감염 성 폐 렴은 인간에서 가장 일반적인 감염 중 하나입니다. 적절 한 생체 내에서 모델은 질병 병 인을 이해 하 고 새로운 치료제의 효능을 테스트 중요 합니다. 이 murine oropharyngeal 포부 폐 염 모델 하나 pathogenesis 및 이러한 치명적인 감염에 대 한 새로운 치료를 확인할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
Murine 감염 모델이 질병 병 인을 이해 하 고 원인 병원 체에 대처 하기 위해 설계 된 새로운 치료제의 효능을 테스트 합니다. 감염 성 폐 렴 환자가 병원에서 제시한 가장 흔한 감염 중 이며 따라서 적절 한 생체 내에서 모델을 보증. 일반적인 폐 렴 모델 사용 대상에서 합병증과 증상, 축 농 증, 위 염, 장 염, 물리적 외상, 또는 microparticle 모방에 어로 졸 스프레이 등을 일으키는 폐 밖에 과도 한 유기 체를 예금 intranasal 접종 바이러스 성, 결핵, 또는 곰 팡이 폐 렴의 전형적인 확산. 이러한 모델 전형적인 지역 사회 또는 의료 획득 세균성 폐 렴의 병 인을 정확 하 게 반영 하지는 않습니다. 반면, oropharyngeal 포부 폐 염의이 murine 모델 의료 획득 폐 렴의 물방울 경로 모방합니다. 박테리아의 50 µ L를 접종 마 취 쥐의 oropharynx에 정지 하면 재귀 포부를 폐 렴. 이 모델을 사용 하나는 폐 렴을 일으키는 병원 체와이 질병에 대처 하기 위해 새로운 치료법의 병 인을 확인할 수 있습니다.
서론
더 낮은 호흡 감염 세계의 치명적인 전염 성 질병 및 개발 도상국1죽음의 가장 일반적인 원인입니다. 세계적으로, 이러한 감염 3.2 백만 이상 죽음1에 대 한 계정. 또한, 병원내 폐 렴 의료 인수 감염의 가장 일반적이 고 치명적인 형태 중 이며 가장 항생제 내성 병원 체2,3에 의해 발생 합니다. 모두 지역 사회 획득 세균성 폐 렴 및 병원내 폐 렴의 수집의 일반적인 경로 폐 포에 oropharyngeal 내용의 포부입니다. 종종 이러한 질병을 연구 하는 데 사용 하는 murine 모델 사용 intranasal 접종4, 입금 대상에서 합병증과 축 농 증 및 물리적 외상, 질병과 일치 되지 않은 같은 증상을 일으키는 폐 밖에 박테리아의 많은 모델은 인간의 진행 에뮬레이션 하도록 설계 되었습니다. 다른 모델은 흡입 챔버 및 micromisting 장치, 더 정확 하 게 바이러스, 결핵, 그리고 곰 팡이 pneumonias 모방 하지만 전형적인 세균성 pneumonias 획득의 정상적인 경로 정확 하 게 정리 하지 않습니다 사용할 수 있습니다.
Murine oropharyngeal 포부 폐 염 모델 자연 경로 및 세균성 폐 렴의 병 인을 시뮬레이션 하기 위해 활용 될 수 있습니다. 접종 50 µ L를 피 펫을 사용 하 여 마 취 쥐의 oropharynx에 세균 현 탁 액의,에 의해 반사 포부 인가요, 전염 성 폐 렴에서 결과. 이 모델을 사용 하 여, 하나는 폐 렴을 일으키는 병원 체와 높은 충실도 모델, 더 유사한 포부 폐 렴 감염 인간에서 관찰 된 이러한 질병에 대처 하기 위해 새로운 치료법의 pathogenesis를 확인할 수 있습니다. 또한, 비슷한 모델을 구강5,6감염, 달리이 모델 하면 전체 inoculum 그것 오프 사이트 염증과 감염, 위 염 등을 일으킬 수 있습니다 창 자 대신 폐에 도달 하면 그리고 장 염입니다. 마지막으로, 다른 게시 된 모델 요구는 후 두 경 하 고 기도7접종, 달리이 모델 gavage 바늘으로 기도 방해 하지 않습니다 그리고 inoculum 배달에 대 한 주입을 필요로 하지 않습니다. 대신, 접종 마우스의 자연 포부 반사에 의존합니다.
