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방법 논문

Li Fraumeni 증후군 환자에서 파생 된 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 다리를 모델링

8.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57664

⸱

2018년 6월 13일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth, 3Department of Musculoskeletal Oncology, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4Women's Health Institute, Cleveland Clinic Foundation, 5Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine for the Prevention of Human Diseases, The University of Texas Health Science Center at Houston, 6Center for Precision Health, School of Biomedical Informatics and School of Public Health, The University of Texas Health Science Center at Houston

이 논문에서

요약

여기, 우리 제시 프로토콜 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대에 대 한 Li Fraumeni 증후군 (LFS) 환자 파생된 섬유 아 세포, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)를 통해 Ipsc의 차별화에서에서 osteoblasts, 및 모델링 비보 tumorigenesis LFS 환자 파생 osteoblasts를 사용 하 여입니다.

초록

Li Fraumeni 증후군 (LFS)는 상 염색체 지배적인 유전 암 질환 이다. LFS 환자는 종양, 다리-유년기와 청소년 기에 가장 빈번한 기본 비 혈액 악성 종양 중 하나를 포함 하 여 다양 한 유형의 predisposed 이다. 따라서, LFS이이 악성을 공부 하는 이상적인 모델을 제공 합니다. IPSC 방법론의 활용 LFS 연결 다리 LFS 환자 Ipsc 중간 엽 줄기 세포 (MSCs), 그리고 osteoblasts-osteosarcomas에 대 한 원래 셀을 차별화 하 여 성공적으로 모델링할 수 있다. 이러한 LFS osteoblasts 다리, 다리의 병 인을 묘사 하는 매력적인 모델 시스템 제공의 종양 속성 정리. 이 원고는 LFS 환자 fibroblasts, MSCs osteoblasts을 vivo에서 tumorigenesis LFS osteoblasts를 사용 하 여 MSCs의 차별화를 Ipsc의 차별화에서에서 Ipsc의 세대에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다. 잠재적인 생체 또는 LFS 연결 다리에 대 한 치료 목표를 식별 하이 iPSC 질병 모델을 확장할 수 있습니다.

서론

2006 년과 2007 년 사이 여러 획기적인 결과 박사 신 야 야 마나카와 제임스 A. 톰슨의 실험실에서 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)1,2,3의 개발을 주도. 양식 Ipsc에 정의 된 transcriptional 요인과 체세포 프로그래밍, 연구팀은 즉 주요 특성을 가진 세포를 생성할 수 있었다, pluripotency, 및 자기 갱신, 이전에 생각 되었다 인간 배아 줄기 세포에 존재 (hESCs)입니다. Ipsc 어떤 개인 이나 환자에서 생성 될 수 있는 고 배아, 광대 하 게 사용 가능한 질병 및 배경 연구에 대 한 레 퍼 토리를 확장에서 파생 될 필요가 없습니다. 이후로, 환자 파생 Ipsc Alzheimer의 질병4 와 루 경화 증5 긴 QT 증후군6,7, 에서 다양 한 인간 질병의 표현 형을 정리 하는 데 사용 되었습니다. 8.

IPSC 연구이 진보는 또한 암 연구를 위한 새로운 길을 열었습니다. 여러 그룹 최근 사용 환자 Ipsc는 취약 유전 배경9,,1011, 모델 암 개발에 다리9, 날짜에 성공적인 응용 프로그램 백혈병10,,1112, 그리고 대 장 암13. IPSC 파생 암 모델 그들의 초기에서 여전히 있지만, 그들은 phenocopying 질병 관련 된 악성 종양, 병 적인 메커니즘 elucidating 고 치료 화합물14를 식별에 큰 잠재력을 증명 하고있다.

