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방법 논문

Murine 원심 인공, C57BL/6 마우스에 전환 Colitis의 새로운 모델

13K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57616

⸱

2018년 7월 12일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, Visceral, Thoracic and Vascular Surgery, Universitätsmedizin Greifswald, 2Institute of Pathology, Universitätsmedizin Greifswald

이 논문에서

요약

Murine 원심 인공 인간의 전환 colitis, 지저분한 스트림에서 제외 콜론 세그먼트에서 주로 림프 colitis 위한 murine 모델을 제공 합니다.

초록

양 대 장 염 (DC)는 환자에서 발생 하는 diverting enterostomy의 결과로 지저분한 스트림에서 제외 장 세그먼트와 자주 임상 조건입니다. 이 질병의 병 인 병이 정의 남지만 크 론 병과 궤 양성 대 장 염 같은 클래식 선 동적인 장 질병의 차이가 나타납니다. 이 질병의 개발을 선도 pathophysiological 메커니즘을 해독 하기 위한 연구는 적절 한 murine 모델의 부족에 의해 심각 하 게 방해 되었습니다. 이 프로토콜은 면역 체계의 역할 및 DC의 개발에 미생물와의 상호 작용의 연구를 용이 하 게 하는 DC의 murine 모델을 생성 합니다. C57BL/6 동물을 사용 하 여이 모델에 콜론의 원심 부분 원심 인공 항문을 만들어, 약한 염증 제외 장 세그먼트에 보통의 개발 트리거링 및 인간의 전형적인 병 변 재현으로 지저분한 stream에서 제외 됩니다. 적당 한 조직의 염증 반응으로 Dc입니다. 쥐 모델 달리 많은 유전자 변형 murine 모델 C57BL/6 배경에 사용할 수 있습니다. 우리의 모델이 동물의 조합 수 있습니다 개별 cytokines, 발산, 또는 생리 활성 분자 (예를 들어, 인터 루 킨 (IL)-17;의 수용 체의 잠재적인 역할을 IL-10, chemokine CXCL13, CXCR5 및 CCR7, chemokine 수용 체 그리고 sphingosine 1 인산 염 수용 체 4) DC의 병 인에 평가. C57BL/6 백그라운드에 congenic 쥐 긴장의 가용성은 크게 다른 종류의 세포는 병 인에 관련 된 DC의 역할을 설정 하는 전송 실험 용이. 마지막으로, 모델 및 비 영향을 영향을 받는 장 세그먼트에서 점 막 면역에 지역 개입 (예를 들어, 로컬 미생물 또는 로컬 염증 치료의 수정)의 영향을 평가 하기 위해 기회를 제공 하 고는에 조직의 면역 항상성입니다.

서론

최근 몇 년 동안, 고아 한 선 동적인 장 질병 (IBDs; 다른 비 감염 성 대 장 염 엔터티의 상당수 즉., Crohn의 질병 또는 colitis ulcerosa)는 임상 및 histopathologically 특징 되었습니다 인간에서. 이러한 colitis 형태의 개발을 선도 병 태 생리 기계 장치는 완전히 이해 되지 부분적으로 적절 한 동물 모델은 부족 때문에. 양 대 장 염이 최근 설명된 엔터티 중 하나입니다. 기간 Glotzer1에 의해 1980 년에 화폐로 주조 되었다, 비록 비슷한 표현 형의 초기 설명 Morson2에 의해 1972 년에 주어졌다. 질병 개발 50%에 enterostomy, 우회 환자의 91%에 그리고 그것의 임상 강도 다릅니다3,4. 아메리카 합중국에서에서 약 120000 인공 환자의 연간 발생률을 감안할 때,이 질병 엔터티는 중요 한 건강 문제를 구성 합니다.

