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방법 논문

인간에서 퇴행 성 Tenocyte를 취득 하는 프로토콜

6.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57634

⸱

2018년 6월 9일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine, 2Department of Pathology, Kyung Hee University Hospital at Gangdong, Kyung Hee University School of Medicine, 3Department of Physiology, CHA University School of Medicine, 4Department of Rehabilitation, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

Tendinopathy에 새로운 치료의 효능을 조사할 때 퇴행 성 tenocytes의 생체 외에서 사용은 필수적입니다. 그러나, 대부분의 연구 연구 동물 모델 또는 건강 한 tenocyte를 사용합니다. 우리는 수술 하는 동안 인간의 퇴행 성 tenocytes를 분리 하는 다음 프로토콜을 제안 합니다.

초록

증가 신체 활동 및 더 긴 수명으로 인해 선진국에서 증가 Tendinopathy, 힘 줄 변성에 대 한 응답에서을 개발 하 고 고통 스러운 상태 이다. 그것의 증가 보급에도 불구 하 고 기본 병 인 아직도 불분명 하 게, 남아 있다 그리고 치료는 일반적으로 증상을 보인다. 최근, 성장 인자, 줄기 세포 및 유전자 치료 등 다양 한 치료 옵션은 퇴행 성 힘 줄의 치료 효능을 향상을 위해 조사 되었다. 그러나, 이러한 연구의 대부분은 동물 모델 또는 건강 한 인간 tenocytes에만 실시 되었다. 병 적인 tenocytes를 사용 하 여 일부 연구에도 불구 하 고 우리의 지식 최선을 다 해 현재는 인간의 퇴행 성 tenocytes을 구하는 방법을 설명 하는 아무 프로토콜. 이 연구의 목적은 인간의 퇴행 성 tenocytes 획득을 위한 표준 프로토콜을 설명 하는 것입니다. 처음에, 힘 줄 조직은 수술 하는 동안 측면 염증 환자에서 수확 했다. 다음 생 샘플 해당 수술 시 관찰 하는 구조적인 변화 하 신 근 피 radialis brevis 힘에서 촬영 됐다. 수확된 힘 줄의 모든 지루한, 회색, 어렵다면, 등장 하 고, edematous는 그들이 만든 건강 한 사람에서 시각적으로 뚜렷한. Tenocytes 배양 하 고 실험을 위해 사용 했다. 한편, 수확 조직의 절반 조직학, 분석 되었다 그리고 tendinopathy angiofibroblastic 형성 (증식) 같은 주요 기능을 공유 하는 그들은 보였다. Immunocytochemistry에 의해 2 차 분석 확인 배양된 세포 모호크와 tenomodulin 단백질에 대 한 긍정적인 얼룩을 갖는 셀의 대다수와 가진 tenocytes 했다. Tenocytes의 퇴행 성 자연의 자질 다음 확산 분석 결과 또는 qRT-PCR를 사용 하 여 건강 한 컨트롤 셀 비교 하 여 결정 했다. 퇴행 성 tenocyte 더 높은 확산 속도 일치 하는 이전 보고서 tendinopathy의 유사한 유전자 표현 패턴 표시. 전반적으로,이 새로운 프로토콜 tendinopathy의 미래 연구에 대 한 유용한 도구를 제공할 수 있습니다.

서론

Tendinopathy 신체의 다양 한 부분에서 개발 하 고 만성 퇴행 성 근 골격 계 상태 이다. 최근, tendinopathy의 케이스의 수에 참여 레크리에이션 스포츠 및 증가 평균 수명1,2성장으로 인해 선진국에서 크게 증가 했다. Tendinopathy의 원인 multifactorial 간주 됩니다 및 이러한 원인은 허 혈, 산소 자유 래 디 칼 부상, vasoconstrictor 및 vasodilator innervations, 내부 마이크로-눈물, 그리고 신경 레 귤 레이 션3에 변화 사이의 불균형 포함 ,,45,6,,78. Tendinopathy에 대 한 대부분의 치료만의 증상을 완화. 또한, 조직 재생 없이 치료 재활에 대 한 오랜 시간을 요구 하 고 의사9임상 과제 부과 부상된 힘 줄에서 제한 된 응답 달성.