Li Fraumeni 증후군 (LFS) TP53 생식 돌연변이15에 의해 발생 하는 상 염색체 지배적인 유전 암 질환 이다. LFS 환자는 악성 다리를 포함 하 여 다양 한 유형의 predisposed 이다 만들고 LFS Ipsc 그들의 파생된 셀이 종은16공부에 특히 적합. 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)로 분화 이후 LFS 환자 파생 Ipsc9 를 사용 하 여 및 다음 osteoblasts, 원본 세포는 iPSC 기반 다리 모델 처음 2015 년에 설립 되었다 다리의. 이러한 LFS osteoblasts osteogenic 차별화 다리 관련 결함 및 종양 속성, "접시에 뼈 종양" 플랫폼으로 서 잠재적인 모델을 보여주는 정리. 흥미롭게도, 게놈 전체 transcriptome 분석 공개 LFS osteoblasts에 다리 유전자 서명의 측면 그리고 다리9, 빈약한 예 지와이 LFS 유전자 표현 프로필의 기능 상관 나타내는 임상 관련성의 기능을 LFS Ipsc 질병 모델의 가능성이 있습니다.

이 원고는 LFS 환자 파생 Ipsc 모델 다리를 사용 하는 방법에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 그것은 LFS Ipsc, Ipsc MSCs 그리고 osteoblasts, 하의 그리고 vivo에서 이 종이 식 사용 하는 모델 LFS osteoblasts의 사용의 세대를 자세히 설명 합니다. LFS 질병 모델은 몇 가지 이점이, 특히 기계 연구, 바이오 마커 식별 및 약9,14, 심사에 대 한 다리 개발의 모든 단계에서 무제한 세포를 생성 하는 기능 16.

요약 하자면, LFS iPSC 기반 다리 모델 다리 연구 진행을 위한 매력적인 보완 시스템을 제공 합니다. 이 플랫폼은 또한 암 모델링 Ipsc 환자 파생을 사용 하 여-의 증거-개념을 제공 합니다. 아래에 설명 된이 전략 모델 악성 암 선천적인와 다른 유전 질환과 관련 된을 쉽게 확장할 수 있다.

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프로토콜

이 작품의 텍사스 대학 보건 과학 센터 휴스턴 (UTHealth) 동물 복지 위원회에 의해 승인 되었다. 실험 실험 동물 의학 & 케어 (CLAMC)는 실험 동물 배려 (AAALAC 국제)에 대 한 미국의 협회 공인 UTHealth 센터 설립 기준에 따라 수행 됩니다. 이 연구에서 인체 NIH SF424 설명서에서 정의한 대로 시나리오는 ("아니 인간 대상 연구")가을. 따라서, 그것은 UTHealth 인간의 연구 윤리 위원회에 의해 어떤 승인이 필요 하지 않습니다.