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프로토콜
동물 관련 된 모든 절차는 연구원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인을 받아야 한다.
1입니다. 세균성 Inoculum의 준비
- 세균성 식민지를 격리 합니다.
- 행진 (예를 들어, A. baumannii "HUMC1") 적절 한 살 균 한 천 매체 (예를 들어, Tryptic 간장 agar)에 세균성 긴장 되 주의 고립 된 식민지를 생성 하 고.
- 적절 한 조건 (예를 들어, 37 ° C에서 하룻밤)에 품 어.
- 숙박 문화를 성장.
- 대표, 메 마른 inoculating 루프와 한 천 배지에서 고립 된 식민지를 선택 하 고 그것을 사용 하 여 적절 한 살 균 국물 매체 (예를 들어, Tryptic 간장 국물) 10 mL를 접종 하.
- 적절 한 조건 (예를 들어, 통풍 모자, 50 mL 원뿔 유리병에 하룻밤 200 rpm에서 떨고 37 ° C)에서 고정 단계에 도달 하는 샘플을 수 있습니다.
- Subculture 성장.
- 피 펫을 사용 하 여 신선한 메 마른 국물의 10 mL를 100 μ의 숙박 문화를 전송 합니다.
- 지 수/로그 단계는 적절 한 조건 (예를 들어, 통풍 모자, 50 mL 원뿔 유리병에 3 h 200 rpm에서 떨고 37 ° C)에 도달 하실 수 있습니다.
- Subculture 워시.
- Subculture incubating 환경에서 제거 합니다.
- 박테리아를 작은 5 분 4000 × g에서 원심.
- 발음 하 고는 상쾌한 삭제.
- 펠 릿을 완전히 resuspended 때까지 적극적으로 소용돌이의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 10 mL를 추가 합니다.
- 총 3 세척 단계 1.4.2-1.4.4 두 번 반복 합니다.
- 세균 현 탁 액의 농도 조정 합니다.
- 600에서 광학 밀도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm (OD600), 세균 현 탁 액의 광학 밀도 측정.
- 살 균 PBS 세균 현 탁 액에는 inoculum의 광학 밀도 0.5, OD600 에 떨어질 때까지 사용 하 여 추가는 방정식 C나× Vi = Cf× Vf, "C"는 농도, "V"는 "나" 볼륨 초기, 최종 "f"입니다. * Cf 항상 0.5; 되어야 Vf 는 변수를 해결 하기 위해입니다.
- 세균 현 탁 액 0.5 세600 떨어지면, 작은 박테리아와 0.5 세600 를 도달 하는 상쾌한의 적절 한 금액을 제거 5 분 4000 × g에서 원심.
- (예를 들어, 1 × 10-6을 달성 하기 위해 3 1: 100 희석) 살 균 PBS에 직렬 희석을 수행 및 식민지 형성 세균 농도 보여 상관 계수를 결정 하기 위해 살 균 한 천에 접시 (CFUs/mL) 당 단위 에는 OD600 0.5의.
참고:이 상관 계수 값 각 종족의 각 변형에 대 한 달라 집니다 및 감염에 대 한 inoculum 준비 전에 결정 되어야 합니다. - 상관 계수를 결정 한 후 원하는 농도 (예를 들면, 2 × 108-1 × 109 CFUs/mL);의 inoculum을 만드는 데 사용 원하는 inoculum OD600 0.5 보다 크면, 원심 작은 박테리아와 원하는 농도 도달 하는 상쾌한의 적절 한 금액을 제거 5 분 4000 × g에서 세균 현 탁 액.
- 이러한 값은 동일한 종의 세균 분리와 다른 유전 배경의 마우스 사이 달라 집니다 마우스의 각 변형에 세균 분리 각의 독성 확인 vivo에서 파일럿 연구를 수행 합니다. 다양 한 그람 음성 종족에 대 한 LD100 마우스에는 일반적으로 1-5 × 108 CFUs/마우스, 특정 긴장은 낮은 inocula에 치명적인.
