이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.
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방법 논문
면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
더블-좌초 틈 (DSBs) DNA의 복구는 매우 조정된 과정, 형성 및 다중 단백질 수리 단지의 해상도 필요로. 이 프로세스는 협회를 홍보 하는 단백질의 무수 한와이 병 변이 단백질의 분열에 의해 통제 된다. 단백질의 광대 한 도서관의 기능 화면 수행 하는 능력에 큰 부분에 감사 합니다, 이중 가닥 DNA 틈 수리에 필요한 유전자의 큰 감사 이다. 종종 녹아웃 또는 화학 억제 물 스크린 DSB 수리에 필요한 단백질에 대 한 표식으로 증가 독성을 사용 하 여 복구 프로세스에 관련 된 단백질을 식별 합니다. 하지만 게놈 충실도 유지에 관련 된 식별 소설 세포질 단백질에 대 한 유용한 기능 분석 관심사의 단백질 지역화, 형성, 또는 수리 복합물의 해결책을 촉진 하는 여부의 결정을 필요로 합니다.
수리 단백질의 축적 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 고유 핵 foci로 쉽게 감지 수 있습니다. 따라서, 협회 및 DNA 손상의 사이트에이 단백질의 분열 이중 가닥 DNA 틈의 유도 후 이러한 핵 foci 대표 간격으로 관찰 하 여 액세스할 수 있습니다. 이 방법은 또한 수리 결함 수리에서 불완전 지연으로 동시에 발생 하지 않습니다 경우 잘못 지역화 된 복구 요소 단백질를 식별할 수 있습니다. 이 시나리오에서는 긴-지속 이중 가닥 DNA 휴식 했다 효소에 대 한 인식 사이트 세포 게놈으로 통합 되어 셀에 드문 절단 endonuclease (예를 들어, SceI)으로 표현 하 여 설계 수 있다. 결과 병 변 특히 충실 한 수리 효소의 인식 사이트, 분열의 또 다른 라운드를 메시지를 다시 것입니다 해결 하기 어렵다. 그 결과, 수리의 속도에 차이 제거 됩니다. 수리 단지 형성 하지는 경우 지역화 장애가 되어 있다. 이 프로토콜 수리 단백질 지 방화 뿐만 아니라 복구 속도 론 변경 내용을 식별 하는 데 필요한 방법론을 설명 합니다.
서론
매일, 모든 세포는 인체에는 약된 10, 000으로 포 격 된다 DNA 장애1. 이 생존의 위협을 셀 뿐만 아니라 돌연변이, 발암에 대 한 위험에서 우리를 박 았 죽음. 게놈 충실도 보호 하기 위해 포유류 세포는 복잡 한 일련의 단백질 연결 및 수정 된 DNA 손상 응답 하 진화 했다. 이 응답은 여러 통로, DNA 손상 응답 (DDR)2,3로 총칭으로 구성 됩니다. DNA 병 변, 일시적으로 그리고 공간 조정에 DNA 수 선 단백질의 축적은 DDR에 의하여 이루어져 있다. DDR 자주 전파 또는 손상 된 DNA2,,45의 복제 하는 동안 발생할 수 있는 손상의 강화를 피하기 위해 세포 주기 검거를 유도 합니다. 차례 차례로, 그것은 또한 수리 완료 된 후 복구 단지를 분리 하 여 세포 주기 검거를 세포 생존에 필요한.
DNA 손상의 다양 한 종류 중에서 DSBs는 가장 해로운. DSBs 복구 실패 염색체 재배열 또는 전체 염색체 ....
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프로토콜
제발 참고,이 프로토콜은 작성 된-SceI 인식 사이트18를 포함 하는 U2OS 세포. 셀은 U2OS 필요가 없습니다 하지만-SceI 사이트를 포함 해야 합니다. 프로토콜 조정 (예를 들어, 셀 시드 및 보육 시간) 되도록 할 수 있습니다 사용 하는 세포의 종류에 따라.
1. 정의 DSB 수리 복잡 한 대형의 활동
- Confluent 85-90%까지 10cm 조직 문화 접시에 U20S DRGFP 세포를 성장 한다.