1. LFS Ipsc (그림 1A)의 생성

  1. 날-2, 6-잘 접시의 한 잘에 2 × 104 LFS 환자 fibroblasts 접시 하 고 37 ° c 습도 5%에서 섬유 매체 (표 1)와 셀 문화 CO2 배양 기. 섬유 아 세포 변환 (0 일)의 하루에 50-60% 합류에 도달 하는지 확인 합니다.
  2. 0에 센다이 바이러스 변환을 수행 합니다. 이렇게 하려면 보낸된 매체를 미리 데워 진된 섬유 매체 바꿉니다. 얼음에 ( 재료의 표참조) 키트 바이러스 프로그래밍 상업 센다이 녹여 LFS fibroblasts 제조업체의 지침에 따라 혼합 센다이 바이러스 감염.
  3. 섬유 매체 (주 1-6)에 transduced 셀의 유지 보수:
    1. 하루 1, 변환, 후 24 h에 나머지 센다이 바이러스를 포함 하는 섬유 매체를 제거 하 고 2 mL 신선한 섬유 매체와 그것을 대체 합니다. 37 ° c 습도 5%에서 transduced fibroblasts 문화 CO2 배양 기.
    2. 매일 하루 2-6에서에서 섬유 매체와 매체를 변경 합니다.
  4. Transduced 셀 피더 문화 조건 (하루 7-28)의 유지 보수:
    1. 준비 조사 CF1 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 문화 요리 주 6. 이 코트 할 30 분에 대 한 실 온에서 각 플레이트를 0.1% 젤라틴의 5 mL을 추가 하 여 6 개의 100 m m 조직 문화 요리 0.1% 젤라틴 코팅 후 발음.
    2. 액체 질소 용기에서 MEFs를 제거 합니다. 제조업체의 지침에 따라 상용 녹고 시스템을 사용 하 여 MEFs 녹여 100 m m 조직 문화 접시 당 105 셀 x 6.7 주위의 시드 밀도에 젤라틴 코팅 접시에 셀 MEF/MSC 문화 매체 (표 1) 접시.
    3. MEF 접시 (7 일)에 transduced 세포 접종: 0.25%의 1 mL를 사용 하 여 transduced 셀 Trypsinize 트립 신-EDTA 실 온에서 2-4 분 100 mm 접시 당. 트립 신 구와 매체의 9 mL를 중화. 원뿔 관에 전송 셀 및 4 분 37 ° C에서 230 x g에서 원심 분리기 세포 transduced fibroblasts 주 6에는 6 개의 MEF 요리에 접시 접시 당 섬유 매체의 8 mL에 문화.
      참고: MEFs의 confluency는 약 20 %MEF 접시에 불리고 셀을 뿌리기 전에.
    4. 8 일에 섬유 매체를 삭제 하 고 hESC 매체 (표 1)으로 바꿉니다.
    5. (그림 1C) 일 9 월 28 일에서에서 iPS 클론의 출현을 기다립니다. 매일 지출된 hESC 매체를 변경 하 고 현미경 iPS 클론의 출현을 모니터링. Ipsc 클론 맨 눈으로 관찰할 수 있을 만큼 큰 때까지 기다립니다 고 피더 무료 문화 조건에 iPS 클론 확장을 진행 합니다.
  5. 등장된 iPS의 확장 급지대 무료 문화 조건에 클론 (주 29-79 ~ 99):
    1. 매트릭스-코팅 접시를 준비 하려면 잘 당 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 솔루션 (표 1)의 120 µ L와 48-잘 접시 코트. 지하실 막 매트릭스 코팅 솔루션 잘 커버 하 고 문화 접시 표면 코트 다는 것을 확인 하십시오. 즉시 사용 하기 전에 코팅 솔루션 1 h. Aspirate에 대 한 실 온에 둬 고 2 µ M 바위 억제제 Thiazovivin와 당 hESC 매체의 250 µ L를 추가 합니다.
    2. 하루 28에서 보낸된 hESC 중간 발음 하 고 iPS 클론 1 x DPBS 세척 합니다. 보이는 iPS 클론 1 mL 피 펫 팁 및 치료 48-잘 접시 (단계 1.4.1)의 우물으로 이동을 선택 합니다. 48-잘 접시의 당 종자 한 식민지.
    3. 셀 첨부 파일을 촉진 하기 위하여 4 분 230g x에서 격판덮개 원심 37 ° c 습도 5%에서 iPS 클론 문화 CO2 배양 기.
    4. 다음 날 (29 일), 지출된 hESC 매체를 제거 하 고 각 잘에서 상용 iPSC 매체의 250 µ L를 추가 합니다.
    5. 37 ° c 습도 5%에서 iPS 클론 유지 CO2 배양 기, 그리고 변경 iPSC 매체 매일.
    6. 하위 1시 10분에서 세포 iPS 클론 85% 합류에 도달, 문화 영역에서 비율. 세포를 분리 하 여 3 분 동안 37 ° C에서 품 어 상업 passaging 솔루션의 60 µ L를 추가 합니다.
    7. 2 µ M 바위 억제제 Thiazovivin와 hESC 매체의 1 mL에 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 12-잘 접시에 분리 Ipsc의 씨앗. 1시 10분에서 잘하고 subculture Ipsc 당 상용 iPSC 매체의 1 mL와 함께 12-잘 접시에 iPS 클론 문화 비율 통로 10를 도달할 때까지.
      참고: Ipsc는 교양 1시 10분에 5-7 일 마다 하위 비율. 그것은 통로 10 도달 iPS 클론에 대 한 10 주까지 걸립니다. iPSC characterizations 셀 형태학, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 활동, 및 pluripotency 요인과 hESC 마커, 표현의 Ipsc (일반적으로 약 10 후 시연에 센다이 바이러스의 제거를 확인 한 후에 시험 될 수 있다 구절) (그림 1B-E) IPSC 특성화에 대 한 항 체 및 뇌관 정보는 표 2 와 4에 포함 됩니다.

