다.
    7. "보고서" 디렉토리에 "tagCountDistribution.txt" 파일을 복사 합니다.
    8. "보고서" 디렉터리로 이동 합니다.
    9. 스프레드시트 프로그램을 사용 하 여 tagCountDistribution.txt 파일을 열고 바 만들 genomic 위치 당 태그의 수 작. 히스토그램 파일 이름 "tag.clonality.xlsx"로 저장 합니다.
    10. R 프로그래밍 언어15 시스템을 설치 합니다.
    11. 터미널에서 'R'을 입력 하 고 enter 키를 눌러 R 프로그래밍 환경에 액세스 합니다.
    12. 칩 seq 데이터16 을 처리 하기 위한 R 패키지를 다운로드 하 고 그림 S3B표시 명령을 사용 하 여 그것을 설치.
    13. 스트랜드 간 상관 관계를 그림 S3C 에서 R 스크립트를 사용 합니다.
  6. 봉우리는 피크 매퍼를 사용 하 여 탐지 합니다.
    1. "Macs2.output" 디렉토리를 이동 합니다. 다운로드 하 고 당신의 시스템에서 피크 매퍼17 를 설치.
    2. 치료와 기능 "callpeak"를 사용 하 고 단계 3.4.6에서에서 생성 된 BAM 파일 제어.
      참고: 다른 매개 변수를 포함 "-f" 입력된 파일 형식에 대 한 "-g" 게놈 크기에 대 한 "-이름" 나타내는 모든 출력 파일의 기본 이름 및 "-B" 조각 탑 쌓기 bedgraph 형식으로 저장 하기 위한. 명령을 호출 하는 완전 한 피크 그림 S4A에 포함 됩니다. BEDPE를 사용 하 여 쌍 간 샘플에 대 한.
    3. 피크 매퍼 6 파일 생성 확인 합니다: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg, 그리고 PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg입니다.
    4. 파일 열기 라는 봉우리, 위치, 길이, 정상 위치, 탑 쌓기, 그리고 피크 농축 통계를 볼 수 PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls:-log10(pvalue), 배 농축, 그리고-log10(q-value).
  7. 필터 및 주석을 라는 봉우리.
    1. 이전 단계에서 열린 파일을 사용 하 여, 배 농축, p-값 및 q 값에 따라 결과 봉우리 필터링. 적절 한 필터링 임계값 결정, 각 통계의 밀도 결정 하기 위해 히스토그램 플롯을 확인 합니다. 중요 한 봉우리를 선택한 임계값 값을 필터링.
    2. (영역을 인위적으로 높은 신호를가지고 알려져 있습니다) mm10 블랙 리스트를 다운로드 하 고 칩 seq 밖으로 필터는 그 유물 지역의 내부는 봉우리.
    3. 다음 열을 포함 하는 필터링 된 봉우리 침대 파일 만들기: 염색체, 시작, 끝, peakID, 모의 그리고 물가. 점이 모의 열 채우기 "." 때문에 사용 되지 않습니다. 스트랜드 열에서 모든 값을 설정 "+". "Filtered.peakData2.bed"로 침대 파일을 저장 합니다.
    4. "보고서" 디렉토리에 "filtered.peakData2.bed" 파일을 복사 합니다.
    5. "보고서" 디렉터리로 이동 합니다.
    6. 특정 유전자 영역에 필터링 된 봉우리 주석을 이전 단계에서 만든 침대 파일 "annotatePeaks" 함수를 사용 합니다. 사용 되는 명령어는 그림 S5A에 표시 됩니다.
    7. 통계 소프트웨어를 사용 하 여 "filtered.annotatedPeaks.txt" 파일을 엽니다.
    8. 필터링 결과 봉우리는 주석된 TSS에서 5 kb 보다 큰 거리에 intergenic 지역에 누워. 필터링 때 파일 "TSS에 거리" 열 거리로 사용 합니다. 필터링 된 봉우리 "5kbup.geneBody.peakData.txt" 라는 excel 파일에 저장 합니다.
    9. 그 결과 저장소 필터링 열 bedGraph 파일에서 봉우리: 염색체, 시작, 끝, 및-log10(q-value). "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph" 파일을 이름을 지정 합니다.
  8. 브라우저 시각화에 대 한 중요 파일을 생성 합니다.
    1. 다운로드 및 게놈 산술18에 대 한 소프트웨어를 설치.
    2. 중요 bedgraph 변환 도구를 다운로드 하 고 시스템에 설치. 'Mm10.chrom.sizes' 파일을 다운로드 합니다.
    3. 그림 S6A 명령을 사용 하 여 중요 파일을 생성.
    4. 다운로드 하 고 설치는 게놈 브라우저19 시스템.
    5. 게놈 브라우저를 열고 필터링 된 중요 한 봉우리와 알려진된 유전자에 관하여 그들의 위치를 시각화 하기 위해 "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" 파일을 로드 합니다.
  9. 주제 검색입니다.
    1. "Motif.analysis" 디렉토리를 이동 합니다.
    2. 스캔 드 노 보 모티프와 모티브 농축 프로그램을 다운로드 하 고 당신의 시스템20에 그것을 설치.
    3. Olig2의 모티프를 포함 하는 포괄적인 모티프 데이터베이스를 다운로드 합니다.
    4. 500 bp 지역 상당한 피크 정상에서 중심으로의 게놈 시퀀스를 가져옵니다. Peak.sequences.txt으로 시퀀스를 저장 합니다. 그림 S7 명령을 사용 하 여 각 500 bp 피크 영역의 Olig2 모티프에 대 한 검색.
    5. 적절 한 전자-값을 사용 하 여 결과 모티브 필터링 (기본값 = 0.05).

