Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

요약

미세한 생물의 게놈 시퀀싱 하는 동안 오염에는 큰 문제가 남아 있다. 여기, 우리가 오염 위험을 최소화 하기 위해 전체 게놈 증폭 없이 genomic DNA의 작은 50 세와 단일 표본에서 tardigrade의 게놈을 시퀀싱 하는 방법을 보여줍니다.

초록

Tardigrades는 ametabolic 상태가 물 제공 이라고 anhydrobiosis 건조 및 수를 직면 하는 때 그들의 원래 상태로 돌아가기 현미경 동물 이다. Tardigrades 위험 세균 오염 때로는 같은 미세한 동물의 게놈 시퀀싱이이 동물에서 수평 한 유전자 이동의 범위에 관한 예를 들어 잘못 된 해석에 지도 한다. 여기, 우리는 하나의 견본에서 tardigrade, Hypsibius dujardini의 게놈을 시퀀싱 하는 ultralow 입력된 방법을 제공 합니다. 50의 효율적인 추출 함께 엄격한 세척 및 오염 물질 제외를 채용 하 여 ~ 한 개인에서 200 pg genomic DNA, 우리 건설 DNA 시퀀싱 장비 시퀀싱 라이브러리. 이러한 라이브러리 높은 재현성 및 편견, 그리고 다른 H. dujardini 유전자와 시퀀스 읽기의 정보학 분석 오염의 최소한의 금액을 보여주었다. 이 메서드는 이전 방법을 사용 하 여 시퀀싱 할 하지 unculturable tardigrades을 적용할 수 있습니다.

서론

Tardigrades는 건조를 직면 하는 때 anhydrobiosis를 호출 하는 ametabolic 상태를 입력할 수 있는 미세한 동물 이다. 그들은 물^1,2의 흡수에 의해 복구. Tardigrades는 ametabolic 상태에서 다양 한 극한 환경 극한의 온도 압력^{3 4,5}, 자외선 빛⁶, x-레이, 그리고 감마선의 높은 복용량을 포함 하는 견 뎌 할 수 있다 ^{7 , 8}, 그리고 우주 공간⁹. 게놈 데이터는 anhydrobiosis의 분자 메커니즘의 연구에 대 한 필수적인 기초.

Tardigrades의 게놈을 시퀀싱 하는 이전 시도 세균 오염^{10,11,12,,1314}의 흔적으로 나타났습니다. 같은 작은 유기 체에서 게놈 시퀀싱 동물의 많은 수를 요구 하 고 세균 오염; 하는 경향이 따라서, 우리는 오염¹⁵의 위험을 최소화 하기 위해 tardigrade, 단일 표본에서 시작 하는 ultralow 입력된 메서드를 사용 하 여 연속 프로토콜을 설치 이전 했다. 이러한 데이터를 사용 하 여 높은-품질 resequencing 및 리어셈블리 H. dujardini^16,17의 게놈의 더 실시는 우리. 여기 우리가 자세하게에서 게놈 시퀀싱 한 tardigrade 개인 (그림 1에서이 방법을 설명). 이 시퀀싱 방법의 유효성 검사는이 문서의 초점을 넘어 이며 우리의 이전 보고서¹⁶이미 철저 하 게 논의 했다.

이 메서드는 두 부분으로 구성: 단일 tardigrade 오염 가능한 낮은와 DNA 그림 수준의 높은 품질 추출의 분리. tardigrade 굶 어 하 고 항생제로 서 물, 철저 하 게 씻어 서 이며 어떤 세균 오염 든 지의 제거를 보장 하기 위해 500 X 확대와 함께 현미경 관찰. 이전 견적 및 측정 tardigrade의 단일 개인 게놈 DNA¹⁶, freeze-thaw 주기 또는 수동 균질 키 틴 질 외 골격을 크래킹에 의해 추출 되는 약 50-200 pg 포함 되어 있음을 표시 합니다. 이 게놈 DNA 도서관 건설에 제출 하 고 DNA 시퀀싱 장비에서 시퀀스. 추가 정보 분석 고급 시퀀싱, 뿐만 아니라 오염 이전 tardigrade 시퀀싱 프로젝트에 비해 낮은 수준으로 표시 됩니다.