2. 차별화 LFS Ipsc 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) (그림 2A)에

  1. 적어도 2 주 동안 MEF 접시에 복제 하 문화 iPSC (하루 ~-14-0): 앞에서 설명한 MEF 요리 (100 m m 조직 문화 접시) 준비 (1.3.1-1.3.2). Ipsc hESC 매체에 유지 하 고 매일 매체를 변경. 때마다 Ipsc 도달 90% 합류, subculture Ipsc 1:10 희석.
  2. Ipsc (0 일)에서 MEFs의 제거:
    1. Ipsc MEFs에 2 주 동안 유지, 후 셀까지 100 m m 조직 문화 요리에서 문화 Ipsc 합류 80-90%에 도달 합니다. 보낸된 hESC 매체를 제거 하 고 1 x DPBS의 5 mL와 Ipsc를 씻어. 세포를 분리 하 여 3 분 동안 실 온에서 품 어 세포 분리 솔루션의 1 mL를 추가 합니다.
    2. 세포 분리 솔루션 활동을 중화 하 고 어떤 코팅 없이 새로운 100 m m 조직 문화 접시에 분리 된 세포를 전송 하는 접시 MEF/MSC 문화 매체의 9 mL를 추가 합니다.
    3. 접시에 연결할 MEFs 수 있도록 30 분 동안 실내 온도에 세포를 품 어.
    4. 신중 하 게 첨부 되지 않은 Ipsc, 및 4 분 4 ° C에서 230 x g에서 원심 분리기를 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다.
      참고: MEFs의 분리를 리드 살짝 접시 바닥을 홍 조.
  3. MSCs (하루 0-28)를 향해 Ipsc의 차별화:
    1. 30 분 동안 실내 온도에 잘 당 0.1% 젤라틴의 1 mL와 함께 6 잘 플레이트의 3 웰 스 코트.
    2. 2.2.4에서 수집된 Ipsc의 상쾌한을 제거 합니다.
    3. 잘 (0 일) 당 2 mL와 MSC 차별화 매체 (표 1) 및 3 개의 코팅 스 씨 셀의 6 ml에서 Ipsc resuspend.
    4. 연결 되지 않은 및 죽은 세포 (주 1-28)를 제거 하 MSC 차별화 매체 매 2 일 변경.
  4. IPSC 파생 MSCs (하루 28-45)의 성숙:
    1. 보낸된 MSC 차별화 매체를 제거 하 고 씻어 1 x DPBS의 1 mL로 세포.
    2. 0.25%의 0.5 mL와 MSCs trypsinize 트립 신-EDTA 3 분 동안 실내 온도에 잘 당.
    3. MEF/MSC 문화 매체의 1.5 mL에 의해 트립 신을 무력화 하 고 한 15 mL 원뿔 튜브에 3 개의 우물에서 MSCs를 수집 합니다. 4 분 4 ° C에서 230 x g에서 원심 분리기.
    4. 제거는 상쾌한 고 MEF/MSC 문화 매체와 한 60 m m 0.1% 젤라틴 코팅 접시 (28 일)에 격판덮개의 3 mL에서 MSCs를 resuspend.
    5. MEF/MSC 문화 매체에서 MSCs 문화 그리고 매체 매 2 일 변경. 셀 100% 합류, 0.25%를 사용 하 여 1:3 비율로 subculture MSCs를 도달 하는 때 트립 신-EDTA.
      참고: MSCs 표시 구와 같은 형태 (그림 2B). MSCs는 고밀도에 성장, 길쭉한 MSCs 소용돌이 모양의 패턴 (그림 2B)를 형성할 수 있습니다.
    6. MSC 표면 마커 CD44, CD73, CD105, 및 CD166를 검사 하 여 iPSC 파생 MSCs를 평가 하기 위해 immunofluorescent 얼룩 수행 (그림 2C).
      참고: 항 체의 희석 표 2에 표시 됩니다. 라이브 셀의 immunofluorescent 얼룩 제조업체의 지침에 따라 수행 됩니다.
    7. 확인 후 100 m m 조직 문화 요리에서 1:3 비율로 MSCs를 확장 합니다. 튜브 (100 m m 조직 문화 접시 당 3 튜브) 아래로 고정 10 %DMSO 90%를 포함 하는 동결 매체를 사용 하 여 FBS.
      참고: MSC 인구 풍부 하 MSCs 정렬할 수 있습니다 CD105를 사용 하 여+, CD24-조건 흐름 cytometry9,17. iPSC 파생 MSCs 분화 PDGF AB-기반 메서드를 사용 하 여 일반적으로 MSC 정체성9의 손실 없이 문화에 2-3 개월 동안 유지할 수 있습니다. MSC 특성을 확인 한 후 초기 통로 번호에서 MSCs를 고정 합니다.

