여기, 우리 제시 프로토콜 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대에 대 한 Li Fraumeni 증후군 (LFS) 환자 파생된 섬유 아 세포, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)를 통해 Ipsc의 차별화에서에서 osteoblasts, 및 모델링 비보 tumorigenesis LFS 환자 파생 osteoblasts를 사용 하 여입니다.
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이 논문에서
요약
초록
Li Fraumeni 증후군 (LFS)는 상 염색체 지배적인 유전 암 질환 이다. LFS 환자는 종양, 다리-유년기와 청소년 기에 가장 빈번한 기본 비 혈액 악성 종양 중 하나를 포함 하 여 다양 한 유형의 predisposed 이다. 따라서, LFS이이 악성을 공부 하는 이상적인 모델을 제공 합니다. IPSC 방법론의 활용 LFS 연결 다리 LFS 환자 Ipsc 중간 엽 줄기 세포 (MSCs), 그리고 osteoblasts-osteosarcomas에 대 한 원래 셀을 차별화 하 여 성공적으로 모델링할 수 있다. 이러한 LFS osteoblasts 다리, 다리의 병 인을 묘사 하는 매력적인 모델 시스템 제공의 종양 속성 정리. 이 원고는 LFS 환자 fibroblasts, MSCs osteoblasts을 vivo에서 tumorigenesis LFS osteoblasts를 사용 하 여 MSCs의 차별화를 Ipsc의 차별화에서에서 Ipsc의 세대에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다. 잠재적인 생체 또는 LFS 연결 다리에 대 한 치료 목표를 식별 하이 iPSC 질병 모델을 확장할 수 있습니다.
서론
2006 년과 2007 년 사이 여러 획기적인 결과 박사 신 야 야 마나카와 제임스 A. 톰슨의 실험실에서 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)1,2,3의 개발을 주도. 양식 Ipsc에 정의 된 transcriptional 요인과 체세포 프로그래밍, 연구팀은 즉 주요 특성을 가진 세포를 생성할 수 있었다, pluripotency, 및 자기 갱신, 이전에 생각 되었다 인간 배아 줄기 세포에 존재 (hESCs)입니다. Ipsc 어떤 개인 이나 환자에서 생성 될 수 있는 고 배아, 광대 하 게 사용 가능한 질병 및 배경 연구에 대 한 레 퍼 토리를 확장에서 파생 될 필요가 없습니다. 이후로, 환자 파생 Ipsc Alzheimer의 질병4 와 루 경화 증5 긴 QT 증후군6,7, 에서 다양 한 인간 질병의 표현 형을 정리 하는 데 사용 되었습니다. 8.
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프로토콜
이 작품의 텍사스 대학 보건 과학 센터 휴스턴 (UTHealth) 동물 복지 위원회에 의해 승인 되었다. 실험 실험 동물 의학 & 케어 (CLAMC)는 실험 동물 배려 (AAALAC 국제)에 대 한 미국의 협회 공인 UTHealth 센터 설립 기준에 따라 수행 됩니다. 이 연구에서 인체 NIH SF424 설명서에서 정의한 대로 시나리오는 ("아니 인간 대상 연구")가을. 따라서, 그것은 UTHealth 인간의 연구 윤리 위원회에 의해 어떤 승인이 필요 하지 않습니다.
1. LFS Ipsc (그림 1A)의 생성
- 날-2, 6-잘 접시의 한 잘에 2 × 104 LFS 환자 fibroblasts 접시 하 고 37 ° c 습도 5%에서 섬유 매체 (표 1)와 셀 문화 CO2 배양 기. 섬유 아 세포 변환 (0 일)의 하루에 50-60% 합류에 도달 하는지 확인 합니다.
- 0에 센다이 바이러스 변환을 수행 합니다. 이렇게 하려면 보낸된 매체를 미리 데워 진된 섬유 매체 바꿉니다. 얼음에 ( 재료의 표참조) 키트 바이러스 프로그래밍 상업 센다이 녹여 LFS fibrobl....
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결과
이 프로토콜 등 LFS iPSC 세대, MSC 차별화, osteoblast 차별화, vivo에서 tumorigenesis 분석 결과 osteoblasts LFS MSC 파생을 사용 하 여 절차를 제공 합니다.
LFS Ipsc 키트 프로그래밍 상용 센다이 바이러스를 사용 하 여 섬유 아 세포에서의 세대에 대 한 스키마는 그림 1A에 표시 됩니다. 야 마나카 4 요인의 센다이 바이러스 기반 배달 비 통합 재활 방법입니다. 따라서, 안정적인 LFS iPSC 클론 센다이 바이러스 게놈 및 외 인 OCT4, SOX2, KLF4, 및 특정 뇌관 (그림 1B)를 사용 하 여 RT-PCR에 의해 시험 될 수 있는 c-MYC transgenes의 손실의 무료.......