프로토콜

1입니다. 준비

1. 2 %agarose 젤 90 m m 플라스틱 문화 접시, 그리고 1% 페니실린/스 DW와 칵테일의 10 mL에 용 매로 증류수 (DW)를 사용 하 여 준비 합니다. 젤 18 ° c.에 설정 하는 인큐베이터에 2-3 주 동안 저장 될 수 있다
   참고: 낮은 온도 agarose 젤, 젤과는 tardigrades 갇혀 있을 수 있는 문화 접시 벽 사이의 소문자 간격의 결과로 축소에 대 한 10 ° c, 젤의 어떤 저장을 하지 마십시오.

2. 샘플 준비 및 오염 물질 배제

1. 단일 tardigrade 수집 하 고, 준비 한 접시에 그것을 배치 하 고 그것을 씻어 x-모든 나머지 입자를 제거 하는 DW와 함께 3 x 2.
2. 창 자에서 어떤 과잉 음식 든 지 제거를 24 h에 대 한 18-22 ° C에서 tardigrade 품 어.
3. 2-6 h P10 피 펫을 사용 하 여 깨끗 한 슬라이드 유리에 소독된 동물을 어떤 세균 오염 제거에 대 한 페니실린/스 항생제에 굶주린된 tardigrade를 놓습니다.
4. 500 X 확대 현미경 tardigrade 관찰 하 고 나머지 박테리아 없음 확인.
   참고:는 stereomicroscope와 높은 확대 최적입니다, 하지만 광학 현미경 또는 coverslip를 적용 하지 않고 사용할 수 있습니다.
5. 액체의 5 µ L의 최대 P10 피 펫을 사용 하 여 개인을 수집 하 고 낮은 바인딩 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브에 배치 가능한 훨씬 초과 액체 제거.
   참고: microtubes, PCR 튜브, 그리고 피 펫 팁 모두 이어야 한다 DNA의 손실을 최소화 하기 위해 낮은 바인딩.
   참고: 빠른 건조에 대 한 균질 화 되도록 빨리 실시 또는 동물의 죽음 크게 게놈 DNA를 손상 시킬 수 있습니다.

3. 균질 및 DNA 추출

1. 다음 방법 중 하나를 그것의 게놈 DNA (gDNA)를 얻기 위해 동물을 균질.
   참고: 다른 키트 (열과 구슬 기반)이 매우 낮은 입력에서 유효 하지 않습니다에 대 한 다음 DNA 추출 단계에서 재료의 테이블에 에서 표시 된 지정 된 키트를 사용 하 여 중요 한 이다. 게놈 세포의 용 해 버퍼 사용 하기 0.5% 베타-mercaptoethanol 전에 공급 되어 있다.
   1. 그리고 freeze-thaw 주기¹⁸와 동물 균질
      1. 바로 다음 단계 2.5, 포함 하는 tardigrade PCR 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다.
      2. 37 ° c 예 열 열 블록 이동 10 분, 10 분, 액체 질소에 PCR 튜브를 배치 2 x이이 단계를 반복 합니다.
         참고: 균질 충분 하지 않습니다 또는 수동 분쇄 후 수행할 수 있는 경우이 단계를 반복할 수 있습니다.
   2. 수동으로 동물 호감.
      1. 바로 다음 단계는 stereomicroscope에서 2.5, PCR 튜브 벽에 동물을 눌러 피펫으로 P10 팁 개인을 분쇄 하 고 즉시 100 µ L의 세포의 용 해 버퍼를 추가.
         참고:이 tardigrade 수 쉽게 빠져나가, 비효율적인 분쇄 gDNA를 추출 실패 귀 착될 것 이다 때문에이 절차는 stereomicroscope 아래를 관찰 하는 중요 한. 세포의 용 해 버퍼는 유기 체에 침투 수 있도록 tardigrade 표 피 손상 되었는지 확인 합니다.
2. 발생 하는 세포에 대 한 실 온에서 30 분 동안 튜브를 품 어.
   참고: 30 분의 최소 필요 효율적인 세포에 대 한 하지만 부 화 긴 될 수 있습니다.
3. 깨끗 한 1.5 mL 낮은 바인딩 microtube 세포 혼합물의 완전 한 볼륨 (100 µ L)를 전송.
4. 균질을 위해 사용 되었다 며 지금 비어, 낮은 바인딩 PCR 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L을 추가 하 고 단계 3.3에서에서 사용 하는 1.5 mL 낮은 바인딩 microtube 전송에 pipetting 혼합물, 후. 2 x이이 단계를 반복 합니다.
5. 3.4 단계에서 낮은 바인딩 PCR 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 300 µ L을 추가 하 고 혼합물 1.5 mL 낮은 바인딩 microtube 이동 pipetting, 후. 1.5 mL 낮은 바인딩 microtube이이 단계 후에 혼합물의 600 µ L를 포함 해야 합니다.
   참고:이 단계는 샘플을 여러 번 세척 하 여 PCR 튜브 벽에 바인딩된 gDNA의 손실을 극소화 하는.
6. 컬렉션 튜브에 배치 스핀 열 세포 혼합물의 600 µ L의 총을 추가 하 고 1 분 x 10000 g에서 원심.
7. 다시 열을 통해 흐름을 적용 하 고 1 분 x 10000 g에서 원심.
   참고:이 단계는 되도록 중요 한 대부분은 gDNA의 열에 바인딩됩니다.
8. 스핀 열 워시 버퍼의 500 µ L을 추가 하 고 깨끗 한 1.5 mL microtube 스핀 십 분 전송에 대 한 10000 x g에서 원심.
9. 10 mm Tris HCl, pH 8.5, 스핀 열, 5 분 대기를 실 온에서 20 µ L을 적용 하 고 1 분 동안 10000 x g에서 원심.
   참고: 차입 버퍼 라이브러리 준비 효소와 방해에 대 한, EDTA를 포함 해야 합니다 하지.
10. 다시 실 온에서 외피의 5 분 후 스핀 열을 통해 흐름을 적용, 10000 x g에서 1 분 동안 원심.
    참고:이 단계는 열에 바인딩된 gDNA의 최대 차입을 보장 하기 위해 중요 한.