- 이전에 게시8 (옵션) 필요 시, 정확한 inocula로 나중에 사용할 동일한 aliquots를 고정 합니다.
- 두 500 mL 원뿔 튜브, 및 4000 × g에서 원심 분리기는 5 분, 위에서 설명한 전송으로 세균성 inoculum 1 리터를 준비 합니다.
- 각 원뿔 유리병에서 상쾌한의 450 mL를 폐기 하 고 나머지 상쾌한에 박테리아의 펠 릿 resuspend.
- 마그네틱 볶음 bar가 포함 된 250 mL 비 커에 집중된 세균 inoculum을 전송 하 고 지속적으로 300 rpm에서 저 어 접시 위에 섞으십시오.
- 신중 하 게 집중된 세균성 inoculum (예를 들어, 1 × 1010 CFUs/mL)의 정확 하 게 600 μ 전송 포함 하는 살 균 H2O의 정확 하 게 300 μ와 300 mL 1.6 극저온 유리병에는 피 펫을 사용 하 여 살 균 글리세롤;의 μ 믹스와-80 ° c.에 게
참고: 저장을 위해 필요한 글리세롤 실험 결과 혼동 하 고 그래서 그것을 씻어 필요가 초과 사망을 일으킬 수 있습니다. - 때 사용 하기 위해 준비, 실 온에서 10 분에 대 한 샘플을 녹여.
- 1 mL 50 mL 원뿔 유리병에 전송, 작은 공의 박테리아를 5 분 동안 4000 × g에서 살 균 PBS, 그리고 원심 분리기의 9 mL를 추가 합니다. 상쾌한 발음 하 고 감염 inoculum에 대 한 원하는 농도 도달 하는 PBS의 적절 한 볼륨에서 미리 정해진된 양의 CFUs (1 mL × CFUs/mL에서 재고 농도 냉동) resuspend.
2. 마비 쥐
- 케 타 민/Xylazine
참고: 케 타 민/xylazine와 마 취 마우스 일어나 야 하기 전에 접종 절차를 완료 하려면이 기술에서 새로운 연구에 대 한 충분 한 시간을 제공 하 긴 기간, 있다.- Pharmaceutifcal 학년 PBS, 100 mg/mL 마 취 제 재고 솔루션의 1 mL의 8.5 mL를 결합 하 여 주사 솔루션의 10 mL를 준비 (최종 농도 10 mg/mL), 그리고 20 mg/mL Xylazine 재고 솔루션의 0.5 mL (최종 농도가 10 mg/mL).
- (예를 들어, 25-g 마우스에 대 한 250 μ) 복 (IP) 주입에 의해 10 μ/g를 관리 합니다.
- 그들의 눈은 마 취의 연장된 기간 동안 손상 하는 경향이 있기 때문에 케 타 민/Xylazine와 함께 취 쥐의 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
- 에 마우스를 놓고 마 취에서 깨어났을 때까지 모니터 합니다.
참고: 동물 하지 맡겨야 한다 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지.
- Isoflurane
참고: 마우스 빨리 일어나 isoflurane 유도 마 취에서 접종 절차에서 숙련 되 고 마 취의이 메서드를 사용 해야만 유도 약 실에서 제거 되 고 후.- 산소 흐르는와 적절 한 크기의 유도 실에서 순진한 마우스를 놓습니다.
- 챔버 봉인된 종료 후 anesthetize isoflurane 4% (v/v) 적어도 5 분;에 대 한 추가 정밀 기화 기를 사용 하 여 마우스 마 취 유도 실에서 마우스를 제거 하 고 마 취에서 깨어나 하는 데 걸리는 시간을 측정 하 여 확인 (~ 60 s).
참고: 기관 지침에 따라 마 취 시간이 다를 수 있습니다 및 일부 동물 되 완전히 마 취를 5 분 이상 필요할 수 있습니다 다는 것을 유의 하십시오. - 2-3%; isoflurane 농도 조정 하 여 최대 10 분 동안 마 취를 유지 마 취 총 기간은 경우 > 15 분, 마 취 쥐의 눈에 안과 연 고를 적용.
- 에 마우스를 놓고 단계 2.1에서 마 취에서 깨어났을 때까지 모니터 합니다.