현재 치료 옵션과 자체에 퇴행 성 힘 줄의 능력의 부족의 무는 대체 치료 전략을 탐구에 관심을 가져 리드 연구원. 최근, 성장 인자를 사용 하 여 tendinopathy 힘 줄의 치료 효능을 향상을 위한 많은 유망한 결과 보고 하는 새로운 연구, 줄기 세포 기반 치료, 그리고 유전자 치료10,,1112.

문학 검토를 통해 우리는 관련 된 연구의 분석 자료를 기반으로 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다 발견: 쥐, 마우스, 또는 토끼; 같은 동물 모델 그리고 인간의 모델입니다. 동물 모델에 관해서는 현재 두 개의 인기 있는 기술이 있다 tendinopathy 생성 하: 부상 또는 모델을 오버 로드 하는 기계 화학 유도. 그러나, 각 동물 모델은 복잡 한 인간의 tendinopathy 병리학13,14재현에 제한 되었다.

대부분 논문 인간의 샘플을 사용 하 여 조직학 분석 했다 또는는 생체 외에서 퇴행 성 tenocyte15,16,,1718 대신 건강 한 인간의 tenocyte를 기반으로 하는 실험 , 19 , 20 , 21. 몇 논문만 보고 그들이 인간의 퇴행 성 tenocyte를 사용 하지만 그들은 않았다 하지 자세히 설명 인간의22,23에서 퇴행 성 tenocyte를 얻을 하는 데 사용 하는 프로토콜. 이러한 맥락에서 그것은 지적 되어야 인간의 효능 또는 효과 먹이 지 힘 줄 변성은 복잡 한 과정 때문에 병 인은 동물 모델 또는 건강 한 조직/tenocyte에서 성공적인 결과 반드시 예측 하지 수는 아직도 완전히 이해.

그것은 기증자에 게 부작용을 유발 하지 않고 인간의 조직에서 퇴행 성 tenocyte을 얻기 위한 표준 프로토콜을 설명 하는 데 필요한. 이 문서는 인간의 퇴행 성 tenocyte를 취득 하는 방법에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 유효성을 검사 하려면 수확된 조직 조직학 분석 되었다. 그런 다음, 교양된 셀 immunocytochemistry (ICC), 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR), 생존 능력 분석 결과 사용 하 여 퇴행 성 tenocyte로 확인 되었다.

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프로토콜

프로토콜은 헬싱키의 선언에 따라 실시 하 고 프로토콜 차 분당 병원 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 퇴행 성 힘 줄 조직 수확은 환자에서