3. Osteoblasts (그림 3A)를 LFS MSCs의 차별화

  1. MSCs osteogenic 차별화 (주-1)에 대 한 준비
    1. Osteogenic 분화 프로토콜을 완료 하려면 셀의 충분 한 수량을 유지 하려면 100 m m 조직 문화 요리 95% 합류를 경작 하는 MSCs로 시작 합니다. 소비 문화 매체를 제거 하 고 1 x DPBS의 5 mL와 MSCs를 씻어.
    2. 3 분 동안 실 온에서 100 mm 접시 당 0.25% trypsin EDTA의 1 mL와 MSCs를 trypsinize. 셀 이상 trypsinized 하지 있도록 셀 초연의 50%는 현미경 관찰 trypsinization 중지.
    3. MEF/MSC 문화 매체의 9 mL에 의해 트립 신을 무력화 하 고 한 15 mL 원뿔 튜브로 3 우물에서 MSCs를 수집 합니다. 4 분 4 ° C에서 230 x g에서 원심 분리기.
    4. 발음은 상쾌한, MSC 매체의 5 mL에 MSCs를 resuspend 하 고 셀의 수를 계산 하는 hemocytometer에 의해.
    5. 플레이트 문화 접시에 MSCs의 적절 한 번호
      참고: 셀 수가 12-잘 접시, 6 잘 플레이트, 그리고 100 m m 조직 문화 접시의 표 3에 요약 되어 있습니다.
  2. Osteoblast 차별화 매체 (ODM) (표 1) (0-24 일)에 의해 osteogenic 분화의 유도:
    1. MEF/MSC 문화 매체를 발음 하 고 ODM의 적절 한 볼륨으로 바꿉니다 (1 mL, 2 mL와 8 mL 12-잘 접시의 각 잘, 6 잘 플레이트, 그리고 100 m m 조직 문화의 각 음에 대 한 접시, 각각) osteoblasts (0 일)를 MSCs를 차별화 하는 데.
    2. 보낸된 ODM 발음 고 osteogenic 차별화 과정에서 매 2 일 ODM의 적절 한 볼륨으로 바꿉니다.
    3. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP)를 수행 하 고 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 및 24 ( 일에 알리자린 레드 S (ARS) 뼈 관련 알칼리 성 인산 가수분해 효소 preosteoblasts에 의해 생산 및 무기물 공 술 서 제작한 감지 하 얼룩 성숙 osteoblasts, 각각, 그림 3B).
      참고: AP 얼룩 및 ARS 얼룩 상용 키트 다음 제조 업체 프로토콜을 사용 하 여 수행 됩니다.
    4. Preosteoblast 하 고 성숙한 osteoblast 마커 (ALPL 및 preosteoblasts;에 대 한 COL1A1 식 수준 검사 PTH1R 및 BGLAP에 대 한 성숙 osteoblasts) qRT-PCR (그림 3C)에 의해.
      참고: 긍정적인 AP 얼룩이 지는 하루 9 osteogenic 차별화의 후와 긍정적인 ARS 얼룩 osteogenic 차별화의 날 21 후 예상 될 수 있다. MSCs MEF/MSC 문화 매체에 성장 AP 얼룩 및 ARS 얼룩의 부정적인 컨트롤로 제공 됩니다.