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토론
MSC 차별화 능률을 달성 하기 위해 여러 측면은 중요 합니다. 하나는 MSC 차별화를 시작 하기 전에 Ipsc의 문화 상태 이다. 원고에 제시 하는 프로토콜은 이전 연구 9,17를 기반으로 합니다. Ipsc는 적어도 2 주 동안 MEFs에 교양 있이 필요가 있다. 유지 좋은 Ipsc MEFs에 조건은 MSC 차별화 젤라틴 코팅 접시에 연결할 셀에 대 한 중요 한입니다. 또 다른 중요 한 측면은 차별 전에 MEFs에 Ipsc의 밀도. 80-Ipsc의 90% confluency MSC 차별화 시작 선호 된다. Ipsc의 자라 난 차별화 과정에서 세포 생존에 악영향을 줄 것 이다. MSC 차별화를 시작할 때 마지막 중요 한 포인트는 시드 밀도입니다. 우리의 손, 높은 세포 밀도 iPSC 젤라틴 코팅 접시에 첨부 파일을 촉진합니다. 한 100 mm 접시 Ipsc 6 잘 플레이트의 세 우물에 시드할 수 있습니다. 직접 resuspe.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
R. Z. 친목을 위한 암 예방 연구 훈련 프로그램 Pre-Doctoral (암 예방과 연구 연구소의 텍사스 RP160015 부여) UTHealth 혁신에 의해 지원 됩니다. Jt는 첫 번째 제휴 병원의 썬 얏-센 대학교의 애 린 프로그램에 의해 지원 됩니다. D. 플로리다 암 연구에서 CPRIT 학자 이며 독립 수상 R00 CA181496 및 CPRIT 수상 RR160019 NIH 통로에서 지 원하는.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 플라스틱 제품 | |||
| 100 mm 디쉬 | 코닝 | 430107 | |
| 60 mm 디쉬 | 코닝 | 430166 | |
| 6웰 플레이트 | Falcon | 353046 | |
| 12웰 플레이트 | Falcon | 353043 | |
| 48웰 플레이트 | Falcon | 353078 | |
| 1 mL 피펫 팁 | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 &마이크로; L 피펫 팁 | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 &마이크로; L Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL 혈청학적 피펫 | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL 혈청학적 피펫 | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL 혈청학적 피 | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL 튜브, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL 튜브, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | 상업용 센다이 바이러스 재프로그래밍 키트 |
| Corning hESC 인증 매트릭스 | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, 방사선 처리 | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | 시그마-알드리치 | D5671 | |
| DMEM/F12 | 코닝 | 10-090-CV& | |
| 알파; MEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | 상업용 iPSC 매체 |
| 녹아웃 DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| 녹아웃 혈청 대체품 | ThermoFisher | A3181502 | |
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| L-글루타민 용액 | 시그마-알드리치 | G7513 | |
| 2-메르캅토에탄올 | 시그마-알드리치 | M3148 | |
| 인간 FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| 재조합 인간 PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-글리세로인산 | 시그마-알드리치 | G9422, | |
| 덱사메타손 | , 시그마-알드리치 | A4902 | |
| 아스코르브산 | 시그마-알드리치 | A5960 | |
| 둘베코의 인산염 완충 식염수, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS 패스에이징 솔루션, XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | 상업용 패시에이징 솔루션 |
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| 콜라겐분해효소, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
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| Alexa Fluor 488 당나귀 Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE 마우스 Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC 마우스 안티휴먼 CD44 | DB 바이오사이언스 | 555478 | |
| PE 마우스 안티휴먼 CD73 | DB 바이오사이언스 | 550257 | |
| PE마우스 안티휴먼 CD166 | DB 바이오사이언스 | 560903 | |
| FITC 마우스 안티휴먼 CD24 | DB 바이오사이언스 | 555427 | |
| 동키세럼 | 잭슨 면역연구 | 017-000-121 | |
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| TRIzol 시약 | ThermoFisher | 15596018 | |
| 클로로포름 | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-프로판올 | ThermoFisher | A416-4 | |
| 에탄올, 절대, 분자 생물학 등급 | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, RNase-free(1 U/µ L) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA 합성 키트 | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix 고농도(HC), 페놀-레드 프리 | 코닝 | 354262 | |
| 1mL 슬립 팁 주사기, 26 게이지 x 5/8인치 | DB Biosciences | 309597 |
참고문헌
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult h....
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