방법 논문

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

DOI:

10.3791/57646

⸱

2018년 11월 11일

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1Department of Human Anatomy and Cell Science, Rady Faculty of Health Sciences, Max Rady College of Medicine, University of Manitoba, 2Biology of Breathing Theme, Children Hospital Research Institute of Manitoba, University of Manitoba, 3Department of Biochemistry, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, 4Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Internal Medicine, Center for Comparative Respiratory Biology and Medicine, 5Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, 6Department of Molecular Biology, School of Pharmacy with the Division of Laboratory Medicine in Sosnowiec, Medical University of Silesia, 7Centre de biophysique moléculaire - UPR 4301, Centre national de la recherche scientifique (CNRS) CS80054, 8LinkoCare Life Sciences AB, 9College of Nursing and Children's Hospital Research Institute of Manitoba, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba, 10Health Policy Research Center, Institute of Health, Shiraz University of Medical Sciences

이 논문에서

요약

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여기 prenylation과 guanosine-5'-3 인산 염 (GTP)를 조사 하는 프로토콜 설명-Rho GTPase의 로드. 이 프로토콜 두 가지 상세 방법의 구성, 즉 막 분류 및 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과. Prenylation와 GTP를 측정 하기 위한 프로토콜을 사용할 수 있습니다 다른 작은 GTPases 다른 로드.

초록

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Rho GTPase 가족 Ras superfamily 속하는 고 인 간에 있는 약 20 명의 회원을 포함 한다. Rho GTPases cytoskeletal 역학, 세포 운동 성, 세포 극성, axonal 지침, 기공을 밀매 및 세포 주기 통제를 포함 하 여 다양 한 세포 기능 조절에 중요 하다. Rho GTPase 신호에 변화는 암, 중추 신 경계 질환, 면역 시스템에 종속 질병 등 많은 병 적인 조건에서 필수적인 규제 역할을 재생합니다. (즉, mevalonate 통로 중간에 의해 prenylation)로 GTPases 그리고 GTP 바인딩 posttranslational 수정이이 단백질의 활성화에 영향을 미치는 중요 한 요소는. 이 문서에 두 가지 필수 및 간단한 방법 Rho GTPase의 광범위 한 범위 prenylation 및 GTP 바인딩 활동 감지 제공 됩니다. 사용 된 기술 절차의 세부 사항 설명 단계가이 원고에서.

서론

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Rho GTPases 작은 단백질 (21-25 kDa), 진화를 통해 잘 보존 되 고 작은 GTPases의 Ras superfamily에 독특한 subfamily를 형성의 그룹입니다. 이 superfamily 내의 각 subfamily에 공유 G 도메인 코어 GTPase 활동 및 뉴클레오티드 교환1에 관련 된 있다. 로 가족과 다른 Ras 서브패밀리가 차이 5번째 β 물가 및 작은 GTPase 도메인2에 4번째 α 나선 내의 "로 삽입 도메인"의 존재 이다.

최근의 분류에 따라, Rho GTPases Ras GTPase superfamily3에 맞는 단백질 신호의 가족으로 간주 됩니다. 포유류로 GTPases 22 회원 그들의 특정 기능 및 일반적인 특성4 RhoA, Rac1, 및 Cdc42이이 그룹에서 가장 공부 회원 가운데는에 따라 있다. Rho GTPases 분자 스위치를 통해 단백질 posttranslational 수정5에 의존 하는 긴밀 하 게 규제 메커니즘 세포내 신....

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프로토콜

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1. 멤브레인/Cytosol 분류를 사용 하 여 RhoA 지역화의 결정

  1. 세포 문화와 simvastatin 치료
    1. 셀 100 m m에서 접시와 Dulbecco의에 문화 U251의 50000 씨가 글의 중간 (DMEM) (높은 포도 당, 10% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS]) 수정.
    2. 때 30% 합칠 매체를 제거 하 고 simvastatin 포함 된 매체 (디 메 틸 sulfoxide [DMSO]에 녹아 simvastatin의 10 µ M), 그것에 추가 하 여 셀을 취급 하 고 37 ° C8에서 36 h에 품 어. 혼자 DMSO를 사용 하 여 차량 통제로.
      참고: 10 백만 셀은 셀의 cytosol 그리고 막 분별이 필요 하다.
  2. 셀의 컬렉션
    1. 37 ° C 배양 기에서 셀을 제거 합니다. confluency 확인을 현미경으로 세포를 봐.
      참고: 셀 70%-80% 합칠 이어야 한다.
    2. 매체를 발음, 셀 1을 씻고 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 x. Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 버퍼의 5 mL을 추가 (KC....