3. 접종/감염 쥐
- 마 취 마우스를 일시 중단, 약 두 번 마우스의 몸 길이 (예를 들어, 20 cm) (예: 운영 표면 위에 높이에 고정 된 개체에 보안 강한, 얇은 문자열 (예:, 민트향)에 그것의 위쪽 앞 니에 의해 그것을 거 실험실 벤치).
- 살 균, 무뚝뚝한 끝난 집게를 사용 하 여 그것의 입에서 마우스의 혀는 부드럽게 당겨. 마우스의 혀의 우연한 분쇄를 방지 하기 위해 살 균, gloved 손가락을 혀를 전송 합니다. oropharynx에 액세스할 수 있도록 하 고 방지 측면 inoculum의 삼 키는 입 밖으로 혀를 잡으십시오.
- 마우스의 혀를 누른 oropharynx micropipette;를 사용 하 여 50 μ inoculum (세균성 중지) 장소 oropharynx는 구강과 인 두는 입의 뒤쪽의 교차점에 위치 해 있습니다.
참고: 그것은 매우만 micropipette에 첫 번째 정류장에 pipetting으로 액체를 제공 하는 것이 중요입니다. 마우스는 inoculum oropharynx;에 배치 되는 때 몇 초 동안 호흡을 중지 합니다. 결국, 재귀 포부 폐 렴 감염 귀착되는 폐를 입력 액체의 독특한 딱딱거리는 소음에 의해 표시 된 세균 현 탁 액을 흡입 하는 마우스를 발생할 것입니다. - 경우는 inoculum까지 배치 되지 않습니다 다시 충분히 정상적인 호흡, 입과는 inoculum의 후속 흡입을 통해 반사 포부를 집게는 네어스 꼬집어.
- 접종, 후 혀, 서 스 펜 션 문자열에서 마우스를 제거, 감 금 소에 놓고 모니터링 단계 2.1에서 마 취에서 깨어났을 때까지.
4. 질병의 진행을 모니터링
참고: 때문에 동물의 고통을, 다양 한 지표 사용 해야 쥐 죽어가는; 될 때를 나타내는 이전 승인된 IACUC 프로토콜;에 따라이 결정에 따라 안락사를 수행 한다 체온, 체중 감소, 모양, 걸음 걸이, 및 혈액 (예를 들어, iSTAT 통해)9,10,11,12,에서에서 얻을 수 있는 다른 생체를 포함 하는 moribundity의 다양 한 마커 13,14,,1516.
- 이전 승인된 IACUC 프로토콜 (예를들면, CO2 뒤에 자 궁 경부 전위)에 따라 마우스를 안락사
- 기관지, 폐 동맥 및 폐에 가까운 폐 정 맥을 절단 하 여 안락사 마우스에서 폐를 제거 합니다.
- 현미경 검사 법
- 표본 형에서 폐 (또는 부분)를 놓습니다.
- 최적의 절삭 온도 (O.C.T.) 화합물, 완전히 잠수 조직 표본 형을 채우십시오.
- -80 ° c.에 샘플을 동결
- 섹션 및 현미경 검사 법에 대 한 슬라이드에 병리학 실험실에 샘플을 보냅니다.
- 세균성 부담
- 폐 조직 분석 균형에 무게.
- 50 mL 원뿔 유리병 (조직의 크기)에 따라 살 균 PBS의 2 ~ 5 mL를 포함 하는 폐 조직 전송.
- 조직 균질 화기와 폐 조직 균질.
- 약 1000 CFUs/mL, 폐에 있는 예상된 세균성 짐에 따라 달성 하기 위해 살 균 PBS에는 homogenate의 직렬 희석을 수행 합니다.
- 예를 들어 1 × 109 CFUs/mg, 예상 하는 경우 수행 3 1: 100 희석: 9.9 ml PBS의 소용돌이; homogenate의 전송 100 μ 이것은 첫 번째 1: 100 희석 이다. 첫 번째 1: 100 희석의 100 μ 9.9 mL PBS와 소용돌이;의 전송 이것은 두 번째 1: 100 희석 이다. 두 번째 1: 100 희석의 100 μ 9.9 mL PBS와 소용돌이;의 전송 이것은 제 3의 그리고 마지막 1: 100 희석 이다.