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결과

낮은 셀 칩 seq 수행한 고 bioinformatic 분석 심하게 정화 뇌 OPCs genomic dna Olig2 transcriptional 요소의 잠재적인 상호 작용을 조사 했다. 그림 1 실험 및 데이터 분석 절차의 일반적인 워크플로 보여 줍니다. 이 프로토콜에서 출생 후 쥐 두뇌 했다 단일 세포 현 탁 액에 해리 했다. 조직 분리 후 immunopanning PDGFRα 항 체를 사용 하 여 OPCs 정화 수행 되었다. 그림 2 는 PDGFRα, 신경 마커 Tuj1의 작은 식의 중요 한 농축 (신경 관련 클래스 III 베타-tubulin), 사이토 마커 GFAP (폐해 fibrillary 산 성 단백질), microglia 마커 이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 1 (Iba1), myelinating 성숙 oligodendrocytes 마커 myelin 기...

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토론

포유류 유전자 조절 네트워크는 매우 복잡 합니다. 칩 seq 게놈 넓은 단백질 DNA 상호 작용을 조사 하는 강력한 방법입니다. 이 프로토콜 Olig2 칩 seq (반응 당 20 천 셀 낮은) 마우스 두뇌에서 순화 OPCs의 낮은 수를 사용 하 여 수행 하는 방법을 포함 합니다. 이 프로토콜에 대 한 첫 번째 주요 단계에서 PDGFRα 항 체와 immunopanning에 의해 마우스 두뇌 OPCs의 정화 이다. PDGFRα 코팅 접시 OPCs의 긍정적인 선택 OPCs는 PDGFRα에 수시로 약하게 바인딩 코팅 판. 여러 세척 후에 여전히 일부 비 부착 한 세포 왼쪽 있습니다. 그것은 현미경으로 세척 후 각 D-PBS는 비 부착 한 세포를 확인 하는 것이 중요입니다. 더 D-PBS 세척 비 부착 한 세포의 수를 줄이기 위해 도움이 되지 않습니다, 그것은 초과 세척 수 첨부 OPCs 꺼내 고 정화 세포의 수확량 감소 이후 선택한 셀을 수집 하는 시간. 그러나, 부족 한 세척 다른 뇌 세포 종류의 오염 될 수 있습니다. 따라서, 모든...

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공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