  1. 의료 기록을 신체 검사 결과 사용 하 여 측면 염증 진단: 측면 뼈; 가까이 단 근원 부드러움 손목 관절의 저항된 확장에 의해 갖는 고통.
  2. 다음 포함 기준을 사용 하 여: 18 세 이상; 최소 6 개월;에 대 한 측면 염증의 역사 비 수술 치료; 대 한 고집 불통 적어도 3 개월이 코르 티 코 스테로이드, 혈소판 리치 플라즈마, 또는 보 톨 리누스 독 소의 주입 이후
  3. 다음 제외: 임신 여성; 자 궁 경관 등뼈 질병, 팔꿈치 관절염, rheumatologic 질병, 팔꿈치, 그리고 신경 함정 수사 증후군; 주위 수술의 역사를 가진 환자 조직 기증을 거부 하는 환자.
  4. 수술 기법
    참고: 그림 124참조.
    1. Isoflurane endotracheal 삽 관 법에 의해 일반 마 취, 후 테이블에 팔을 넣고는 지 혈 대를 적용. 그런 다음 팔 전체에 무 균 수술 시트와 드 레이프 betadine 에이전트를 적용 합니다.
    2. 15 번 외과 용 메스 블레이드 그냥 anteromedial 측면 뼈와 관절의 수준에 인접 된 3-5 cm 절 개를 통해 측면 팔꿈치를 노출 합니다.
    3. 시각 신 근 피 radialis longus (ECRL) 및 신 근 aponeurosis 인터페이스를 식별 하 고 식별 된 인터페이스에서 15 번 외과 용 메스 블레이드와 ECRL 및 신 근 aponeurosis 사이 깊이에 분할 절 개 2-3 m m를 확인 합니다.
    4. 추출 된 ECRL anteriorly,는 직접 보기에 아래 pathologic 신 근 피 radialis longus brevis (ECRB) 원산지를 가져올 것 이다.
    5. 시각 특성 단조로운 잿 빛 색에 의해 pathologic 퇴행 성 조직 및 일반적으로 edematous 및 부서 조직을 식별 합니다.
    6. 확인 후 신중 하 게 모든 퇴행 성 조직 급격히 15 번 외과 용 메스와 미니-블레이드를 사용 하 여 resect.
    7. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 즉시 (약 1 c m3) 절제 조직을 포함 하 고 약 10 mL의 PBS로 신중 하 게 최대한 빨리 힘 줄 조직 제외 하 고 모든 주변 조직을 제거 합니다.
    8. 측면 뼈에서 뼈 exostosis 경우, exostosis는 rongeur를 사용 하 여 제거 하 고는 강판으로 매끄럽게 합니다. 게 여러 드릴 구멍 (직경 1.6 m m, 약 6-8 구멍) 혈관 공급을 향상 시키기 위해 anterolateral 관절 돌기에. 이것은 선택 사항입니다.
    9. 레이어, 레이어 비 흡수 봉합 사 물자를 사용 하 여 상처를 닫습니다.
  5. 건강 한 제어 tenocyte
    1. 전방 십자 인 대 재건, 동안 자동 햄 스트링 또는 자동-슬 개 골 힘 줄의 남은 힘 줄에서 건강 한 tenocytes를 얻을 하 고 다음 실험25컨트롤로 사용 합니다.
      참고:이 연구에 사용 된 샘플 수가 각 그룹에 3 했다.