4. LFS MSC 파생 Osteoblasts (그림 4A)의 Tumorigenesis Vivo에서 공부를 종이 식 모델

  1. Osteoblasts LFS MSCs의 차별화:
    1. 시드 3-4.5 x 100 m m 조직 문화 접시에 105 MSCs입니다. 1 피하 주입에 대 한 5 개의 요리를 준비 합니다.
    2. 하루 14까지 3.2에 설명 된 대로 osteoblasts를 MSCs를 차별화 하는 ODM에 문화 MSCs.
  2. 피하 주사에 대 한 차별화 된 osteoblasts의 준비:
    1. Osteoblast 분리 솔루션 (표 1)를 준비 하려면 1 g 유형 II 콜라 콜라 II 솔루션 (1 mg/mL) αMEM 매체의 1000 mL에 녹. -20 ° c.에 콜라 II 솔루션을 유지 0.25% 믹스는 osteoblasts 분리 솔루션으로 만들기 위해 트립 신-EDTA와 1:1 비율로 콜라 II 솔루션.
    2. 보낸된 ODM를 제거 하 고 100 mm 접시 당 1 x DPBS의 5 mL와 함께 차별화 된 osteoblasts 세척.
    3. 100 mm 접시 당 osteoblast 분리 솔루션의 1.5 mL를 추가 하 고 요리 30 분 검사에 대 한 37 ° c를 품 어 현미경 검사 법에 의해 osteoblast 분리를 보장.
    4. ODM에 의해 osteoblasts 분리 솔루션을 무력화 하 고 50 mL 원뿔 튜브에서 분리 osteoblasts 수집 합니다. 5 분 동안 4 ° C에서 230 x g에서 원심 분리기.
    5. 상쾌한을 제거 하 고 ODM 매체의 25 mL에 있는 세포를 resuspend. 집계 된 세포를 제거 하는 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포를 전달 합니다. hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
    6. 1 x 107 osteoblasts 피하 주입, 및 4 ° C에서 230 x g에서 원심 분리기 세포 당 4 분에 대 한 준비.
    7. 50 µ L 얼음 1에에서 1 × 107 osteoblasts resuspend x DPBS. 믹스는 osteoblasts 페 놀 레드 무료 지하실 멤브레인 매트릭스 (osteoblasts 펜션과 지하실 멤브레인 매트릭스 1:1 비율로 혼합)의 50 µ L로 분화 하 고 주입 전에 얼음 osteoblasts를 유지 합니다.
  3. Vivo에서 이 종이 식 종양 모델 LFS MSC 파생 osteoblasts의:
    1. 1 L/min의 산소 (CLAMC에서 제공)에서 5% (v/v) 흡입 isoflurane 공급 챔버에 8 주 오래 된 여성 immunocompromised 뉴/뉴 마우스 anesthetize 동물 휴식 후, 원뿔, 공급 200 mL/min의 산소 (CLAMC에서 제공)에서 2% (v/v) 흡입 isoflurane 마 취 전달 시스템 전환 합니다. 쥐를 만들기 위해 각 막 및 페달 반사 충분히 마 취 및 수술 중 불편에서 고통을 하지 확인 하 여 마 취의 깊이 모니터링 합니다.
    2. 액체 및 70% 소 프로 파 놀의 대체 면봉으로 주입 영역을 치료. 26 G 바늘을 사용 하 여 8 주 된 immunocompromised 뉴/뉴 마우스 (그림 4A)의 뒷 다리의 한쪽으로 지하실 멤브레인 매트릭스 혼합 LFS osteoblasts의 피하 주사를 수행.
    3. 피하 결 밀도의 성장을 위한 사출 사이트에서 주간 촉진을 수행 하 여 마우스를 모니터링 합니다. 종양의 형성 (그림 4B) 주입 후 약 6-10 주를 관찰할 수 있습니다.
    4. 뒤에 자 궁 경부 전위 이산화탄소 질 식 방법으로는 마우스를 안락사. 개발 된 종양을 해 부. 다양 한 착 색 방법 (예: Hematoxylin과 오신 (H & E) 얼룩, Picro 시리우스 레드 얼룩, 및 von Kossa 각각 얼룩)으로 종양 급료와 차별화 인덱스, preosteoblasts, 및 성숙한 osteoblasts를 결정 합니다.