JQW, XD, RCDD, 그리고 YY는 국립 연구소의 건강 R01 NS088353;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 NIH 그랜트 1R21AR071583-01; Staman Ogilvie 기금-기념 헤르만 재단; UTHealth 뇌 이니셔티브와 CTSA UL1 TR000371; 그리고 텍사스 시스템 신경 과학 대학 Neurotechnology 연구소 (부여 #362469)에서 부여.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Reagent/ Equipment
Banderiaea simplicifolia lectin 1Vector Laboratories# L-1100
Rat anti-PDGFRa 항체BD Bioscience# 558774
Neural tissue dissociation Kit (P)MACS Miltenyi Biotec# 130-092-628
AccutaseSTEMCELL technologies# 07920
TRIzolThermo Fisher# 15596026
Anti-NG2 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 항체Millipore# AB5320
Bioruptor Pico 초음파 처리 장치Diagenode# B01060001
True MicroChIP 키트Diagenode# C01010130
페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 (25:24:1, V/V)Thermo Fisher# 15593031
NucleoSpin 젤 및 PCR 클린업 키트MACHEREY-NAGEL# 740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트Thermo Fisher# P11496
DNA SMART ChIP-Seq 키트Clontech Laboratories# 634865
Agencourt AMPure XPBeckman Voulter# A63880
GlycoBlueThermo Fisher# AM9516
피코-그린써모 피셔# P11496
D-PBS써모 피셔# 14190-144
SYBR 그린 마스터 믹스Bio-Rad Laboratories# 1725124
DMEM/F12Fisher Scientific# 11-320-033
페니실린-스트렙토마이신(P/S)피셔 사이언티픽# 15140122
N-2 보충제Fisher Scientific# 17502048
B-27 보충제Fisher Scientific# 17504044
인슐린Sigma# I66345 mg 인슐린을 10 ml의 물과 50 &mu에 용해시켜 0.5 mg/ml 인슐린 용액을 준비합니다. 1 N HCl의 l.
세포 배양에 적합한 소 혈청 알부민(BSA)Sigma# A4161100ml D-PBS에 BSA 4g을 용해하여 4% BSA 용액을 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다.
섬유아세포 성장 인자 염기성 단백질, 인간 재조합(bFGF)EMD Millipore# GF003
HUMAN PDGF-AAVWR# 102061-188
폴리-D-라이신VWR# IC15017510물 10ml에 폴리-D-라이신 10mg을 녹여 1mg/ml 폴리-D-라이신 용액을 준비하고 사용 시 100회 희석합니다.
Falcon 일회용 페트리 접시, 멸균, 코닝, 100x15mmVWR# 25373-100
Falcon 일회용 페트리 접시, 멸균, 코닝, 150x15mmVWR# 25373-187
HBSS, 10X, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 없음 RedFisher Scientific# 14185-052
Trypan BlueStemcell Technologies# 07050
프로테아제 억제제 칵테일Sigma# 11697498001
Software
FastQC[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/원시 및 트리밍 판독의 품질 관리 메트릭 획득
Trimmomatic 0.33[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic원시 판독
트리밍 및 필터링GENCODE mm10ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz마우스 참조 게놈
Bowtie2 2.2.4[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml참조 게놈
SAMTools 1.513] http://samtools.sourceforge.net/SAM 파일을 BAM 형식으로 변환
HOMER 4.9.1[14] http://homer.ucsd.edu/homer/태그 디렉토리 생성 및 유전자 기호로 농축된 게놈 영역 주석
R 3.2.2[15] https://www.R-project.org/프로그래밍 스크립트 및 함수 실행
SPP 1.13[16] https://github.com/hms-dbmi/spp가닥 교차 상관 플롯 생성
MACS2 2.2.4[17] https://github.com/taoliu/MACS대조군
BEDTools 2.25[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/게놈 산술
bedGraphToBigWighttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/베드그래프 파일을 bigwig
IGV 브라우저 2.3.5819] http://software.broadinstitute.org/software/igv/시각화 및 브라우징 유의미한 ChIP-seq 피크
Microsoft ExcelSpreasheet 프로그램
ENCODE의 블랙리스트https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists필터링 피크
mm10.chrom.sizeshttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.bedGraph 파일을 bigwig
ENCODE의 모티프 데이터베이스[25]로 변환 http://compbio.mit.edu/encode-motifs/모티프 농축
MEME-ChIP[20] http://meme-suite.org/index.html
qPCRPrimer 이름>qPCR>
Mbp-F:CTATAAATCGGCTCACAAGG
Mbp-R:AGGCGGTTATATTAAGAAGC
Iba1-F:ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R:GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC
Mog-F:GGCTTCTTGGAGGGAC
Mog-R에사용되는 TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-FATGACATCAAGAAGGTGGTG
GAPDH-RCATACCAGGAAATGAGCTTG
Tuj1-FTTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-RGATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFRα-FAGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-RGTCCCTCCACG전술
에 읽기를 정렬[로 변환 [에 필요한 종합 모티프 데이터베이스

참고문헌

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