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결과

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막의 분류:

Ultracentrifugation 막과 cytosol 부품의 분류를 위해 사용 되었다. 그림 1에서 보듯이 상쾌한 cytosolic 분수를 포함 하 고 펠 릿 포함 막 분수. U251 세포에서 얻은 cytosolic andmembrane 분수에 RhoA의 풍부한 simvastatin immunoblotting를 사용 하 여 함께 치료 후 시험 되었다. 순 결 하 고 막 그리고 cytosol 분수의 제어 로드 팬 Cadherin GAPDH에 의해 각각 확인 되었다. 그림 2에서처럼 simvastatin 치료 그것의 cytosolic 콘텐츠 증가 하면서 막 도약 RhoA GTPase의 양을 감소. 이것은 RhoA pr.......

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토론

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여기는 작은 GTPase prenylation 및 작은 GTPase subcellular 지 방화 (cytosol 대 막)와 로드로 GTP로 표시 하는 GTP 바인딩 측정 하는 정확한 방법에 설명 합니다. 작은 GTPases 진 핵 세포에 표현 되 고 세포질 확산, 운동 성, 및 구조에서 필수적인 역할. Prenylation와 GTP 바인딩 GTPase 활동의 규칙에 관련 된 따라서, prenylation 및이 단백질의 GTP 바인딩 분석 실험 세포 생물학1,8에 대 한 중요 한 도구입니다.

최근 연구의 결과에 따라, Rho 단백질 GTP 로드 셀 유형 특정8, 이며 따라서 다른 세포 유형 마다 다릅니다. 또한, subcellular 지 방화 및 Rho 단백질의 geranylgeranylation (GGT) 그들의 기.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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Saeid Ghavami 건강 과학 센터 운영 부여, 부여와 연구 매니토바 새로운 탐정 운영 보조금 운영 하는 CHRIM에 의해 지원 되었다. 자바드 Alizadeh 연구 매니토바 재학에 의해 지원 되었다. Shahla Shojaei MITACS 가속 박사 친목 건강 과학 재단 운영 보조금 지원 했다. 아 델이 Moghadam 조셉 W. 고 든에 의해 개최 되었다 그랜트를 운영 하는 NSERC에 의해 지원 되었다. 아미르 A. Zeki NIH/NHLBI K08 수상 (1K08HL114882-01A1)에 의해 지원 되었다. 마렉 J. 로스 친절 하 게 인정에서 지원 NCN #2016/21/B/NZ1/02812, 고급 연구 (지역 센터-발 드 루아르, 프랑스)의 스마트 루아르 밸리 일반 프로그램을 통해 르 STUDIUM 연구소에서 지원 하 고 공동 투자는 마리에 의해 퀴리 Sklodowska 작업 # 665790를 부여 합니다. 시몬 다 실바로 사 UMGF 재학에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM 고 포도당VWR (캐나다)VWRL0101-0500
소 태아 혈청VWR (캐나다)CA45001-106
페니실린 / 스트렙토 마이신VWR (캐나다)97062-806
EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산)VWR (캐나다)CA71007-118
EGTA (에틸렌 글리콜 비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산)VWR (캐나다)CAAAJ60767-AE
DTT (DL- 디티 오 트레이톨)VWR (캐나다)CA97061-340
과황산 암모늄VWR (캐나다)CABDH9214-500G
트리스 - 하이드 록시 메틸 아미노 메탄VWR (캐나다)CA71009-186
30 % 아크릴 아미드 / 비스 용액Biorad (캐나다)1610158
TEMEDBiorad (캐나다)1610801
프로테아제 억제제 칵테일Sigma/Aldrich (캐나다)P8340-5ML1:75 희석
Rho-GTPase 항체 샘플러 키트세포 신호전달 (캐나다)99681:1000 희석
Pan-Cadherin 항체세포 신호 (캐나다)40681:1000 희석
GAPDH 항체Santa Cruz Biotechnology (미국)sc-697781:3000 희석
RhoA G-LISA 활성화 분석(발광 형식)Cytoskeleton Inc. (USA)BK121세포골격 I. G-LISA 활성화 분석 기술 가이드. 2016.RhoA
항체세포 신호2117
ECLAmersham-Pharmacia BiotechRPN2209
Anti-Rabbit IgG (전체 분자) Peroxidase 항체SigmaA6154-1ML
SpectraMax iD5 다중 모드 마이크로 플레이트 리더분자 장치 1612071A분광 광도계
Nonidet P-40시그마11332473001비 변성 세제, 옥틸 페녹시 폴리에틸렌 옥시 에탄올
DMSO시그마D8418-50ML
PBS시그마P5493-1L
Phophatase 억제제 칵테일SigmaP5726-5ML1:75 희석

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
  2. Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C.

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