2입니다. 조직학

  1. 화학 증기 두건 또는 이와 동등한 중립 버퍼링 된 10% 포 르 말린에 수확된 조직의 절반을 저장 합니다.
  2. 조직을 파라핀 블록 (4-5 mL)에 포함 하 고 coronally 4-5 µ m 섹션에 섹션.
  3. 제어 및 Hematoxylin 및 오신 얼룩 (H & E)와 2.5의 pH에 Alcian 블루 얼룩 퇴행 성 힘 줄에서 섹션을 얼룩. H & E 자동된 얼룩 기계에 얼룩이 지 다음과 같이 수행 합니다.
    1. 크 실 렌을 사용 하 여 deparaffinize (3 시간, 5 분, 각각).
    2. 물 (100% 알코올, 4 분, 100% 알코올, 3 분, 95% 알코올, 2 분, 70% 알코올, 1 분, 물, 2 분) 등급된 알콜에서 하이드 레이트.
    3. 5 분 2 분 동안 물에 잘 세척에 대 한 되며에 얼룩.
    4. 1% 산 알코올 차별화 (1% 70% 알코올에 HCl) 3 3 분 물에 잘 씻어 s..
    5. 찍기 10는 0.5% 암모니아에 의해 HCl를 중화 s, 뒤에 3 분 물 세척.
    6. 5 분 동안 Eosion에 얼룩.
    7. 알콜을 통해 탈수 (80% 알코올, 30 100% 알코올 1 분, 100% 알코올 95% 알코올, 1 분; s 2 분).
    8. 크 실 렌에 취소 (3 시간, 2 분, 2 분, 3 분, 각각).
    9. 표지 슬라이드와 함께 탑재.
  4. Immunohistochemitry (IHC) 사소한 수정 제조업체의 지침에 따라 채권 폴리머 수정 탐지 키트를 사용 하 여 수행 합니다.
    1. Deparaffinization 크 실 렌을 사용 하 여, 후 100 ° c.에 30 분 동안 본드 Epitope 검색 솔루션을 사용 하는 항 원 검색 절차를 수행 채권 Epitope 검색 솔루션 기반 시트르산 버퍼와 계면 활성 제 (1l, pH 5.9-6.1)에 포함 되어 있습니다.
    2. 5 분 동안 과산화 수소와 조직 배양 하 여 생 peroxidases를 끄다.
    3. 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF) (1: 200), tenomodulin (1: 200), 또는 모호크 (1: 200)에 대 한 1 차 항 체와 온도 (21-22 ° C)에서 15 분에 대 한 섹션을 품 어.
    4. 이차 항 체 고분자 biotin 무료 양 고추냉이 과산화 효소-링커 항 체 어원이 시스템 태그를 수행 합니다.
      1. 안티 사용 보조 토끼 마우스 항 체를 지역화 하려면 Tris 버퍼 saline/0.09% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one 솔루션에서 10% (v/v) 동물 혈 청에서 IgG를 마우스.
      2. 고분자 반대로 토끼 폴 리 HRP IgG를 사용 하 여 (< 25 µ g/mL) 10% (v/v) 동물 혈 청 지역화 토끼 항 체를 saline/0.09% Tris 버퍼에 포함 된.
      3. 3, 3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 수화물 갈색 침전을 통해 복잡 한 시각화를 안정제 솔루션에서 사용 합니다.
      4. 와 함께 counterstain < 셀 핵 시각화를 0.1% 되며 (파란색).
  5. H 물 슬라이드 관찰 & E, Alcian 파랑 얼룩 및 IHC 가벼운 현미경 VEGF, tenomodulin, 및 모호크에 대 한 하나의 높은 전력 분야 (400 X)에서 각 슬라이드의 대표적인 미세한 이미지를 얻을.

3. Tenocyte 문화

  1. 조직 준비
    1. 마이크로-가 위, 집게와 철저 하 게 모든 주변 조직을 제거 하 여 힘 줄 샘플을 준비 합니다.
    2. PBS로 세척 하 고 작은 조각 (약 1 m m3 이하로)으로 말하다.
    3. Dulbecco의 수정 독수리의 매체 (DMEM) 37 ° c.에 30 mg/mL 콜라 II와 보충의 30 mL에 1 시간에 대 한 조직을 소화합니다
    4. 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포를 전달 합니다.
    5. 소 태아 혈 청 (FBS)의 1 mL을 추가 하 여 콜라 II를 비활성화 합니다.
    6. 5 분 196 x g에서 원심.
  2. 세포 배양
    1. 100 mm 접시에 3 x 105 셀을 씨 고 DMEM 10 %FBS 1% 항생제 Antimycotic 솔루션 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 1 주에 대 한 보완과 문화.
    2. 문화 매체 마다 3 일 80% 합류 발생할 때까지 변경 합니다. 통로 4까지 건강 한 제어 및 퇴행 성 셀 샘플을 문화 및 실험을 위해 사용.

4입니다. Immunocytochemistry (ICC)

  1. 챔버 슬라이드의 8 개의 우물을 교양된 셀 (2 x 105 셀)의 200 µ L를 전송 하 고 1 일에 대 한 신선한 미디어의 추가 함께 합류 하 셀 성장.
  2. PBS로 세포 세척 하 고 잘 당 4% 포름알데히드의 500 µ L로 수정.
  3. 0.5%와 슬라이드를 품 어 세포 막의 permeabilization에 대 일 분에 대 한 PBS에 트라이 톤 X-100.
  4. PBS에서 1% 소 혈 청 알 부 민 및 0.05% 차단 트윈-20 모호크와 tenomodulin, 각각.
  5. 마우스 방지 모호크 단일 클론 항 체 (1: 100 희석)와 4 ° C에서 염소 안티-tenomodulin 항 체 (1: 100 희석) 어둠 속에서 밤새 품 어.
  6. 2 차 항 체 (알 렉 사 555-안티 염소 (1: 200) tenomodulin;에 대 한을 품 어 알 렉 사 488-안티 마우스 (1: 200) 모호크) 실 온에서 1 h에 대 한 어둠 속에서.
  7. 형광 장착 매체의 0.5 µ L로 탑재 합니다.
  8. 형광 현미경 (400 X)를 사용 하 여 분석 합니다.