이 프로토콜을 개발의 전반적인 목표는 인간 DC에서 본 비슷한 colitis 트리거에 의존 하 고 하는 인간 질병의 기본 histopathological 기능을 재현 murine DC 모델을 제공 했다. 다른 murine colitis 모델 달리 우리의 모델에서 colitis 유도 유전자 변형된 동물 (예를 들어, 일리노이-7 유전자 변형 마우스, N cadherin 지배적인 부정적인 쥐, 또는 TGFβ/- 생쥐), 필요 하지 않습니다 응용 프로그램의 화학적 자극 물질 (예, dextran 황산 나트륨 (DSS)-유도 대 장 염, 또는 trinitrobenzene 술 폰 산 (TNBS)-유도 대 장 염), 또는 특정 세포 인구 (CD45RB높은 전송에서 면역 결핍 생쥐에서의 전송 colitis의 모델) (검토,5참조). 다른 모델과 달리 우리의 DC 모델의 그대로 면역 시스템은 면역 메커니즘의 평가 DC 개발에 관련 된 있습니다. 제외 된 장 세그먼트에 점 막 염증의 제한 위장, 창 자의 다른 면역 구획에 면역 항상성에의 다른 부분에 점 막 면역의 돌아옴의 평가 수 (예: , Peyer의 패치 및 mesenteriale 림프절), 및 전체 유 기체의 면역 항상성. 마지막으로, 우리의 모델 모두는 지역 미생물으로 영양 항 일반 로컬 환경 변화에서 발생 하는 로컬 염증 성 자극을 제어 하는 메커니즘을 조사에 적합 한 도구를 구성 합니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법 수의 정부 기관 (Landesamt에 Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit 및 Fischerei 메클렌부르크-포어 폼 머 른, (LALLF M-V))에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. 수술 전 치료와 동물의 준비

  1. 동물 시설에 도착, 비슷한 크기의 그룹으로 동물 (C57Bl/6)를 분할 하 고 각 그룹을 함께, 케이지 그룹 실험 내내 일정 하 게 유지.
    참고: 같은 섹스의 동물을 사용 합니다. 설명 결과 남성 쥐와 함께 얻은 했다.
    참고: 남성 동물 사용 되는 경우, 케이지 그룹 함께 시작 하는 때 그들은 나이의 7 주 계층 구조를 설정할 수 있도록, 따라서 위험을 최소화 공격적인 행동의 실험 중.
  2. 적어도 1 주일 전에 수술, 높은 에너지로 전환 (> 14 MJ/kg) 및 고 단백 (> 20%) 모든 필수 미 량 원소와 비타민을 포함 하는 피드 (자세한 자료의 목록 참조).
    참고: 수술을 수행할 때 모든 마우스 무게 이상 25 g을 확신 합니다.
  3. 케 타 민 (i.p. 87 mg/kg) 및 xylazine 염 산 염 (i.p. 13 mg/kg)의 복 주사로 마 취 및 진통 유발. 마우스는 기계적 자극, 예를 들면 발가락 피치, 모터 응답 없이 허용 될 때까지 기다립니다.
  4. 작업 데스크, 안정적인 작업 중 위치 및 체온의 압도적인 손실 방지를 보장에 위치 열 언더레이에 부정사 위치에 테이프와 함께 narcotized 마우스를 보안 합니다.
    참고: 열 언더레이 36 ° C ~ 40 ° C;의 표면 온도가 있어야 합니다. 수술 실 온도 21 ° c.는 이어야 한다