4. 도서관 건설 순서

1. DNA 파편
   1. DNA 파편에 대 한 15 µ L microtube gDNA eluant의 15 µ L를 전송 하 고 탁상 microcentrifuge를 사용 하 여 1 분 동안 튜브 원심.
      참고: 테이블의 자료 에 표시 된 지정된 microtube 낮은 입력에 대 한 최적입니다. 낮은 볼륨 쥡니다와 조각화는 중요 한, 그리고이 효소 조각화 DNA의 매우 낮은 농도 때문에 대체 될 수 없습니다.
   2. 550에 gDNA를 조각 혈압.
      참고: 550 bp 설정 사용은 다음과 같습니다: 피크 사고 전원 30 W, 듀티 계수 = = 20%, 버스트 사이클 = 50, 처리 시간 = 23 s.
   3. 철저 한 pipetting 후 깨끗 한 낮은 바인딩 PCR 튜브에 조각난된 DNA 혼합물의 10 µ L을 전송.
      참고: 실험 여기 중지 될 수 있습니다. 4 ° C 또는-20 ° c.에 DNA를 보존
2. 라이브러리 건설 순서
   참고: 그것은 절대적으로 중요 한 테이블의 자료 입력된 DNA의 낮은 금액으로 인해 다음 절차에에서 지정 된 키트를 사용 하 여.
   1. 서식 파일 준비 버퍼의 2 µ L 및 템플릿 준비 효소의 1 µ L을 추가 하 고는 피 펫 철저 하 게 그들을 믹스.
   2. 다음 조건 열 cycler에 서식 파일 준비 반응을 수행: 25 분, 20 분, 4 ° C 보류, 그리고 101-105 ° c.에가 열된 뚜껑에 대 한 55 ° C 22 ° C 반응이 완료 되 면 다음 단계를 진행 합니다.
   3. 서식 파일 준비 반응 제품에 라이브러리 합성 버퍼의 1 µ L 및 라이브러리 합성 효소의 1 µ L을 추가 하 고 (4 ° C 보류)와 40 분 동안 22 ° C에 혼합물을 품 어. 반응이 완료 되 면 다음 단계를 진행 합니다.
   4. 라이브러리 증폭 마스터 믹스 (라이브러리 증폭 버퍼의 25 µ L, 라이브러리 증폭 효소의 1 µ L 및 nuclease 무료 물 4 µ L)의 30 µ L의 인덱싱 시 약 5 µ L를 추가 합니다.
   5. 피 펫으로 모든 것을 철저 하 게 혼합 하 고 탁상 원심 분리기와 혼합물을 간단히 원심.
   6. 표 1에서 제시 하는 조건으로 PCR을 수행 합니다.