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결과

이 프로토콜 등 LFS iPSC 세대, MSC 차별화, osteoblast 차별화, vivo에서 tumorigenesis 분석 결과 osteoblasts LFS MSC 파생을 사용 하 여 절차를 제공 합니다.

LFS Ipsc 키트 프로그래밍 상용 센다이 바이러스를 사용 하 여 섬유 아 세포에서의 세대에 대 한 스키마는 그림 1A에 표시 됩니다. 야 마나카 4 요인의 센다이 바이러스 기반 배달 비 통합 재활 방법입니다. 따라서, 안정적인 LFS iPSC 클론 센다이 바이러스 게놈 및 외 인 OCT4, SOX2, KLF4, 및 특정 뇌관 (그림 1B)를 사용 하 여 RT-PCR에 의해 시험 될 수 있는 c-MYC transgenes의 손실의 무료...

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토론

MSC 차별화 능률을 달성 하기 위해 여러 측면은 중요 합니다. 하나는 MSC 차별화를 시작 하기 전에 Ipsc의 문화 상태 이다. 원고에 제시 하는 프로토콜은 이전 연구 9,17를 기반으로 합니다. Ipsc는 적어도 2 주 동안 MEFs에 교양 있이 필요가 있다. 유지 좋은 Ipsc MEFs에 조건은 MSC 차별화 젤라틴 코팅 접시에 연결할 셀에 대 한 중요 한입니다. 또 다른 중요 한 측면은 차별 전에 MEFs에 Ipsc의 밀도. 80-Ipsc의 90% confluency MSC 차별화 시작 선호 된다. Ipsc의 자라 난 차별화 과정에서 세포 생존에 악영향을 줄 것 이다. MSC 차별화를 시작할 때 마지막 중요 한 포인트는 시드 밀도입니다. 우리의 손, 높은 세포 밀도 iPSC 젤라틴 코팅 접시에 첨부 파일을 촉진합니다. 한 100 mm 접시 Ipsc 6 잘 플레이트의 세 우물에 시드할 수 있습니다. 직접 resuspe...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