- 폐에 있는 세균성 짐을 알 수 없는 경우 예상된 범위를 잡으려고 희석의 범위를 수행 합니다.
- 접시에 살 균 한 dilution(s)입니다.
- Agar (TSA) 격판덮개를 가진 메 마른 Tryptic 간장 국물 (TSB) 준비: 결합 TSB의 30 g, 한 천의 15 g, 물 1 L, 자력으로 혼합 하 고 5 분 쿨을 다음 압력솥에 액체 사이클 15 분을 냉각 허용에 대 한 허용에 대 한 ~ 100 ° C에서 끓는 때까지 열 ~ 55 ° C, 전송 10 mL 갓 압력가 마로 소독 멸 균 페 트리 디쉬에 TSA 실내 온도에 냉각 하 고. 2-5 d 벤치탑에 건조 또는 biosafety 캐비닛 10 분에서 발견 하자.
- 페 트리 접시 살 균 TSA를 포함 하는 희석의 100 μ를 전송 및 TSA 스프레더 또는 유리 비즈를 사용 하 여 분산.
- (즉, 물으로 가득 발견된 1 리터 비 커를 포함 하는 37 ° C 인큐베이터) 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 배양 접시를 저장
- CFUs/mL 폐 homogenate agar 도금에 따라 결정 (예를 들어, 위에서 설명한 제 3의 그리고 마지막 희석의 100 μ 가진 TSA 격판덮개에 100 CFUs 100 CFUs/100 μ × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 것 = 1 × 109 CFUs/mL).
- CFUs/mg 폐 조직 기반 CFUs/mL 폐 homogenate mg 폐 조직/mL homogenate (예를 들어, 위에서 설명한 샘플 사용 폐 조직 PBS, 다음 1 × 109 CFUs/mL ÷ 100 mg/5 mL = 5 × 107 의 5 mL에 균질의 100 밀리 그램으로 나누어 계산 CFUs/mg).
- 현미경 검사 법
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결과
프로토콜을 따르고 신중 하 게, 재현 하 고 안정적인 데이터를 쉽게 얻을 수 있습니다. 그것은 중요 한 하나의 사용자 지정된 inoculum 준비 프로토콜 하나 서로 비교 하는 실험에 대 한 엄격 하 게 준수입니다. 그것은 또한 감염 절차 동안 마우스를 제대로 처리 하는 것이 중요입니다. 없는 isoflurane 마 취 실로 쥐를 배치 해야 합니다. 마우스는 미리 채워졌다 isoflurane 챔버에 배치 됩니다 경우 당황 것입니다 그리고 아마도 실험 결과 손상 시킬 수 있는 과잉 스트레스를 발생할 수 있습니다. 컨테이너 뚜껑을 확보, 후 천천히 점진적으로 0%에서 4% (v/v), 그것의 농도 증가 하 여 isoflurane를 소개 급하게 isoflurane 관리 또한 공포에 마우스를 발생할 수 있습니다. 쥐 되 면 무 의식, 2-3% (v/v) isoflurane 농도 감소 하 고 몇 분 추가 대 한 챔버에 남아 있을 수 있도록. 이 시점에서, 쥐가 될 준비가 감염 (...
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토론
확실히, 마우스 미니어처 인간 되지 않습니다. 마우스 모델에서 얻은 결과 맥락에서 고려 하 고 이후 차이6두 종 사이의 유사성에 따라 인 간에 게 적용에 대 한 해석 해야 합니다. 그것은 또한 선택으로 적절 한 마우스 긴장 하는 것이 중요 특정 있다; 다른 사람 보다 일부 감염에 더 취약 선택16의 병원 체 변형 마찬가지 다.
엄격한 고 매우 재현 방법으로 감염을 수행 하기 위해 필수적 이다. Inocula는 하나의 값에 아직 그 값의 90%도 무해 한 쥐에 치명적 될 수 있습니다. 따라서, 그것은 절대적는 inoculum을 준비할 때에 특히 그리고 감염 하는 경우이 프로토콜에 나열 된 모든 조건 정확히 같은 방식으로 재생 된다. 또한, 각 병원 체 질병에 독특한 inoculum 일으킬 것입니다. 따라서, 그것은 각 스트레인의 병원 체와 마우스의 각 변형에 대 한 적절 한 inoculum을 결정...