5. 확산 분석 결과

  1. 셀 viabilities 수용 성 tetrazolium (서 부 표준시)-1 사용 하 여 측정 합니다.
    1. 24, 72, 및 120 h 잘 당 2 x 103 셀의 밀도에서 96 잘 접시로 모두 건강 하 고 퇴행 성 셀 씨.
    2. 부 화, 후 각 음을 10% 서 부 표준시-1 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.
    3. 5% CO2에서 37 ° C에서 3 h에 대 한 번호판을 품 어.
    4. 450에서 광학 밀도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여. 각 샘플에 대 한 모든 시간 포인트에서 세 번 이상 읽기를 가져가 라.
  2. 측정 세포질 DNA 양 BrdU 분석 결과 사용 하 여입니다.
    1. 둘 다 건강 한 씨앗 하 고 96에 타락 셀 잘 잘 24, 72, 및 120 h 당 2 x 103 셀의 밀도에 격판덮개.
    2. 부 화, 후 각 음을 10 %BrdU 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.
    3. 5% CO2에서 37 ° C에서 3 h에 대 한 번호판을 품 어.
    4. 100 µ L/잘 고정/Denaturing 솔루션의 추가 (60-70% 에탄올, 0.1-0.5%가 성소 다) 30 분 동안 실내 온도에 접시를 유지.
    5. 1 시간에 대 한 탐지 항 체 솔루션 및 계속 실 온에서 플레이트 x 1을 준비 하는 100 µ L/잘 추가 합니다.
    6. 솔루션을 제거 하 고 세 번 워시 버퍼 x 1와 접시 세척.
    7. 100 µ L/잘 준비 1 x HRP 활용 된 이차 항 체 솔루션을 추가 하 고 30 분 동안 실내 온도에 접시를 유지.
    8. 세 번 세척 버퍼 x 1와 솔루션 및 세척 접시를 제거 합니다.
    9. 50 %TMB 기판의 100 µ L를 추가 합니다.
    10. 실 온에서 30 분 동안 품 어.
    11. 정지 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다.
    12. 450에서 광학 밀도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.
      참고: 걸릴 읽기 적어도 세 번 모든 시간 포인트 각 샘플에 대 한.

6. 통계 분석

  1. 수집 하 고 SPSS를 사용 하 여 데이터를 분석.
  2. 의미의 평균 ± 표준 오차에 의해 데이터를 묘사.
  3. 사용만 휘트니 U 테스트 합니다.
  4. 때 p 값이 0.05 보다 작으면 통계적 차이 고려 (p < 0.05).

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결과

조직학 분석 공개 측면 염증에서 수확된 조직 tendinopathic 힘 줄의 특성을 했다. H & E 섹션 tendinopathy 퇴행 성 힘 줄의 극성 및 좋은 직선, 강하게 포장 병렬 섬유 구조 손실 무질서 콜라겐 번들을 밝혔다. 조직학 징후 높은 cellularity 등 전형적인 스핀 들 모양 없이 확대 핵 변성의 암시 샘플에서 일반적 이었다. 또한, 퇴 화 한 힘 줄의 콜라겐 번들 상대적으로 약한 오신 H & E 스테인드 했지만 긍정적으로 증가 proteoglycans 그리고 있다 물질을 나타내는 Alcian 블루 얼룩 했다.

모든 경우에 혈관 수에 증가 했다 고 섬유 사이 포함 하는 공간을 차지 하는 집계 정상 슬릿 모양의 혈관에 비교 했다. IHC 얼룩에서 퇴 화 한 힘 줄의 셀 컨트롤 들의 부정적인 반응에 비해 VEGF에 세포질 세분화...