R. Z. 친목을 위한 암 예방 연구 훈련 프로그램 Pre-Doctoral (암 예방과 연구 연구소의 텍사스 RP160015 부여) UTHealth 혁신에 의해 지원 됩니다. Jt는 첫 번째 제휴 병원의 썬 얏-센 대학교의 애 린 프로그램에 의해 지원 됩니다. D. 플로리다 암 연구에서 CPRIT 학자 이며 독립 수상 R00 CA181496 및 CPRIT 수상 RR160019 NIH 통로에서 지 원하는.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
플라스틱 제품
100 mm 디쉬코닝430107
60 mm 디쉬코닝430166
6웰 플레이트Falcon353046
12웰 플레이트Falcon353043
48웰 플레이트Falcon353078
1 mL 피펫 팁USA Scientific1111-2721
200 &마이크로; L 피펫 팁USA Scientific1111-0706
10 &마이크로; L Pipet TipUSA Scientific1111-3700
5 mL 혈청학적 피펫SARSTEDT86.1253.001
10 mL 혈청학적 피펫SARSTEDT86.1254.001
25 mL 혈청학적 피SARSTEDT86.1685.001
50 mL 튜브, PPSARSTEDT62.547.100
15 mL 튜브, PPSARSTEDT62.554.100
Culture materials and Reagents
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitInvitrogenA16517상업용 센다이 바이러스 재프로그래밍 키트
Corning hESC 인증 매트릭스Corning354277Basement membrane matrix
CF1 MEFs, 방사선 처리ThermoFisherA34180
DMEM시그마-알드리치D5671
DMEM/F12코닝10-090-CV&
알파; MEMCorning10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368상업용 iPSC 매체
녹아웃 DMEM/F-12ThermoFisher12660012
FBS Opti-GoldGenDEPOTF0900-050
녹아웃 혈청 대체품ThermoFisherA3181502
페니실린-스트렙토마이신시그마-알드리치P4333
MEM 비필수 아미노산코닝25-025-CI
L-글루타민 용액시그마-알드리치G7513
2-메르캅토에탄올시그마-알드리치M3148
인간 FGF-basic (bFGF)PEPROTECH100-18B
재조합 인간 PDGF-ABPEPROTECH100-00AB
β-글리세로인산시그마-알드리치G9422,
덱사메타손, 시그마-알드리치A4902
아스코르브산시그마-알드리치A5960
둘베코의 인산염 완충 식염수, 1x (DPBS)Corning21-031-CV
StemMACS 패스에이징 솔루션, XFMiltenyi Biotec130-104-688상업용 패시에이징 솔루션
Accutatse 세포 분리 솔루션Corning25-058-CI세포 분리 솔루션
Thiazovivin (ROCK 억제제)Calbiochem420220
0.25% Trypsin-EDTA 솔루션Sigma-AldrichT4049
콜라겐분해효소, Type II   ThermoFisher17101015
Human NANOG 항체R& D SystemAF1997
OCT4 항체 (H-134)Santa Cruzsc-9081
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated 항체R& D 시스템FAB1435P
Alexa Fluor 555 마우스 Anti-Human TRA-1-81 AntigenDB Biosciences560123
Alexa Fluor 488 당나귀 Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-545-003
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-545-144
PE 마우스 Anti-Human CD105eBioscience12-1057-42
FITC 마우스 안티휴먼 CD44DB 바이오사이언스555478
PE 마우스 안티휴먼 CD73DB 바이오사이언스550257
PE마우스 안티휴먼 CD166DB 바이오사이언스560903
FITC 마우스 안티휴먼 CD24DB 바이오사이언스555427
동키세럼잭슨 면역연구017-000-121
염소 혈청Jackson ImmunoResearch005-000-121
알칼리 포스파타제 염색 키트 IIStemgent00-0055
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
TRIzol 시약ThermoFisher15596018
클로로포름ThermoFisherC298-500
2-프로판올ThermoFisherA416-4
에탄올, 절대, 분자 생물학 등급ThermoFisherBP28184
DNase I, RNase-free(1 U/µ L)ThermoFisherEN0521
iScript cDNA 합성 키트BioRad1708891BUN
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708884
Matrigel Matrix 고농도(HC), 페놀-레드 프리코닝354262
1mL 슬립 팁 주사기, 26 게이지 x 5/8인치DB Biosciences309597
펫 염, , , , , , , ,

참고문헌

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