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
이 작품은 알레르기의 국가 학회 및 건강의 국가 학회 [부여 번호 R01 AI117211, R01 AI130060, R21 AI127954 그리고 R42 AI106375 학사] 및 미국 식품 및 의약품 안전 청 [계약에서 전염병에 의해 지원 되었다 BML HHSF223201710199C]입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agar | BD | 214530 | TSB와 결합하여 TSA |
| 비즈, 보로실리케이트 유리 | Kimble | 135003 | 매번 사용 전에 베이킹 또는 자동클레이빙으로 살균 |
| 비커, 250 mL | Pyrex | 1003 | 집중 세균 접종의 정확한 분취 시 사용 |
| 원심분리기 | Sorvall | ST 40R 4,000 | 회 가능; 4°에 g; |
| C Chamber for Anesthesia | Kent Scientific Corporation | VetFlo-0720 | 최대 5 마리의 쥐 |
| 수용 Cryomold, 중간 크기 | Sakura Tissue-Tek | 4566 | 일회용 비닐 표본 금형, 15× 15&회; 5mm |
| 치실 | Oral-B | 37000469537 | 안정적인 포스트에 묶습니다. 약 6" 테이블 높이 |
| 위의 펜치 VWR | 82027-440 | 마우스의 입에서 혀를 부드럽게 빼내는 데 사용됩니다 | |
| Omni International | TM125-115 | 용 Homogenizer | 처음 사용하기 전에 고압클레이브를 사용합니다. 샘플 사이를 헹굽니다 |
| 마취를 위한 Isoflurane, | Abbott | 10015516 | 대체 약물을 사용할 수 있습니다. 그에 따라 절차를 수정하십시오 |
| iSTAT 카트리지 | Abbott | 03P79-25 | 귀하의 필요에 맞게 다양한 카트리지를 사용할 수 있습니다 |
| . 케타민, 100 mg/mL | Western Medical Supply | 4165 | PBS에서 1:10을 1 mg/mL로 희석하고 1 mg/mL에서 Xylazine과 결합 |
| 눈을 위한 연고 | Akorn | Tears Renewed | 디스펜서 끝으로 눈을 만지지 마십시오 |
| 최적의 절단 온도 (O.C.T.) | Compound Fisher Scientific | 23-730-571 | -80 °에서 폐 샘플을 동결하는 데 사용됩니다. C 병리학 절편 준비 |
| 페트리 접시 | VWR | 25384-302 | 폴리스티렌, 일회용, 멸균, 100회; 15mm |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Corning | 21-031-CM | 칼슘 및 마그네슘이 없는 Dulbecco의 PBS |
| 피펫 팁, 200-μ L | VWR | 10017-044 | 사용 전 오토클레이브 |
| Pipetter, 200-μ L | Gilson | Pipetman P200 | 사용 전 자동 클레이브 및 보정 |
| 스프레더, 세균 세포 | Bel-Art | F377360006 | 매번 사용 전에 베이킹 또는 자동클레이빙으로 살균 |
| Stir Bar, 자석, 7.9 mm 직경 × 38.1 mm 길이 | VWR | 58948-150 | 분할 중에 집중된 세균 접종을 젓는 데 사용됩니다 |
| Stir Plate, Magnetic | Corning | PC-620D | 분취 중 농축된 세균 접종물을 교반하는 데 사용 |
| TSB(Tryptic Soy Broth) | BD | 211822 | 한천과 결합하여 TSA |
| 바이알, 원추형, 멸균, 50mL | Corning | 431720 | 세균성 접종물 준비에 사용 |
| 바이알, 원추형, 멸균, 500mL | Corning | 431123 | 냉동 접종물 제조를 위한 접종물을 농축하는 데 사용됨 |
| 바이알, 극저온, 2.0mL | 코닝 | 430659 | 농축 세균 접종 자일라진의 극저온 저장에 사용되며 |
| , 20 mg/mL | Akorn | AnaSed 주입은 | PBS에서 1:20을 1 mg/mL로 희석하고 1 mg/mL에서 케타민과 결합합니다 |
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