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토론

이전 연구의 숫자는 콜라 또는 kartogenin 주입, 실행, 디딜 방 아 등 더 많은26,27다른 절차를 사용 하 여 만성 tendinopathic 동물 모델을 만드는 방법을 보고 있다. 수많은 연구가 동물 모델에 따라 유망한 치료 효과 보여, 비록 인간의 퇴행 성 tenocyte를 사용 하 여 실험 것입니다 중요 한 tendinopathy의 분야에서 치료의 효능을 재생 하기 위하여. 이 문서에서는, 우리는 성공적으로 수확 하 고 일관 되 게 인간의 퇴행 성 tenocytes 문화 프로토콜 설립. 둘 다 힘 줄 조직 수확 하 고 교양된 tenocyte 퇴행 성 힘 줄 및 tenocyte7,28의 일반적인 특성을 보였다.

우리의 경험에서는, 성공적인 조직 수확에 대 한 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구는 한국 건강 기술 R & D 프로젝트 통해는 한국 보건 산업 개발 연구소 (진흥원), 사역의 건강 및 복지, 한국에 의해 투자 되었다는에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (허가 번호: HI16C1559).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
메스KisanbioKS-Q0306-15No. 15
미니 블레이드비버374769
Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)Gibco11995065
PBSGibco14190250
소 태아 혈청(FBS)Gibco16000044
50mM 아스코르브산-2-인산염Sigma-AldrichA5960
항생제-항진균 용액Gibco15240062
4% 포름알데히드바이오 솔루션BP031
Triton X-100 Sigma-AldrichX100-100ml
BSARdtechC0082
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416-100ml
MKX (C-5)Santa cruz biotechnologysc-515878
Tenomodulin (N-14)Santa cruz biotechnologysc-49325
형광 장착 매체DAKOS3023
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306
WST-1Dojindo Molecular TechnologiesCK04
BrdU 세포 증식 분석 키트세포 신호 전달 기술#6813
TRIzol 시약invitrogen15596018
iScript cDNA 합성 키트 Bio-Rad170-8891
TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스응용 바이오시스템4369016
GAPDHThermo Fisher ScientificHs02786624_g1
COL3A1Thermo Fisher ScientificHs00943809_m1
ACTA2Thermo Fisher ScientificHs00426835_g1
TAC1Thermo Fisher Scientific
TACR1Thermo Fisher ScientificHs00185530_m1
PTGS2Thermo Fisher ScientificHs00153133_m1
ACTBThermo Fisher ScientificHs99999903_m1
세포 여과기 (100 µ m) Corning352360
100mm 배양 접시Thermo Fisher Scientific8188207
8-웰 챔버 슬라이드Thermo Fisher Scientific154534
96 웰 클리어 플랫 바텀 폴리스티렌 TC-treated MicroplatesCorning3596
Nikon Eclipse 50i 현미경 니콘
VERSA 맥스 마이크로플레이트 리더 분자 장치
CFX96 실시간 PCR 검출 시스템Bio-Rad
포르말린 용액, 중성 완충, 10%Sigma-AldrichHT501128
ParaffinsLeica Biosystems3801340
EthanolJUNSEI CHEMICAL90303-2185
HematoxylinDAKOCS70030-2
EosinDAKOCS70130-2
Alcian blueDAKOAR16011-2
시트르산Sigma-Aldrich251275
XyleneJUNSEI CHEMICAL25165-0430
내인성 과산화효소 DAKOS200380-2
캐나다 발삼JUNSEI CHEMICAL23255-1210
마이크로톰 블레이드FEATHERA35
슬라이드 유리SUPERIOR1000612
커버 유리Marienfeld-Superior101050
VEGF산타크루즈 생명공학sc-7269
SPSS 소프트웨어IBMVer. 18.0
다목적 원심분리기LABOGENE1248R
Hs00243225_m1

참고문헌

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