2. 원심 인공 작업

  1. 복 부 머리를 면도. 시작 하기 전에 수술, 세 번 사용 하 여 알코올 70% 작업 필드와는 iodophor 소독. 무 균 조건에 대 한 보장을 작업 필드에 드러 워 진.
  2. 복 부 근육과는 교육에 따라 복 incising 15 m m 중간 개복 술 수행 알바, 혈액 손실이 최소화.
  3. 2 기금 atraumatic 집게를 사용 하 여, 신중 하 게 맹, 터미널 회장 및 오름차순 및 가로 결 장 복 막 구멍에서.
    참고: 엄격 하 게 제한 mesenteric 구조에 부상을 방지 하기 위해 내장의 기계 조작에 주의 해야 합니다.
  4. Cecal 극, 오름차순 결 장 및 작은 창 자 (그림 1a 및 1b)을 확인 합니다.
    참고: 오름차순 콜론의 올바른 식별은 인공의 올바른 배치에 대 한 근본 이다. Ileocecal 지역의 해부학 모호한 경우에 Peyer의 패치의 존재 확인 소장, 그리고 형성된 된 대변의 존재는 콜론 특징.
  5. 눈금자를 사용 하 여 미래의 인공의 위치를 결정. 그것은 배치 되어야 한다 20 mm 원심 원심 인공 ileocecal 밸브.
  6. 상단 오른쪽 사분면에서 복 벽에 두 번째 3-m m 절 개를 확인 합니다. 루프를 왜곡 하지 않도록 주의 되는 루프를 형성 하기 위하여이 절 개를 통해 이전 확인된 콜론 세그먼트를 당기십시오.
  7. 신중 하 게는 mesocolon 통해 22 게이지 유연한 i.v. 정 통과. 알아서 하지 mesenteric 혈관 구조를 손상.
  8. 내장 복 막 구멍을 반환 합니다.
  9. 간단한 스티치와 resorbable 봉합 (예를 들어, polyglactin 910 또는 polyfil 4-0 1/2 c)를 사용 하 여 피부에 유연한 튜브의 양쪽 끝을 수정 합니다.
  10. 개복 술을 닫기 전에 유체 소생 0.5 mL 0.9% 염 분의 복 주사를 사용 하 여 수행 합니다.
  11. Resorbable 봉합 (예: polyglactin 910 또는 polyfil 4-0 1/2 c)를 사용 하 여 연속 봉합으로 복 막과 근육 층을 닫습니다. 예를 들어, polyglactin 910 (polyfil 4-0 1/2 c) resorbable 봉합 사를 사용 하 여 연속 봉합으로 피부를 닫습니다.
  12. 좋은 위를 사용 하 여 부분합 transection 수행 하 여 exteriorized 콜론 루프를 엽니다. 피하는 mesentery에 모든 부상. 콜론을 완전히 transect 하지 마십시오.
  13. 각 인공 여 복 하 3 단일 전체 두께 바늘을 사용 하 여 수정 하 고 monofil, 흡수 되기 쉬운 봉합 사를 사용 하 여 피부 (예를 들어, polydioxanone 또는 monofil 6-0 3/8s). 기능 끝-인공 인 성의 루프 및 점액 누 인 원심 루프 (그림 1c)이이 시점에서 명확 하 게 구분 됩니다.
    참고: 작업 시간 해야 20 분 미만 유체 및 열 손실을 제한 합니다.
  14. 후 악기 제조업체의 지시에 따라 초음파 목욕에 알데하이드 무료 살 균 솔루션을 사용 하 여 소독, 수술을 마무리.

3. 가짜 작업 (Colotomy)

  1. 1.1 단계를 수행 합니다. 2.4 through.
  2. 눈금자를 사용 하 여 미래 colotomy 위치를 결정. colotomy 실험 그룹에서 인공으로 ileocecal 밸브 로부터 같은 거리 위치 한다.
  3. 콜론을 열고 적어도 2/3 잘가 위를 사용 하 여 그것의 둘레.
  4. 닫기 단일 층으로 colotomy, 전체 두께 중단 monofil, 흡수 되기 쉬운 봉합 사를 사용 하 여 봉합 (예를 들어, polydioxanone, monofil 6-0 3/8s).
    참고: 작업 시간 실험된 외과 의사, 유체 및 열 손실 제한에 대 일 분 미만 이어야 한다.
  5. 2.10 단계를 수행 합니다. 2.11. 그리고 2.14입니다.

4. 수술 후 관리

  1. 그들의 감 금 소에 동물을 반환 합니다. 37 ° C (예를 들어, 적외선 램프로)의 잘 단련 된 분위기를 제공 마우스는 완전히 깨어 때까지. 다음, 온도 및 습도 통제 환경 (21 ° C, 상대습도 30% ± 10%)에서 마우스를 유지. 음식과 식 수를 무료로 이용할을 수 있습니다. 유체 이해를 촉진 하기 위하여 추가 물에 젖은 사료를 제공 합니다.
  2. 0.1 mg/kg 몸 무게 buprenorphine를 주입 하 여 수술 후 진통 시작 때 동물 기계적 자극에 반응을 보여 사우스 캐롤라이나. 호흡을 하지 않도록 주의 해야 합니다.
  3. 수술 후 첫 주 동안 지속적인된 진통에 대 한 1 mg/mL tramadol와 식 수를 보충 한다.
  4. 로 인해 감소 액체 섭취 량에 대 한 보상 이동성 감소, 수술 후 첫 주 동안 장에 단단한 음료 패드를 공급.
  5. 첫 주, 첫 달의 나머지 동안 매초 마다 하루 그리고 Kleinwort 외 에 설명 된 질병 심각도 점수를 사용 하 여 두 번째 달 동안 모든 3 일 동안 매일 동물과 동물 행동 점수를 무게 6.