온도	시간	사이클
72 ˚C	3 분
85 ˚C	2 분
98 ˚C	2 분
98 ˚C	20 초	4 사이클
67 ˚C	20 초
72 ˚C	40 초
98 ˚C	20 초	16 주기
72 ˚C	50 초
4 ˚C	보류

표 1: PCR 조건입니다.

3. PCR 제품의 정화
   참고:이 단계는 다른 정화 방법과 교체하실 수 있습니다. 다른 방법을 사용 하는 경우는 분 광 광도 계를 사용 하 여 결과 DNA의 순도를 확인 해야 합니다. 흡 광도 비율 260/280와 260/230 둘 다 1.8 이상 이어야 합니다.
   1. 마그네틱 구슬의 50 µ L을 추가, 플라스틱 솔루션 10 x, 탁상 microcentrifuge와 함께 간단히 원심 및.
   2. 실 온에서 2 분에 대 한 솔루션을 품 어.
   3. 5 분 동안 마그네틱 스탠드에 품 어 또는 솔루션을 완전히 될 때까지 취소, 제거는 상쾌한.
   4. 자석 스탠드에 낮은 바인딩 PCR 튜브에 갓된 80% 에탄올의 200 µ L를 추가, 30 s 및 제거는 상쾌한 대기. 2 x이이 단계를 반복 합니다. 비즈를 방해 하지 마십시오.
   5. 짧게 탁상 원심 분리기와 낮은 바인딩 PCR 튜브 원심 고 마그네틱 스탠드에 어떤 과잉 에탄올을 제거 합니다. 구슬 건조 하지만 overdrying을 피하십시오.
   6. 15 µ L 10 mm Tris HCl, pH 8.5와 구슬 resuspend, 철저 하 게 자기 구슬 균질 분산 되도록 솔루션을 플라스틱, 실내 온도에, 그리고 간단한 원심 분리 후 2 분 동안 튜브를 품 어, 2 마그네틱 스탠드에 품 어 솔루션까지 분은 분명 하다.
      참고: 차입 버퍼 없어야 EDTA, 시퀀싱 화학으로 대 합니다.
   7. 새로운 낮은 바인딩 PCR 튜브에 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한, 전송.
      참고: 실험 여기 중지 될 수 있습니다. 또는 장기간 저장용-20 ° C에서 4 ° C에서 DNA를 보존.

5. 품질 검사, 정량화, 및 DNA의 순서

참고: 품질 검사는 DNA의 낮은 금액으로 인해이 단계 전에 실시 하지.

1. DNA 라이브러리 크기 분포의 유효성 검사
   참고: 다른 높은-민감한 전기 시스템 크기 분포의 디지털 보고 사용할 수 있습니다.
   1. 전기 이동 법 버퍼 시 약을 카트리지 (범위 25-1000 bp) 실내 온도를 젤.
   2. 시퀀싱 라이브러리의 1 µ L로 전기 이동 법 버퍼 시 약의 3 µ L을 추가 하 고 소용돌이, 그들을 철저 하 게 1 분 동안 혼합 짧게 탁상 원심 분리기와 원심.
   3. 전기 이동 법을 수행 하 고 관련된 소프트웨어와 라이브러리 크기 배포의 유효성을 검사 합니다. 주요 조각 피크 합니다 수 광범위 하 게까지 약 300에서 1000 bp.
2. DNA의 정량화
   참고: 다른 형광 기반 방법 또는 양이 많은 PCR도 사용할 수 있습니다, 하지만 분 광 광도 법, 피해 야 한다 그것은 시퀀싱 라이브러리를 측정을 위해 충분히 정확 하지.
   1. 버퍼 솔루션의 796 µ L 및 형광 시 약의 4 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 그들을 믹스. 2 분석 결과 튜브를 작업 솔루션의 190 µ L 및 1 개의 분석 결과 관에 197 µ L를 분배.
   2. 각 분석 결과 튜브 작업 솔루션의 190 µ L을 포함 하 게 DNA의 알려진 농도가 표준 10 µ L 및 작업 솔루션의 197 µ L를 포함 분석 결과 튜브를 준비 된 도서관의 3 µ L를 추가 합니다.
   3. 소용돌이 관 짧게 탁상 원심 분리기에 원심 및. 3 µ L 설정으로는 fluorometer를 사용 하 여 DNA를 계량.
3. DNA 라이브러리 순서
   참고: 시퀀싱 플랫폼 지정된 라이브러리 건설 키트와 호환 되어야 합니다.
   1. 준비 제조 업체의 프로토콜에 따라 시퀀싱 라이브러리.
   2. 시퀀싱에 시 약 카세트와 흐름 셀을 설정 하 고 시퀀싱 정보는 제조 업체의 프로토콜을 실행을 입력 합니다.
   3. 시퀀싱을 실행 합니다.
      참고: 우리는 두 개의 시퀀싱 실행 실시: 4 개의 샘플 한 실행에서 다중화로 한 샘플/실행.