- 미디어를 제거 하 고 2 분에 대 한 EDTA의 3 mL에서 실 온 (RT)에서 품 어.
- 트립 신 1 mL를 EDTA를 대체 하 고 5 분 확인 셀에서 현미경으로 접시의 표면에서 분리는 37 ° C에서 품 어. 5 mL의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보충 된 트립 신을 무력화.
- 이 정지는 hemocytometer trypan 블루 제외 메서드를 사용 하 여 셀의 농도 결정 합니다.
- 시드 6 x 103 유리 하단 96 잘 접시 200 µ L에 셀/잘. 또는, 12 m m coverslips에 8....
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결과
그림 1 은 맥시 마/foci 정량화 ImageJ를 사용 하 여에 대 한 올바른 잡음 차별의 선택을 묘사 한다. DAPI의 병합 된 이미지 및 복구 단백질의 왼쪽된 패널에 있습니다. 그림 1A 90의 잡음 차별 보여준다 고 foci의 정확한 수를 표시 합니다. 핵 가장자리 (분홍색 화살표 표시)와 포커스 (노란색 화살표가 그려져) 핵 외부에 정량화 하는 동안 포함 되지 않습니다. 그림 1B 50의 저 잡음 내성 묘사. 수많은 맥시 마 핵 외부와 핵 내에서 식별 됩니다. 그림 1 c 220의 높은 소음 허용 오차를 보여 줍니다. 오직 하나의 초점 (흰색 화살표) 검색 되었습니다. 독자 "긍정적인"와 "부정적인" 결과 제공, 우리는 또한
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토론
DNA의 분석 손상 수리 일반적 이며 이중 가닥 DNA 틈의 수리 구체적으로 연구의 활성 영역 그 결과 기본적인 생물학6,20tumorigenesis 범위 때문에. 이 원고 세부 사항 정확 하 게 dissects 시간 기대,이 방법을 통해 DSBs 해상도 RAD51 및 γ-H2AX 단백질의 기여 하는 방식 명료 DSBs14수리 단백질의 추가 기능을 사용할 수 있습니다. 복구 활동의 비교와, 기 절 하는 관심사의 단백질으로 수리 기계 제어 셀과 셀 간의 난-SceI 유도 DSBs의 채용 모집, 지역화에 그 단백질의 기여를 정의 하 고 해상도 DSBs 수리 요인입니다.
시각화 복구 활동 일반적으로 사용 되는 접근에 몇몇 이점이 있다. 자주, 수리는 어셈블리의 동적 과정과 수리 단지의 분리를 나타내는 수 단일 시간 지점에서 조사 이다. 전.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 조 엘 Sanneman와 박사 Philine Wangemann에 의해 캔자스 주립 대학 대학의 수의학,이 기술을 개발 하기 위해 노력에의 그들의 지원에 대 한 자금 Confocal 현미경 코어의 감사 합니다. pCBASceI 마리아 Jasin (Addgene 플라스 미드 # 26477)에서 선물 했다 30. U2OS 박사-GFP 셀 마리아 Jasin18종류 선물 했다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12mm 커버슬립 | VWR | 89015-725 | |
| 16% 파라포름알데히드(PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24웰 플레이트 | VWR | 82050-892 | |
| 96웰 유리 바닥판 | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51(D4B10) | 세포 신호 기술 | 8875S | |
| Bio-formats 플러그인 ImageJ | National Institute of Health (NIH) | ||
| https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html 소 혈청 알부민 (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, 고포도 | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| 염소 안티-래빗 IgG Alexa594 | ThermoFisher 과학 | A-11012 | |
| 과산화수소 | 시그마-알드리치 | 216763-100ML | |
| ImageJ 소프트웨어 | 국립 보건원(NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| SceI 발현 벡터 | Addgene | 26477 | |
| 매니큐어 - 인스타 드리 | 샐리 앤 한센 | 클리어리 퀵 (103) | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | 바이오 베이직 | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade 시약 | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| 트립신-EDTA | 시그마-알드리치 | T4049-500ML | |
| TurboFect 트랜스펙션 시약 | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| 트윈-20 | 피셔 사이언티픽 | BP337-500 |
참고문헌
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J.
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재인쇄 및 허가