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결과

수술은 모두 실험 (인공), 가짜 (colotomy) 그룹에 잘 용납입니다. 수술 및 수술 관리 올바르게 수행 하는 경우 수술 사망률 10%를 넘지 말아야 한다. 첫 수술 후 주에 상당한 체중 감소 실험와 가짜 그룹에서 볼 수 있다. 가짜 그룹의 동물 달성 4 번째 수술 후 날 향해 일반적으로 그들의 체중 최하 하지만 실험 그룹의 뒷부분에 나오는 1 일 발생. 체중 감량은 초기 체중의 21.7%에 도달 하는 실험적인 그룹에 더 발음 됩니다. 반면, 가짜 동물 그들의 초기 몸 무게 (그림 2)6의 10.8%를 잃게됩니다. 수술 후 첫 주에 체중 nadir 후 몸 무게 두 실험 그룹에서 하지만 실험적인 그룹에서 느린 경사로 지속적으로 상승. (즉, 피 묻은 방전 또는 어느 실험도 가짜 그룹6에서 발생 하는 액체 배변) 심...

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토론

이 프로토콜에 안정적으로 제공 하는 DC의 murine 모델 (예를 들어, 드 노 보 개발 염증이 대 장 세그먼트, 단축, 토 굴 및 절감 submucosa 림프 낭의 인간 DC의 histopathological 기능을 재현 잔 셀 번호)입니다. 이 이점 이외에도이 모델 매우 비슷한 트리거링 요인에 의해 유발 고 가장 영향을 받는 인간의 경우 가벼운 심각도에 온건한의 임상 과정을 선물 한다.

재현할 결과 및 허용 수술 치, microsurgical 기술에서 연습이 필요 하다. 그러나, 인공 및 가짜 작업 (colotomy) 매우 낮은 수술 mortalities 수행할 수 있습니다 (< 10%). 일부 작업 단계는 매우 중요: 1) 긍정적으로 확인 결 장 그리고 맨끝 회장. 경우 어디 명확 하지 ileocecal 지역의 해부학, Peyer의 패치의 존재에 의해 형성된 된 대변의 존재와 터미널 회장으로 콜론을 확인할 수 있습니다. 2) 때 인공 루프,...

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공개 사항

모든 저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
작동 재료
열 밑받침, 6 와트ThermoLux, Witte + Sutor GmbH461265
에탄올 70% (메틸에틸케톤 포함)Greifswald
나무 애플리케이터, 작은 면 머리 단면, 나무 막대기, 길이 150mmCentramed GmbH, 독일8308370작업 필드 소독용
가위Aesculap (BRAUN)BC064R
외상성 DeBakey 집게Aesculap (BRAUN)OC021R
바늘 홀더Aesculap (BRAUN)BM012R
Vasofix Safety i.v. 캐뉼라 22GBraun Melsungen AG, 독일4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 바이올렛 브레이드; V-5 17m 1/2c; 70cm에티콘, Inc.
PDS II 6-0 모노필; V-18 13mm 3/8C; 70cm에티콘, Inc.Z991H
BD Plastipak 1 mL (멸균 내부가있는 바늘이 달린 주사기)BD Medical305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin)ANTISEPTICA, Germany18824-01초음파 욕조에서 수술 기구 소독
약물
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride)selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH9089.01.0087 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride)selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH400300.00.0013 mg/kg i.p.
NaCl 0.9%Braun Melsungen AG, Germany6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine)Bayer, GermanyPZN: 014988700.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (트라마돌 염산염)Grü nenthal GmbH, 독일101168381 mg/mL 식수
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone) Cephasaar GmbH, 독일PZN: 08844252체중 25mg/kg i.p.
metronidazole 5 mg/mLBraun Melsungen AG, GermanyPZN: 체중 0554351512.5mg/kg 체중 i.p.
>Food
ssniff M-Z Ereichssniff, 독일  V1184-3
고체 음료 Dehyprev Vit BIO, 파우치TripleATrading, 네덜란드SDSHPV-75
장비
Nikon Eclipse Ci-LNikon Instruments Europe BV, 독일광학 현미경
VetScan HM 5 Abaxis, 미국770-900050 µ의 수의학 혈액학 분석기; l 정맥 EDTA - 혈액
Bandelin SONOREX (초음파 욕조)Bandelin electronics, GermanyRK 100 H수술기구 소독
Software< / em>
NIS Element BR4 소프트웨어Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6GraphPad Software, Inc.
대학병원 약국VCP994H

참고문헌

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