6. 전산 분석

1. 기본 전화 하 고, 필요한 경우 demultiplex는 읽기.
2. FastQC¹⁹시퀀스 데이터의 품질을 확인 합니다.
   주: 획득된 데이터의 자세한 유효성 검사에 대 한 우리의 이전 보고서¹⁶를 참조 하십시오.

결과

오염 물질 배제:

이 프로토콜은 tardigrade와 오염을 최소화 하기 위해 항생제 치료와 살 균의 철저 한 씻기를 포함 한다. 그것은 또한 이러한 프로세스의 완전성을 보장 하기 위해 시각적 검사 과정을 포함 한다. 유효성 검사 (2.4/프로토콜 단계) 동안 현미경 이미지를 그림 2에 표시 됩니다. 500 X 배율에서 관찰 하는 경우 개별 tardigrade 주위에 이동 하는 작은 입자로 세균 세포를 볼 수 있습니다.

DNA 라이브러리 품질의 유효성 검사:

토론

세균성 오염 미세한 생물의 게놈 시퀀싱에 위협이 포즈. Tardigrade 게놈 시퀀싱에 대 한 이전 연구는 오염 광범위 한 정보학 방법을^12,20를 사용 하 여 필터링 하는 동안 우리는 오염 위험을 최소화 하기 위해 하나의 개별에서 게놈 시퀀싱. 개별 tardigrade genomic DNA¹⁶ 의 약 50-200 pg 포함 되어 있기 때문에 키 틴 질 외 골격의 두꺼운 층에 쌌 다, 오염 물질 및 양질의 DNA 추출의 배제는이 프로토콜에 중요 한 포인트. 기존 tardigrades 문화는 무 균, 그리고 그 수집 된 야생 수행에서 오염 물질의 많은 그들의 창 자에 식품의 표면에. Tardigrades의 이전 게놈 시퀀싱 프로젝트 총칭 한 샘플^12,14, 결과 세균 오염에 의해...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SZ61 현미경	OLYMPUS
BactoAgar	Difco Laboratories	214010
페니실린 스트렙토마이신(10,000 U/mL)	Gibco by life technologies	15140-148
VHX-5000 System	Keyence
0.2mL 실리콘 코팅 튜브	Bio Medical Science	BC-bmb20200
Quick-DNA 마이크로프렙 키트	ZYMO Research	D3021	이 키트의 사용은 절대적으로 중요합니다. 3.1 단계 참조
1.5 mL 마이크로튜브	greiner bio-one	616-201	4.1.1
HIgh speed rerigerated micro centrifuge	TOMY	MX-307
Covaris M220	Covaris Inc.
ThruPLEX DNA-Seq 키트	Rubicon Genomics	CAT. NO. R400406	이 키트의 사용은 절대적으로 중요합니다. 단계 4.2
Thermal Cycler	Bioer Technology	TC-96GHbC
AMPure XP 시약	BECKMAN COULTER Life Science	A63881
Ethanol	Wako	054-027335
EB buffer	QIAGEN	19086 참조
2200 TapeStation	애질런트	G2965AA
D1000 시약	Agilent	5067-5583
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582
Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent	ThermoFisher Scientific	Q32850
Cubee Mini-Centrifuge	RecenttecGenereach	R5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3	Illumina Inc.	MS-102-3003
MiSeq 시퀀서	Illumina Inc.	SY-410-1003